Yöntem makalesi

Bir Murine Modelinde İskemi Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Kök Hücrelerin Gecikmiş İntramiyokardiyal Teslimi

4.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61546

⸱

3 Eylül 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Kök hücreler sürekli miyokardiyal hasarı olan bireyler için potansiyel tedaviler olarak araştırılır, ancak, onların azaltılmış canlılık ve yaralı doku içinde tutma onların uzun vadeli etkinliğini etkileyebilir. Bu yazıda iskemi reperfüzyon yaralanması nın bir murine modelinde kök hücre dağıtımı için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Miyokardiyal yaralanmaları olan bireylerde kardiyak fonksiyonun iyileşmesi için kök hücre (SC) kullanımına büyük ilgi vardır. En sık, kardiyak kök hücre tedavisi miyokardiyal yaralanma indüksiyonu ile eşzamanlı Olarak SCs teslim ederek çalışılır. Ancak, bu yaklaşım iki önemli sınırlamalar sunar: erken düşmanca pro-inflamatuar iskemik ortam nakledilen SCs sağkalım etkileyebilir, ve SCs büyük olasılıkla kullanılacak subakut enfarktüs senaryo temsil etmez. Burada iskemi-reperfüzyon yaralanması indüksiyonu ve mezenkimal kök hücre (MsC) teslimi için iki bölümlü bir dizi cerrahi işlem denilmektedir. Kök hücre yönetimi bu yöntem ilk bağışıklık yanıtı atlatarak hasarlı doku etrafında daha uzun canlılık ve tutma için izin verebilir. İskemi reperfüzyon yaralanması bir model farelerde mezenkimal kök hücrelerin teslimi ile birlikte indüklenen oldu (3.0 x 105),ststitutively ifade CMV organizatörü altında muhabir gen firefly luciferase ifade, intramiyokardial 7 gün sonra. Hayvanlar sırasıyla yaralanma ve hücre enjeksiyonu onayı için ultrason ve biyolüminesans görüntüleme ile görüntülendi. Daha da önemlisi, SC doğumu için bu iki işlem yaklaşımını gerçekleştirirken ek komplikasyon oranı yoktu. Kök hücre yönetimi bu yöntem, topluca state-of-the-art muhabir genlerin kullanımı ile, canlılık ve kronik iskemi bir durumda nakledilen SCs tutulması in vivo çalışma için izin verebilir klinik olarak görülen, aynı zamanda ilk pro-inflamatuar yanıtı atlatmak. Özetle, kök hücrelerin miyokardyuma gecikmeli olarak ulaştırılması için bir protokol oluşturduk, bu da hasarlı dokunun yenilenmesini teşvik etmede potansiyel yeni bir yaklaşım olarak kullanılabilir.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında en sık morbidite ve mortalite nedeni olmaya devam etmektedir. Kardiyak iskemik olayların miyokardiyum un ve çevresindeki hücrelerin genel işlevine zararlı olduğu bulunmuştur1. Kardiyomiyositlerin sadece %00.45-1.0'̴ miyokardiyal hasar oluştuktan sonra her yıl yenilenecektir2. Artan talep ve tedaviler geliştirmeye doğal odak rağmen, yaralı doku rejenerasyonyardımcı tedaviler kurmak zor olmuştur ve hala daha fazla optimizasyon gerektirir3,4,5. Kök hücre tedavileri iskemik bir olaydan sonra hasarlı dokuyu gençleştirmek için alternatif bir yol olarak sunulmuştur; ancak, bu tedavilerin ilerlemesi sınırlı sağkalım ve yaralı bir alana hücrelerin tutulması ile meydan olmuştur6.

Bir iskemik olay dan sonra kalbin mikroçevre hipoksik olarak karakterize edilebilir, pro-oksidan, ve pro-inflamatuar, terapötik kök hücrelerin hayatta kalmak için adapte için düşmanca koşullar sunan7,8. Bir bağışıklık yanıtı yaralanma sonrasında tetiklenir gibi, naif lenfositler, makrofajlar, nötrofiller ve mast hücreleri ölen hücreleri kaldırarak hasarı onarmak için girişimi ve doku remodeling için süreci modüle9,10,11. İlk 3 gün post-iskemi içinde, inflamasyon bölgede nötrofil ve monositler yüksek sayıda pro-inflamatuar sitokinlerin salınımı ile zirvede10,12. 7 gün sonra, çok iltihap yatışmış ve reparative hücrelere geçiş başlar, remodeling kaskad tamamlanana kadar devam, farelerde yaklaşık 14 gün13. Cerrahi yöntemimiz, iskemi reperfüzyon uyrması sonrası en yüksek doğuştan gelen immün yanıtı atlamak için miyokardiyuma biyolojik lerin girişine alternatif bir yaklaşımdır. Aynı zamanda, akut miyokard infarktüsile karşılaştırıldığında göz önünde bulundurulması gereken farklı değişkenler olabileceği subakut/kronik iskemi durumunda ki tedavilerin incelenmesine olanak sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler dişi C57BL/6 fareler, yaş 10-12 hafta ve 20-25 g vücut ağırlığı üzerinde yapıldı. Tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda (Laboratuvar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Bilimler Akademisi, Bethesda, MD, ABD) belirtilen standartlara uygun ve Mayo Clinic College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hazırlık ve entübasyon

