Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.
Yöntem makalesi
Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.
Doku da yerleşik bellek T hücresi (TRM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole TRMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8+ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda TRMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8+ T hücrelerini izole etmek için TRModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8+ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.
Doku da yerleşik bellek (TRM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. TRM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, TRM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları6,7,8ile farklı yü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokole göre yapılan tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler IACUC UT Health San Antonio tarafından onaylanmıştır.
1. P14 T hücrelerinin C57BL/6 alıcılarına ve LCMV enfeksiyonuna benimsendirici transferi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1A). 30. gün sonrası LCMV enfeksiyonunda CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketlemesini yaptık. 5 dakika sonra, hayvanın her iki böbrek leri kesildi, kıyıldı ve kollajenaz sindirime tabi tutuldu. Lenfositler Percoll santrifüj yoluyla sindirilmiş örneklerden daha fazla saflaştırılmış ve akış sitometri sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1B'degösterildiği gibi , yoğunluk santrifüj.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol büyük ölçüde TRM
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.
Bu çalışma NIH hibe AI125701 ve AI139721, Kanser Araştırma Enstitüsü CLIP programı ve Amerikan Kanser Derneği hibe RSG-18-222-01-LIB n.z tarafından desteklenir. Flow Sitometri Tesisi'nden Karla Gorena ve Sebastian Montagnino'ya teşekkür ederiz. Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'nde oluşturulan veriler San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSCSA), NIH/NCI hibe P30 CA054174-20 (UTHSCSA'daki Klinik ve Çeviriaraştırma Merkezi [CTRC] ve UL1 TR001120 (Klinik ve ÇeviriBilim Ödülü) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Konik Tüpler | Corning | 431470 | |
| 3 ml şırınga | BD | 309657 | |
| 37C inkübatör | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antikoru (Klon 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Buzağı Serumu | GE Healthcare Life Fen Bilimleri | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| İnsülin Şırınga | BD | 329424 | |
| Mikro Diseksiyon Yaylı Makas | Roboz Cerrahi | RS 5692 | |
| Mojosort Fare CD8 Naï ve T Hücreleri İzolasyon Kiti | Biolegend | 480043 | |
| üstten ısı lambası | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | SH30096.01 | |
| Katı Pirinç Fare Kısıtlayıcı | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Salıncak Kovası Buzdolabı ile | Santrifüj Thermofisher | ||
| Doku Kültürü 6 oyuklu plaka | Corning | 3516 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste