Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Uygun koroner basınç akışı düzenlemesi, kalbin metabolik taleplerini karşılamak için yeterli kan akışını sağlar¹. Bununla birlikte, son on yıldır in vivo ve in vitro olarak yapılan kapsamlı çalışmalara rağmen, koroner basınç akışının kalpte nasıl dinamik olarak düzenlendiği daha yeni ortaya çıktı. Bunun nedenlerinden biri, kalbin sürekli atması nedeniyle bu tür çalışmalar için fizyolojik bir çalışma modeli oluşturmanın zorluğudur. Ne olursa olsun, koroner mikro damarların canlı dokularda veya hayvanlarda gözlemlenmesi için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur, ancak bu yöntemlerin hiçbiri sabit / kararlı odak ve basınç, akış ve mikrovasküler çap ölçümlerini aynı anda elde edemedi^2,3. Atan kalpte koroner arteriyel mikro damarların doğrudan görselleştirilmesi on yıllar önce tanıtıldı^4,3, ancak küçük damarlardaki çap ölçümleri zorluydu ve mikrosirkülasyonla ilişkili birçok özel hücre tipinin spesifik işlevleri eşit derecede can sıkıcıydı. Stroboscopic yöntem ve yüzen nesnel sistem bile yukarıdaki bilgileri aynı anda sağlayamadı⁵. Bununla birlikte, koroner kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olan yukarıda belirtilen teknolojiler kullanılarak önemli miktarda değerli bilgi elde edilmiştir⁶. Bu makalede anlattığımız yöntem, koroner arterlerin, arterioles ve mikrovasküler arter bileşenlerinin stimülasyonlara ve metabolik taleplere nasıl farklı yanıt verdiğini ayrıntılı olarak araştırmamıza ve anlamamıza yardımcı olacaktır.

Bu çalışmaları sürdürmek için kurduğumuz çalışma modeli Westerhof ve ark.^2'ninönceki çalışmaları üzerine inşa edildi. Fare kalbinin septal arterinin kanülasyonunu takiben, kalp dokusunun miyositlerini ve diğer bileşenlerini besleyen arteri boğmak için fizyolojik salin çözeltisi kullanıldı. Arteriyel perfüzyon basıncı, akış ve damar çapı diğer fizyolojik fonksiyonlar arasında uygun floresan göstergeler kullanılarak izlendi. Bu yöntem, canlı dokuda fizyolojik basınç altında koroner mikrovasküler yatağı görselleştirmemizi ve mikro sirkülasyon regülasyonunun altında yatan hücresel mekanizmaları ilk kez incelememizi sağlar.

Tüm hayvan bakımı Maryland Baltimore Üniversitesi'nin yönergelerine ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokollere uygundu.

1. Çözümlerin hazırlanması

NOT: Çözümleri önceden hazırlayın. Deneylerde iki tür temel çözüm kullanılmaktadır: (1) banyo superfusate için fizyolojik tuzlu su çözeltileri (PSS) ve (2) Lümen perfüzyonu için Tirot çözeltileri. PSS'nin pH'ını korumak için CO₂ ile sürekli kabarcıklanma gereklidir. HEPES tamponlu Tyrode'un çözeltisi, kabarcıkların damarlara girmesini önlemek için PSS yerine lümende kullanılır, çünkü kabarcıklar endotel^{hücrelerine 7} zarar verir ve akışı tıkar.

1. PSS çözümü: Tablo 1'de PSS çözümünün formülüne ve bileşimine bakın. 10 L Ca²⁺içermeyen ve glikozsuz PSS stok çözeltisi yapın ve oda sıcaklığında saklayın. Herhangi bir işlemden önce 1 saat, çözeltinin pH'ını ~7.4'te tutmak için% 5 CO₂ (% 74_{N 2} ve%_{21 O 2)}ile stok çözeltisinden 1 L ve kabarcık alın. 1.8 g glikoz ve 1.8 mL CaCl₂ (1 M stok)⁸ekleyin.
   NOT: Ca^2+'yı yalnızca pH ~7.4 olduğunda köpürdükten sonra ekleyin, aksi takdirde Ca²⁺ çöker.
2. Tyrode'un çözümü: Tablo 1'deTyrode'un çözümünün formülünü ve bileşimini görün. Çözeltiyi filtreleyin (0,22 μm) ve ileride kullanım için 4 °C'de saklanır⁹.
3. Tyrode'un BDM ile çözümü (2,3-Butanedione monoksim): Miyositlerin kasılmasını önlemek için ters çevrilebilir bir miyofilament inhibitörü olarak BDM ekleyin¹⁰. 600 mg BDM ağırlığında ve 200 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. Çözeltiyi tamamen çözünene kadar BDM ile karıştırın. Daha fazla filtrasyona gerek yoktur.
4. Tyrode'un BDM içeren çözümünü ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.