  1. Ameliyat tan önce tüm cerrahi aletleri otoklav. Birden fazla ameliyat tek seansta yapılacaksa, her hayvandan sonra aletleri temizleyin ve sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak yeniden sterilize edin.
  2. Bir indüksiyon odasında 1 L/dk O2 de% 3.5-4 isofluran ile fareler anestezi.
  3. Buprenorfin SR 1 mg/kg (analjezik) subkutan olarak uygulayın, hayvanı tartın ve ağırlığı ventilatöre tadına koyun.
  4. Göğüs kafesinin sol tarafını omuz seviyesine kadar tıraş edin ve fazla kürkü çıkarmak için tüy dökücü krem uygulayın.
  5. Iskemi reperfüzyon prosedürü için 2 cmH2O'da ventilatörüzerindeki pozitif son ekspiratuar basıncı (PEEP) koruyun. Hücrelerin gecikmiş enjeksiyon prosedürü için akciğer çökmesini önlemek için 3 cmH2O PEEP değiştirin.
  6. Hayvanı 20 G endotrakeal tüp kullanarak entübasyon yapın, vücut Sıcaklığını 35-37 °C'de tutmak için kontrollü bir ısıtma yastığına aktarın.
  7. Fareyi sol tarafta kranial ucu ve sağda kaudal uç ile lateral recumbency bir ventilatör üzerine yerleştirin.
  8. İşlemin geri kalanı için anesteziyi 1 L/dk O2'de %2-2,5 oranında devam ettirin.
  9. Povidon-iyot ve alkol bezleri arasında değişen cerrahi bölgeyi üç kez temizleyin ve her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.

2. İskemi reperfüzyon yaralanması

  1. #10 bir bıçak neşteri kullanarak görüş alanında sol daki meme ucunun 2,5 mm'si kadar dikey bir kesi yapın.
  2. Interkostal kaslar ve kaburgalar görünür olana kadar yüzeysel kas katmanları ile kesip makas kullanarak.
  3. Kaburga ve çevresindeki doku kaldırırken, 4 ve 5 kaburga arasındaki interkostal boşluk üzerinden kesilmiş, sonra açık alana göz kapağı retraktör eklemek.
  4. Kavisli forceps kullanarak perikard geri çekin, yukarı ve görüş dışında akciğer hareket.
  5. LAD arter görselleştirin ve, 9-0 naylon sütür kullanarak, arter altında miyokardiyum geçmek 2.5 sol auricle mm distal ve gevşek bir kare düğüm kravat.
  6. 1 cm polietilen boru kesin ve gevşek düğüm içine yerleştirin.
  7. Tüpün etrafındaki sütürü sabitle, iskemiyi onayla, 35 dk sonra serbest bırak.
    NOT: Pallor ve ventriküler aritmi ile iskemi doğrulayın.
  8. Ligasyon serbest ve tüp çıkardıktan sonra, miyokardinre reperfüzyon onaylamak için 5 dakika bekleyin.
  9. 24 G I.V. kateter tüpünü açılışın sağındaki torasik kaviteye yerleştirin.
  10. Basit bir kesik desen 6-0 emilebilir dikiş ile interkostal kesi kapatın.
  11. Sürekli dikiş deseni 6-0 emilebilir dikiş ile kas tabakasıkapatın.
  12. Yüzeysel kas tabakasını kapattıktan sonra, göğüs tüpünü çıkarırken göğüs tüpünü 1 mL tüberkülin şırınga kullanarak göğüs boşluğundan çekin.
  13. Sürekli yatay yatak deseni içinde 6-0 emilebilir dikiş ile cilt kesisini kapatın
    NOT: Cilt tabakası için naylon dikişler ve kesintisiz dikiş deseni de kullanılabilir.
  14. 1,5 mL ılık tuzlu su altı uygulayın ve enfeksiyonu önlemek için kesi bölgesine üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
  15. Isofluran'ı kapatın ve hayvanın yardım almadan sürekli nefes alana kadar %100 O2 ile ventilatörden nefes almasına izin verin.
  16. Fareyi 35-37 °C sıcaklıkta, tamamen iyileşene kadar yataksız bir kafese veya kapalı yatak takımları (kağıt havlu veya perde) ile bir kafese aktarın.

3. Fare mezenkimal kök hücre teslimi

NOT: İşlem için kullanılan farelerin suşları inbred bir çizgidir ve genetik olarak aynı kabul edilir. Mezenkimal kök hücreler aynı türdeki hayvanlardan elde edildi ve protokol tasarımı ile1immünsupresyon 1.000'e indüklenmedi.

  1. İlk işlem için daha önce yapılan hazırlık ve entübasyon adımlarını tamamlayın.
  2. Makas ve forceps kullanarak deri tabakasından dikiş çıkarın.
  3. #10 neşter ile, önceki ameliyat la aynı yerde bir kesi yapmak.
  4. Kas tabakası sütür görünür olana kadar skar dokusu nu kesmek için neşter kullanmaya devam edin
  5. Makas ve forceps kullanarak dikiş kaldırmak ve açık kas tabakası kesti.
  6. Kaburgaları bir arada tutan dikişleri görselleştirin ve çıkarın ve bir önceki kesiden interkostal kası kesmeye devam edin.
    NOT: Akciğerler göğüs duvarına yapışmış olabilir, bu durumda, künt veya kavisli forceps dikkatle ayırmak ve onları serbest bırakmak için kullanın.
  7. Göz kapağı retraktörü interkostal alana yerleştirin ve önceki ligasyon alanını bulun.
  8. Mezenkimal kök hücreleri (3.0 x 105),20 μL PBS'de asılı, 30 G insülin şırıngasına yükleyin, iğneyi enjekte etmek için uygun açı için gerektiği gibi hafifçe bükün.
    NOT: Mezenkimal kök hücreler (MSCs) 4-6 haftalık C56BL/6 farelerin yağ dokusundan izole edildi. Erken geçiş hücreleri (p3) in vivo hücre canlılık izleme sağlamak için CMV organizatörü altında firefly luciferase genifade eden bir vektör ile transek. Yağ türetilmiş fare MSC akış sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri ile karakterize edildi ve hücreler CD44, CD29, CD90 ve CD105 için pozitif ama hematopoetik marker CD4514için negatif . Enjeksiyondan önce, MsC'ler erime sürecinden hücre kaybını önlemek için en az bir geçit için kültüre alındı.
  9. İğne açma tamamen miyokardium içinde olana kadar kalbin tabanına doğru apeksten doğru hareket eden şırınga peri-infarkt bölgesine yerleştirin.
  10. İçeri girdikten sonra hücreleri yavaşça miyokardyuma enjekte edin, 3'leri bekleyin, sonra iğneyi çıkarın.
  11. Ventriküler fibrilasyon gibi hücrelere anormal reaksiyonlar olmadığından emin olmak için 3 dakika boyunca kalbi yakından gözlemleyin.
  12. 24 G IV kateter tüpünü göğüs boşluğuna, açıklığın sağına bir interkostal boşluk yerleştirin.
  13. Interkostal, kas ve deri tabakalarını kapatın ve göğüs tüpünü ilk işlemle aynı yöntemle çıkarın.
  14. 1,5 mL ılık tuzlu su altı uygulayın ve enfeksiyonu önlemek için kesi bölgesine üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
  15. Isofluran'ı kapatın ve hayvanın yardım almadan sürekli nefes alana kadar %100 O2 ile ventilatörden nefes almasına izin verin.
  16. Fareyi 35-37 °C sıcaklıkta, tamamen iyileşene kadar yataksız bir kafese veya kapalı yatak takımları (kağıt havlu veya perde) ile bir kafese aktarın.

