Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Protokol, VAR2CSA'ya özgü doğal olarak edinilmiş IgG antikorları tarafından opsonize edilen Plasmodium falciparumenfekte eritrositlerin (IEs) akış sitometri tabanlı fagositoz testinin nasıl kurulup çalıştırılabildiğini açıklamaktadır. VAR2CSA, plasentadaki IE'lerin seçici sekansasyonuna aracılık eden ve plasental sıtma (PM) adı verilen hamile kadınlarda ciddi bir sıtma formuna neden olabilecek parazit antijenidir. PM'den korunma, plasental sekestrasyonu inhibe ederek ve/veya fagositoz için IE'leri opsonize ederek çalıştığına inanılan VAR2CSA spesifik antikorlar aracılık eder. Taht, VAR2CSA'yı ifade etmek için in vitro olarak seçilen geç evre senkronize IE'ler, doğal olarak edinilmiş PM spesifik bağışıklığı olan kadınlardan plazma/serum-antikorları ve fagositik hücre hattı THP-1'i kullanır. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir. Titre, sıtmada antikor aracılı bağışıklığın önemli bir fonksiyonel yönünüiyi tekrarlanabilirlik ile basit ve yüksek iş letimatisi değerlendirme sunar. Bu nedenle, özellikle Sahra-altı Afrika'da, tropik bölgelerde morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olan P. falciparum sıtmasına karşı klinik bağışıklığı değerlendirirken yararlıdır.
Giriş
Sıtma, Plasmodiumcinsinin beş farklı türüyle enfeksiyon anına bağlı olarak insanlarda meydana gelen vektör kaynaklı bir hastalıktır. En yaygın türler P. falciparum, aynı zamanda en morbidite ve mortalite sorumludur1. Sıtma klinik sunumu asemptomatik veya benign enfeksiyonlardan komplike/ağır hastalıklara kadar değişmekteolup, ikincisi çoğunlukla beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. P. falciparum maruz steril bağışıklık neden olmaz, ancak endemik bölgelerde yaşayan bireyler yavaş yavaş klinik hastalığa karşı bağışıklık geliştirmek. Koruma yaşa/maruziyete bağlıdır ve bağışıklık normalde yaşamın ilk 5-10 döneminde eld....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada sunulan sonuçlar için kullanılan insan serumu örnekleri ayrı bir çalışmada toplanmıştır19. Koleksiyon, Gana Üniversitesi Noguchi Memorial Institute for Medical Research Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma 038/10-11) ve Danimarka'nın Başkenti Bölgesel Araştırma Etik Komiteleri (H-4-2013-083 protokolü) tarafından onaylanmıştır.
1. Parazit kültürü
NOT: İnsan patojenlerinin kullanımı yla ilgili yerel yönetmeliklere uyun.
- P. falciparum parazitlerini20'den önce açıklanan standart protokole göre parazit kültür ortamında muhafaza edin (bkz. M....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada ayrıntılı olarak31 tarif edilmiş ve kullanılan bir protokol sunmak11,12,13,14,15,16,17,18 THP-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagosityolis indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan protokol daha önce tanımlanmış ve thp-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagositoz indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için12,15,17,31 kullanılmıştır. Burada sunulan sonuçlar, P. falciparum endemik bölgede yaşayan kadınların plazma/serumunda doğal olarak edinilmiş VAR2CSA spesifik antikorlara odaklanabedilir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Maiken Visti mükemmel teknik yardım için teşekkür edilir. Bu çalışma kısmen Danimarka Dışişleri Bakanlığı'ndan bir hibe (MAVARECA II; 17-02-KU) tarafından finanse edilmiş ve Danida Burs Merkezi tarafından yönetilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 kuyulu hücre kültürü plakaları, kapaklı yuvarlak alt | Corning | 3799 | Benzer herhangi bir plaka kullanılabilir, kullanmayı düşündüğünüz akış sitometresi cihazıyla uyumlu olduğundan emin olun |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (% 5) | - | % | 5 AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2 g / L hipoksantin (Sigma, H9377) RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Kırmızı Kan Hücreleri antikor | Abcam | ab34858 | 2μ hazırlayın; l alikotlar ve -20 derece / C dondurun Deney başına bir alikot kullanın. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Etidyum bromür çözeltisi | Sigma | E1510 | RPMI1640 (R5886) içinde 0.1 mg / mL'de bir stok çözeltisi hazırlayın. Işıktan korunan mağaza |
| FC500 akış sitometresi | Beckman Coulter | 96 kuyulu plaka formatını destekleyen ve EtBr floresansını ölçmek için uygun lazerlere/filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir. | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco | 10099-141 | Kullanmadan önce ısıtı etkisiz hale getirin. |
| FITC fare anti-insan CD16 | BD Biosciences | 555406 veya 556618 | |
| FITC fare anti-insan CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC fare anti-insan CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic yazılımı | Inivai teknolojileri | Herhangi bir akış sitometrisi analizi kullanılabilir, örneğin FlowJo veya Winlist | |
| Gentamisin (10mg / mL) | Sigma | G1272 | |
| Hipoksantin | Sigma | H9377 | |
| L-glutamin (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lizasyon çözeltisi | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA | |
| MACS CS-sütunu ve aksesuarları | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parazit kültürü ortamı | - | - | 2mM L-glutamin (Sigma, G7513), 50 & mikro; g / mL Gentamisin (Sigma, G1272)% 0.5 AlbuMAX-II (AlbuMAX-II% 5) RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penisilin / Streptomisin (10000U ve 10mg / mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 ortamı | Sigma | R5886 | |
| THP-1 kültür ortamı | - | % | 10 FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamin (Sigma, G7513), 100U / mL Penisilin, 0.1mg / mL Streptomisin (Sigma, P0781) RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS mıknatıs | Miltenyi Biotec |
Kaynaklar
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