2. Oda hazırlığı

1. Üretici tarafından sağlanan talimatları izleyerek hem diseksiyon odasını hem de deneysel odayı polidimetilsiloksisan (PDMS) ile önceden kaplayın.
2. Diseksiyon odasını Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doldurun.
3. İşlemden önce soğutucuyu 1 saat açın. Sıcaklığı 4 °C olarak ayarlayın.

3.Ül hazırlığı

1. Mikropipette puller'ı açın. Üreticinin yönergelerine göre ayarları seçin.
2. Temiz bir borosilikat cam tüp alın (kullanılan cam tüplerin dış ve iç çapı sırasıyla 1,2 mm ve 0,69 mm idi).
3. U şeklinde platin ısıtma filamentli bir Sutter pipet çekme makinesinin yivli kelepçelerine bir cam tüp yerleştirin.
4. Her biri uzun ince uçlu iki kanonül üretmek için çekmeciyi etkinleştirin.
5. Ucun son çapını 100 ila 150 μm civarında yapmak için her bir canülün ucunu bir kesme mikroskobu altında ince bir makas kullanarak kesin.
6. Ateş, keskin kenarları hafifçe yuvarlamak için kesilmiş canülun ucunu parlatır.
7. Kanülleri, şaftın kenarına uçtan yaklaşık 2 mm uzaklıkta yerleştirilmiş platin bir tel (ince kontrolle ısıtılmış) kullanarak şaft boyunca bükün. Bükümdeki virajın açısı 45 ° civarında olmalıdır.
8. Kanolün açık ucını basınçlı miyograf odasının tutucusuna yerleştirin ve bağlantı elemanını sıkın. Tyrode'un çözeltisi ile dolu 5 mL'lik bir şırınnayı bağlantı parçasının diğer tarafına bağlayın. Canülleri odaya monte edilmiş bir mikromanipülatöre bağlayın (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2).
9. Şırınd (5 mL), yıkama, boru ve hava kabarcıklarının konektörünü kullanarak kanolü Tyrode'un çözeltisiyle doldurun.
10. Kanülasyon işleminden önce, kanül içindeki perfüzyon basıncını belirli bir akış aralığında ölçün (50 ila 300 μL/dk, Şekil 3). Bunu yalnızca yeni bir cannula kullanıldığında yapın.
    NOT: Kanül içindeki perfüzyon basıncı akışla orantılıdır ve doğrusal olarak monte edilmiştir (Şekil 3).

4. Fare kalbinin çıkarılması

1. Izofluran ve oksijen tanklarına bağlı anestezi kutusuna bir C57BL/6 fare (seks, 8-16 haftalık) koyun.
2. Oksijen tankını açın ve izofluran akışını başlatın. Fare tamamen uyuşturulup uyuşturuluna kadar ~5 dakika bekleyin.
3. Anestezi kurulduktan sonra, fareyi anestezi kutusundan alın ve vaskültürde kan pıhtısı oluşumunu önlemek için heparin IP'yi (periton boşluğuna, 360 ünite, 0,5 mL / fare) enjekte edin. Sonra fareyi anestezi kutusuna geri koyun.
4. Heparin enjekte edildikten 10 dakika sonra, fareyi supine pozisyonunda ısıtılmış yatağa hareket ettirin ve etiketleme bandı kullanarak pençelerini stabilize edin. Fareyi burun konisi kullanarak izofluran ile tam anestezi altında tutun.
5. Farenin karın derisini önps ile diyaframın üzerine kaldırın ve diyaframı kesmek ve açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın.
6. Diyaframı ve göğüs kemiğini kesin. Göğsünü aç.
7. Kalbi torasik boşluktan parçalara ayrıştırarak sırt torasik duvarına mümkün olduğunca yakın keser.
8. Kalbi buz gibi Tyrode'un 30 mM BDM içeren çözeltisine yerleştirin.
9. Akciğer gibi bağ dokularını çıkarmak için kalbi temizleyin.
10. Kalbi, 30 mM BDM içeren Tyrode çözeltisi ile dolu önceden soğutulmuş diseksiyon odasına aktarın.