4. Her iki prosedürü takip eden ameliyat sonrası bakım

  1. Spontan solunum, sternal recumbency ve normal hareket kurulana kadar sürekli hayvan gözlemleyin.
  2. Ameliyat günü en az 3 saat boyunca her 15-30 dakikada bir gözleme devam edin.
  3. 5 gün boyunca günde bir kez yara dehiscence veya anormal ağrı için fareler kontrol edin, sonra 2-3 kez haftalık.
  4. Hayvan ağrı belirtileri gösterirse (yani kemerli sırt, minimal hareket, grimacing, veya scruffy kürk) sonra 72 saat post-op, Buprenorfin SR analjezik ek bir doz sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İskemi reperfüzyon yaralanması farelerde 0. Ultrason ve elektrokardiyogram analizi enfarktüs ve azalmış ventriküler kontraktil fonksiyonu doğruladı (Şekil 1A-D). Verilerin ileri incelenmesinde iskemik yaralanma alan farelerde ejeksiyon fraksiyonu ve fraksiyonel kısalma azalırken, son diyastolik ve sistolik hacimler artmıştır(Tablo 1). Normal bir fare kalbi ile karşılaştırıldığında(Şekil 2A),Masson Trikrom boyanması miyokard doku...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Dünya çapında 85 milyondan fazla insan kardiyovasküler hastalık3etkilenir. Bu iskemik olayların yüksek yaygınlığı, hasarlı dokunun yenilenmesini teşvik etmek için alternatif tedavilerin daha da geliştirilmesini ve genişletilmesini gerektirmektedir. Geleneksel yöntemler terapötik sonraki uygulama ile akut bir ortamda iskemi reperfüzyon prosedürü kullanmak1. İnflamatuar reaksiyonlar 3-4 gün arasında zirvede olan bir kardiyak iskemik olay postdating, nötrofillerin infiltrasyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.9 NaCl Sulama, USPBaxter0338-0048-04
11x12 "Press n' Seal cerrahi örtü, otoklavlanabilirSAI İnfüzyon TeknolojileriPSS-SD
24G 3/4" IV kateter tüpüJelco4053
28G x 1/2" 1mL alerji şırıngasıBD305500Analjezik enjeksiyonu
30G x 1/2 "3 / 10cc insülin şırıngasıUlticare08222.0933.56Kök hücrelerin enjeksiyonu
6-0 S-29, 12 "Vicryl sütürEthiconJ556Gİnterkostal, yüzeysel kas ve cilt tabakası insizyon kapatma
9-0 BV100-4, 5" Ethilon sütürEthicon2829GLAD arterin ligasyonu
Emici alt pedThermo Fischer Scientific14-206-64Hayvanın
altı içinAlkol hazırlama pedleri, 2 katlı, ortaCoviden6818
Buğu önleyici yüz maskesiHalyard49235
Bonn Şaşılık makası, kavisli, küntGüzel Bilim Araçları14085-09
Buprenorfin HCL SR LAB 1mg/ml, 5 mlZooPharm EczanesiEmilimi yavaşlatan ve etki süresini uzatan bir polimerde formüle edilmiş buprenorfin narkotik analjezik (72 saat etkinlik).
Castroviejo iğne tutucular, kavisliGüzel Bilim Araçları12061-01
Curity steril gazlı bez süngerlerCoviden397310
Hassas sütür bağlama forsepsleri, 45 açılı bükülmüşGüzel Bilim Araçları11063-07
Elektrikli Tıraş BıçağıWahlKürk çıkarma
İzofluran 100 mlKardinal SağlıkPI23238Anestezik
Laboratuvar önlüğü
Monoject 1 mL hipodermik şırıngaCoviden8881501400
Moria iris forseps, kavisli, tırtıklı (x2)Fine Science Tools11370-31
Moria spekulum ekartörüGüzel Bilim Araçları17370-53
Fare endotrakeal entübasyon kitiKent Scientific
Nair tüy dökücü kremJohnson & JohnsonKürk temizleme
Optixcare göz yağlama plusAventixSteril oküler kayganlaştırıcı
Physiosuite ventilatörKent Scientific
PolyE Polietilen boruHarvard Aparatı72-0191swablarının geçici olarak sıkıştırılması
PDIS41125
Neşter, 10 bıçaklıBard-Parker371610
Steril 3" pamuk uçlu aplikatörlerCardinal HealthC15055-003
Steril 6" konik pamuk uçlu aplikatörlerPuritan25-826-5WC
Steril eldivenlerCardinal HealthN8830
Sterilizasyon torbalarıMedlineMPP100525GS
Cerrahi başlık
Cerrahi MikroskopLeicaM125
Sütür bağlama forsepsleri, düz (x2)Güzel Bilim Araçları10825-10
Transpore cerrahi bant3M1527-1
Üçlü antibiyotik merhemG& W Laboratories11-2683ILNC2Enfeksiyonu önlemek için topikal uygulama
Vannas-Tü bingen Bahar Makas, kavisliGüzel Bilim Araçları15004-08
Vetflo buharlaştırıcıKent Scientific
LAD arter Povidon-iyot

Kaynaklar

  1. Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
  2. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  3. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38(2016).
  4. Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
  6. Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
  7. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
  8. Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gecikmi K k H cre UygulamasMezenkimal K k H crelerntramiyokardiyal EnjeksiyonBiyol minesans G r nt lemeCerrahi ProtokolKardiyak Fonksiyon zlemeH cre Canl l De erlendirmesiYaralanma Sonras Tedavi

İlgili makaleler