Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Özet

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Özet

Kantitatif canlı hücre görüntülemesinde modern yaklaşımlar, biyolojik süreçleri sınıflandırmak ve karşılaştırmak için istatistik ve hesaplamalı modellemenin kullanımını sağlayarak hücre biyolojisini keşfetmek için önemli bir araç haline gelmiştir. Hücre kültürü model sistemleri yüksek içerikli görüntüleme için harika olmasına rağmen, hücre morfolojisi yüksek iş artışı çalışmaları ex vivo kültürlerin canlı organizmalar ın içindeki hücrelerde bulunan morfolojik karmaşıklığı özetlemede sınırlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, sağlam bir organizma içinde yaşayan hücreleri görüntüölçeklenebilir yüksek iş elde etme modeli sistemi için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan aynı anda senkronize blastoderm aşamasında embriyonik Drosophila melanogaster gelişimi birden fazla zaman atlamalı videoları elde etmek için yüksek içerikgörüntü analizörü kullanmak için bir protokoldür. Syncytial blastoderm geleneksel görüntüleme biyolojik olaylar için büyük bir in vivo modeli olarak hizmet vermiştir; ancak, nicel ve yüksek iş gücü yaklaşımları için önemli sayıda deneysel kopya elde etmek emek yoğun olmuştur ve deneysel tekrar başına tek bir embriyonun görüntülenmesi ile sınırlıdır. Burada sunulan yüksek içerikli görüntüleme sistemi, ya da otomatik multinokta edinimi yeteneğine sahip herhangi bir ters mikroskop uyacak şekilde görüntüleme ve mikroenjeksiyon yaklaşımları adapte etmek için bir yöntemdir. Bu yaklaşım, istenilen edinim faktörlerine bağlı olarak, tek bir görüntüleme seansı içinde 6-12 embriyonun eşzamanlı olarak edinilmesini sağlar.

Giriş

Geçtiğimiz 30 yıl içinde, canlı hücre görüntüleme için görüntüleme teknolojileri ve moleküler problar gelişmeler hücrekarmaşıklığı ve iç işleyişi ni anlamamızı ilerlettir. Teknolojideki bu kayda eşlik eden şey, yüksek iş hacmi görüntüleme verilerinin elde edilmesinde ex vivo hücre kültürü modellerinin kullanımına daha fazla güvenilmesidir. Hücre kültürü modelleri mikroakışkan sistemler aracılığıyla mikroortamın kontrolü ve aynı anda birden fazla hücre görüntü yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar, yüksek iş yapma tarama için gerekli nicel yaklaşımların kullanımını sağlayan^1,2. Ancak, iki boyutlu cam veya plastik yüzeyler hücre morfolojisi ve düzenleme^3,4,5üzerinde şaşırtıcı etkileri üreten gibi morfolojik çalışmalar bağlamında hücre kültürü modelleri ile ilgili önemli dezavantajları da vardır. Bu etkiler hücresel morfolojiyi düzenleyen biyolojik süreçlerin incelenmesi ile ilgili yanlış veya yanıltıcı veri sağlayabilir.

Alternatif bozulmamış bir organizma^bağlamındahücresel morfoloji çalışma olmuştur 6, birkaç uygun bozulmamış organizmalar görüntüleme yoluyla tüm organizmaların canlı tutmak zorluklar nedeniyle yüksek iş gücü kantitatif canlı hücre görüntüleme kolaylaştırmak, ve büyük bir çok hücreli organizma içinde görüntüleme ile ilgili zorluklar. Sonuç olarak, bozulmamış organizmalarda hücre biyolojik çalışmalar genellikle büyük ölçüde örnek boyutunu sınırlar zaman içinde tek bir organizma gözlemleyerek odaklanmıştır. Buna ek olarak, bu tek hayvan-at-a-time sınırlama canlı görüntüleme zor ve bir ekran şeklinde istihdam pahalı hale getirir ve örnek sayısı genellikle çok küçük olduğundan nicel analitik araçları uygulamak için yeteneği kısıtlar. Böylece, yüksek içerik tabanlı nicel yaklaşımlar için kullanılabilecek bir çok hücreli model organizma ihtiyacı ortaya çıkar.