5. Septal arterin hazırlanması ve kanülasyonu

1. Servo pompayı aç. Servo pompayı "akış" moduna ayarlayın. Boru, vasküler lümeni boğmak için kullanılacak Tyrode çözeltisi ile doldurulana kadar yüksek hızda çalışmasına izin verin. Tüpte kabarcık olmadığından emin olun. O zaman hızı düşür.
2. Kalbi PDMS'ye sabitleyerek kalbin orta bölgesinde herhangi bir hasar olmasını önler.
3. Hem sağ hem de sol atriayı çıkarın. Sağ ventrikülü kesin ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sağ ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.
4. Septal arteri açığa çıkar ve tanımla. Septal arterin altına bir naylon iplik (30 μm çapında) yerleştirin ve ileride kullanmak için gevşek bir düğüm bağlayın.
   NOT: Septal arter, diseksiyon mikroskobu kullanılarak kolayca tanımlanabilir. Septal arter, çoğu durumda sağ koroner arterden kaynaklanan septum üzerindeki ana arterdir.
5. İnce makas kullanarak sol ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.
6. Papiller kas preparatını, canüllerin yer aldığı deneysel odaya aktarın. Oda, Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doludur. Bu odanın tabanı ince (~2 mm) pdms tabakası ile kaplanmıştır.
7. Septal arterin kanülasyonunu etkinleştirmek için kanüllerin konumunu (mikromanipülatör kullanarak) ayarlayın. Düğümü sıkın.
8. Papiller kası oda zeminine küçük pimler kullanarak sabitleyin, böylece mikroskop hedefi vaskülatın net bir görünümüne sahiptir. Kanül açısına ve konumuna dikkat edin ve kanül ucunun arteriyel duvara paralel olduğundan emin olun.
9. Çözeltiyi şırındiden kanülden kademeli olarak dışarı atarak kanülasyonu test edin. Tüm elementler düzgün çalışırsa, papiller kastaki artık kan bu sürecin başında dokudan çıkar ve daha sonra sadece Tirode'un çözeltisi görülür.

6. Hazırlığın stabilizasyonu

1. Süperfüzyon çözeltisini sağlayacak peristaltik pompayı açın. Daha sonra banyodaki preparatı 3-4 mL / dk oranında önceden gazlanmış PSS ile sürekli olarak superfuse edin.
2. Süperfüzyon çözeltisi için sıcaklık kontrol cihazını açın. Banyonun sıcaklığını ~35-37 °C'ye ayarlayın.
3. Cannula'yı servo pompaya bağlayın. Basınç servo denetleyicisinde görüntülenen basıncı okuyun.
4. Akışı ve basıncı izleyin. Akış (μL/dk) ve arteriyel perfüzyon basıncı (mm Hg) sayısallaştırıcı kullanılarak dijitalleştirilir ve ilişkili bir yazılım kullanılarak kaydedilir (Şekil 2).
5. Basıncı ~10 mmHg ayarlamak için akışı ayarlayın ve ~10 dakika boyunca çalışmasına izin verin.
6. Arter basıncını ~60 mmHg yapmak için ışık çözeltisinin akışını artırın. Kanül basınç damlasını çıkararak arteriyolün kendisinin son perfüzyon basıncını elde edin (Şekil 3).
   NOT: Basınç servo denetleyicisindeki "basınç" modu seçilirse, bu deneyler için ışık basıncı ~60 mmHg olarak ayarlanır. Ardından akışın değişimini izleyin.
7. Akış ve/veya basınç seviyelerini izleyerek numunenin ~30-60 dakika stabilize olsun. Normalde kanülasyondan sonra perfüzyonun başlangıcında arteriyel basıncın kademeli bir artışı gözlenir. Yeni bir istikrarlı durum yaklaşık 30 dakika içinde kendiliğinden kurulacaktır (Şekil 4).
8. Perfüzyon basıncı stabilize edildikten sonra (sabit akışta) bir deney başlatın.

7. Hazırlığı floresan etiketli buğday-germ agglutinin (WGA) ile yüklemek

1. 5 mL Tyrode çözümüne 100 μg eşleştirilmiş WGA ekleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA içeren Tyrode'un çözümünü hazırlayın.
2. Perfüzyonu normal Tyrode'un çözeltisinden floresan etiketli WGA içeren bir çözeltiye dikkatlice değiştirin. Perfüzyonu dikkatlice değiştirmek önemlidir, böylece kabarcıklar kullanılmaz.
3. ~30 dakikalık WGA perfüzyondan sonra veya WGA çözeltisi bitmek üzereyken perfüzyonu normal Tyrode'un çözümüne değiştirin.

8. Arteriyüllerin ve kılcal damarların konfokal görüntülemesi

1. Nipkow disk konfokal mikroskop sistemini açın.
2. İletilen ışık modunda düşük güç hedefi (4x) kullanarak septal arteri bulmak için mikroskobu kullanın.
   NOT: Septal arter kanül pozisyonunu takip ederek yerlenebilir.
3. Dönen disk konfokal ile konfokal görüntülemeye başlayın ve 488 nm ekscitasyon lazeri, 40x objektif büyütme seçin ve lazer yoğunluğunu ve örnekleme oranını (görüntü başına 10 - 500 ms) ayarlayın.
4. Görüntüleme aralığını tanımlamak ve z yığını görüntüleme parametrelerini girmek için konfokal mikroskop için üst ve alt görüntüleme konumlarını ayarlayın.
5. Kullanılan sistem için önerilen adım boyutunu ayarlayın veya adım boyutunu istediğiniz gibi ayarlayın.
6. z yığını ayarını ve/veya zaman serisi ayarlarını seçin.
7. Yeni görüntüyü depolamak için yeni bir klasör seçin veya ayarlayın.
8. İleride analiz için görüntüleme kaydetmeye başlamak için "Çalıştır" ı tıklatın (Şekil 5).

9. Örnek vazodilatör deneyi: pinacidil kaynaklı vazodilasyon (Video 1).

1. Pinacidil stok çözeltisi (DMSO'da 100 mM) hazırlayın ve 4 °C'de saklanın.
2. 10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son pinacidil konsantrasyonunu 100 μM yapmak için 10 μL pinacidil stok çözeltisi ekleyin.
3. Septal arteri ve dal arterlerini içerecek şekilde papiller kası düşük büyütmede (4x amaç) görüntüleyin.
4. Işıltılı çözeltiyi pinacidil içeren çözeltiye geçirin.

10. Örnek kan akışı kontrol deneyleri: vazokonstriktör kaynaklı arteriyel perfüzyon basıncı sabit akışta artar (Şekil 6)

1. Endotelin-1 (ET-1) stok çözeltisi (10 μM) hazırlayın ve -20 °C'de saklanın.
2. 10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son ET-1 10 nM konsantrasyonunu yapmak için 10 μL ET-1 stok çözeltisi (10 μM) ekleyin.
3. Işık basıncını sürekli akışla kaydedin ve papiller kası görüntüleyin.
4. Işıklı çözeltiyi ET-1 içeren çözeltiye geçirin.

11. Perisitli kılcal damarların örnek görüntüleri (Şekil 7)

1. Bu protokolün bölüm 4'lerinde açıklandığı gibi bir NG2DsRedBAC transgenik fare feda edin.
2. Kalbi çıkarın, septal arteri kanüle edin ve örneği 5-7 protokollerini izleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA ile yükleyin.
3. Papiller kası 488 nm ve 560 nm ekscitasyonda ve konfokal kullanarak 510-525 nm, 575-625 nm emisyonda görüntüleyin. Arteriole basıncı 40 mmHg civarında olacaktır.