Bu protokol, drosophila embriyoyu, kantitatif analiz için yeterince büyük deneysel numune boyutları oluşturmak için plaka bazlı yüksek içerikli görüntülemeye uyarlar. Drosophila melanogaster yaygın ilk model organizma olarak bilinir. Drosophila kullanarak araştırma hücre ve moleküler biyoloji atılımlar yol açmıştır, genetik bilgi iletimi de dahil olmak üzere, hücre sinyal yollarının belirlenmesi, ve embriyonik gelişim genetik gereksinimleri^7,8,9. Buna ek olarak, Drosophila embriyo hücresel bölünme sırasında in vivo mikrotübül dinamikleri keşfetmek için kullanılmıştır^10,11,12. Küçük moleküller ve moleküler problar sunmak için mikroenjeksiyon kullanımı Drosophila embriyonik gelişimi özellikle vivo hücresel süreçleri sondalama için güçlü kılan zamansal kontrol sağlar^13,14. Ancak, geleneksel görüntüleme yaklaşımı ile önemli sayıda deneysel tekrar oluşturmak son derece emek yoğundur ve yüksek iş gücü görüntüleme ekranları ve kantitatif analizlerde sınırlı kullanıma sahiptir. Yaklaşımımız genellikle tek hücre analizi için ayrılmış yüksek içerik libir analizör kullanır ve erken Drosophila embryo senkronizasyonunda in vivo görüntüleme analizi uyarlar.

Bu protokol, mitoz¹⁵sırasında Endoplazmik Retikulum (ER) morfolojik değişiklikleri sürücü mekanizmaları keşfetmek için drosophila embriyoları toplamak, evre ve mikroenjekte etmek için kullanılmıştır. Birçok çalışma hücre döngüsü sırasında ER dinamik doğası özetlenen olmasına rağmen^16,17,18,19, ER morfolojisi üzerinde zaman içinde birden fazla tedirginlik etkilerini karşılaştırmak zor olmuştur. Hücre bölünmesi boyunca ER morfolojisinde değişiklikleri yönlendiren bileşenleri tanımlamak için, bu protokolde listelenen yöntemler erken Drosophila embriyosunda kortikal sintiyel bölünme kullanılarak mitotik ER yeniden yapılandırışmikrotübüllerin ve diğer sitosiskeleter faktörlerin rolünü araştırmak için kullanılmıştır. Birlikte ele alındığında, Drosophila topluluk içinde genetik pertürbasyon durumu, geliştirme sırasında hassas zamanlarda ilaç ve moleküler problar mikroenjekte yeteneği, ve Drosophila ile çalışmanın ucuz maliyeti bu yaklaşımı son derece yüksek verimli görüntü tabanlı tarama için uygun hale getirir. Burada açıklanan yöntemler Drosophila embriyo²⁰kullanarak vivo hücresel ve gelişimsel süreçlerin geniş bir yelpazede incelenmesi için geçerlidir. Özellikle, bu protokol de uzun bir süre içinde meydana gelen biyolojik olayları incelemek için uyarlanmıştır ve Drosophila embriyo korteks 100 mikron içinde.

Protokol

NOT: Medya ve çözüm tarifleri için Tablo 1'e bakın.

1. Canlı analiz için embriyo toplama kafesi kurulması ve bakımı²¹

1. Taze sinekler ile taze bir embriyo toplama kafesi doldurmak.
   NOT: Ticari olarak mevcut toplama kafesleri tavsiye edilirken, toplama kafesleri boş sinek şişelerinden kolayca inşa edilebilir²¹.
   1. Birçok pupa evre p14'te kararmaya başladığında yetişkin sineklerini şişelerden atın veya aktarın; 20 °C'de yumurtalar²²gün sonra oluşur.
   2. Pupa yumurtadan ve 12-24 saat için şişe doldurmak için izin verin.
   3. Sineklerin kaçmasını önlemek için toplama kafesi açlığı üzerinde küçük bir huni kullanarak taze sinekleri küçük bir toplama kafesine aktarın. 200 ila 500 sinek içeren yoğun nüfuslu bir kafes üretmek için en fazla 3 şişe birleştirin.
   4. Transfer (sinekler sersemletici için) tekrar tekrar sert bir yüzeye bir sinek şişesi dokunarak toplama kafesine uçar. Sonra açın ve toplama kafes hunisi üzerinde sinek şişesi ters. Toplama kafesi içine sinekler damla birkaç kez toplama kafesi üzerine açık şişe dokunun.
   5. Açık sinek şişesini fişe hızla ayarlayarak kapatın. Açık sinek şişesini huniden fişe aktarırken, sinekler dokunmanın kaynağından uzağa doğru sürünme eğiliminde olduğundan emin olun.
   6. Huniyi sinek kafesinin açılmasına bastırın ve içindeki sinekleri sersemletmek için kafesi sert bir yüzeye defalarca dokunun. Hemen huniyi çıkarın ve sinek kafesi açılması için taze bir üzüm tabağı güvenli. Üzüm plakasını sabitlemek için etiketleme bandı kullanın. Yoğun nüfuslu bir toplama kafesi oluşturmak için en fazla 3 şişeyi birleştirmek için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, sinekler CO₂ veya diğer sinek uyku ajanları kullanarak anestezi olabilir; ancak, bu adım 1.2 de iklimlendirme süresini artıracaktır.
2. 24-48 saat için yeni toplama kafesi acclimate. CO₂ veya başka bir uyku maddesi kullanılmışsa, toplama kafesini en az 48 saat boyunca alıştırın.
   1. Toplama kafesindeki üzüm tabağını günde iki kez, 8-10 saat arayla maya ezmesi içeren taze bir tabak ile değiştirin.
3. Her 5 günde bir yeni bir toplama kafesi kurun.