Bir floresan vasküler belirteç vasküler lümende perfüzyona girdiğinde (burada WGA, Alexa Fluor-488 ile eşleştirilmiş), yüksek hızlı konfokal mikroskop kullanarak Şekil 5'te (Sol panel) gösterildiği gibi tüm vasküler ağaçları görselleştirmek mümkündür. Daha fazla büyütme, kılcal damarların ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar (Şekil 5, Sağ Panel). Basınçlı sistem ışık basıncının sürekli izlenmesini desteklediğinden, bu preparat arteriyel çaptaki değişiklikleri arteriyel basınçla ilişkilendirmek için kullanılabilir. Video 1, pinacidil, lümenden ATP'ye duyarlı bir K+ kanal (KATP)agonisti servis edildiğinde, arteriyolelerin çapının arttığını göstermektedir. Şekil 6, vazokonstriktör ET-1 lümenden uygulandığında arterikülün çapının azaldığını ve akış sabit ayarlandığında ışık basıncının arttığını göstermektedir.

Konfokal mikroskopinin belirli hücre belirteçleriyle birlikte yüksek çözünürlüklü yetenekleri nedeniyle, bu prosedür mikroserkülasyonla ilişkili diğer birçok hücre tipini görselleştirmek için de kullanılabilir. Burada, perisit spesifik bir promotör (NG2) altında DsRed floresan proteinini ifade eden bir fare (NG2DsRedBAC transgenik fare) kullandık ve damarları WGA-Alexa Fluor 488 ile etiketledik. Bu, canlı hayvanlarda fizyolojiyi daha iyi taklit eden koşullar altında fare papiller kasındahem kılcal damarı (yeşil) hem de perisitleri (kırmızı) aynı anda görüntüleyememizi sağlar.

Şekil 1: Fare septal arterinin kanülasyonu.
(A) İletilen ışık görüntüsü, konserve papiller kasın bir örneğini gösterir. Mikromanipülatör, canül ve örnek (sağ ventrikül papiller kaslı septum) etiket olarak belirtilir. (B) A'daki yakınlaştırılmış örnek papiller kası ve kanüle septal arteri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tüm deneylerde kullanılan ekipman.
(A) Denemede kullanılan kurulumun ana bileşenleri. (B) Diyagramda papiller kas hazırlama ve fizyolojik kontrol deneysel ekipmanı arasındaki bağlantılar gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kanül içindeki basıncın ölçümü.
(A) Kanül içindeki basıncın bir akış aralığında (50-300 μl/dk) ölçülerek kanül direncinin nasıl belirlendiğini gösteren bir örnek. (B) Kanolün içindeki basıncın 6ülden gelen akışla ilişkisi. Canül içindeki basınç akışla orantılıydı ve Pc=0.08f-12.25 ifadesine uygundu, burada Pc canül içinde basınç olarak, f akış olarak. N=6ül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sabit bir akışta stabilizasyon sırasında perfüzyon basıncı değişimi.
(A) Sabit bir akışta stabilizasyon sırasında perfüzyon basıncının tipik bir kaydı (~250 μL/dk). 30 dakikalık stabilizasyondan sonra perfüzyon basıncının artmasına dikkat edin. (B) İstatistikler, ton geliştirildiğinde stabilizasyon öncesi ve sonrası perfüzyon basıncını gösterir. İlk basıncı korumak için arteriyüllerin ortalama akışı (~60 mmHg) 201,7 ± 8,6 μL/dk'dır (n= 45 fare). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kılcal damarların ve arteriyüllerin görüntülenmesi.
(A) Görüntüde buğday tohumu agglutinin (WGA) yüklü arteriyoleler ve kılcal damarlar gösterilmiştir. (B) A'daki kutulu alanı yakınlaştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: ET-1 ışık basıncısını arttırır ve arter çapı azaltır.
(A) ET-1 (10 nM) uygulaması ile arter çapı değişti. (B) ET-1'in çap değişimini gösteren WGA floresan profilleri. Arteriolün çapı, arteriole duvarındaki floresan'ın tepe yoğunluğu arasındaki mesafe ile yansıtıldı. (C) Sabit bir akışta ET-1 (10 nM) varlığında ışık basıncı arttı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: NG2-DsRed fareden perisitli kılcal damar.
Kardiyak perisitler (kırmızı) ve kılcal damarlar (yeşil) basınçlı (40 mmHg) ve perfüzyonlu fare sağ ventrikül papiller kasında görüntülenmiştir. Sağ panel, sol panellerdeki kutulu alanların yakınlaştırılmış görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Pinacidil kaynaklı vazodilasyon. Lümenden pinacidil (100 μM) uygulandı. Arter ağacında vazodilasyon görüldü. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Çözümlerin bileşimi.

Hiçbiri.