2. Embriyoların görüntüleme için toplanması ve hazırlanması

1. Senkronize gelişim ile embriyo ların elde edilmesi
   1. Merkezde maya ezmesi bir dab içeren taze bir ile toplama kafesi üzerinde üzüm tabağı değiştirin. 1 saat için embriyo koymak için sinekler izin verin. Eski üzüm tabağını at.
      NOT: Sinekler embriyoları yerleştirmeden önce dölleyebilirler. İlk toplama plakası bu önceden geliştirilmiş embriyoların çoğunu içerecektir. Sineklerin önce eski embriyoları terk etmesine izin vermek, embriyolar arasındaki gelişimsel senkronizasyonu geliştirecektir.
   2. Merkezinde maya macun bir dab içeren taze bir üzüm tabağı değişimi ve sinekler 10 dakika embriyolar yatıyordu sağlar. Eski üzüm tabağını at.
      NOT: Soğuk tabaklarda embriyonik gelişimi yavaşlatmamak için, kullanmadan önce üzüm tabağı nı ve maya salçasını oda sıcaklığına ısıtın.
   3. Taze bir üzüm tabağı ile değiştirin (maya ezmesi olmadan) ve eski üzüm tabağı kaydetmek, görüntüleme için embriyolar vardır. Gerekirse, adım 2.1.2 ve 2.1.3 tekrarlayarak bu kafesten embriyo toplamaya devam edin.
2. Yaş görüntü syncytial bölünmeler²³için 30-45 dakika embriyotoplamak .
   NOT: Embriyonik gelişimde sinital blastoderm evresini görebilmek için embriyoların 90 dakika içinde mikroskoba monte edilmesi ve mikroskoba monte edilmesi gerekmektedir. Bu protokolü ilk kez denerken, yaş embriyoları 10-20 dk.adım 2.2 adımlar arasında kurmak için ekstra zaman sağlamak.
3. Di suda % 50 çamaşır suyu ile dekorionate embriyolar.
   1. Yaşlı embriyoları 2.2'den 140 nm'lik bir elekten üzüm plakasını DI suyuyla doldurarak, embriyoları boya fırçasıyla hafifçe yerinden ederek ve embriyolarla suyu 140 nm elek içine dökerek transfer eder(Şekil 1A).
      NOT: Bu bir lavabo veya 1.000 mL beher üzerinde yapılabilir.
   2. Bir fışkırtma şişesi kullanarak bir DI su ile şiddetle durulayın embriyolar. Kuru bir kağıt havlu üzerinde elek lekeleme tarafından kuru embriyolar. Kağıt havluüzerinde su izleri bırakarak durana kadar elek blot (Şekil 1B).
      NOT: Bir sonraki adımda çamaşır suyu tedavisini etkisiz hale getirebileceğinden embriyolardan tüm maya macunu çıkarın.
   3. Boş bir 10 cm plakayı, yeni hazırlanmış P çamaşır suyu ile doldurun ve DI suyu yla seyreltin (1:1 çamaşır suyu: DI su). 2 dk 45 s için% 50 çamaşır suyu içine elek daldırma. Elek P çamaşır suyuna dokunur dokunmaz kronometreyi çalıştırın. Embriyo kümelerini ayırmak için ilk 15'teki P çamaşır suyu 3-4x'ine elele ve dışarı blot(Şekil 1C).
   4. Bir fışkırtma şişesi kullanarak DI su ile şiddetle durulayın embriyolar. Kuru bir kağıt havlu üzerinde elek lekeleme tarafından embriyolar kuru. 5x(Şekil 1D)için güçlü durulama ve leke kurutma işlemini tekrarlayın.
      NOT: Bu chorion üzerinde sol kaldırmak için en önemli adımdır. Tam bir DI fışkırtma şişesi kullanın ve bu adımda şişenin yarısını kullanın.
   5. Leke kurutulmuş embriyoları elekten boya fırçası kullanarak 10 cm üzüm plakasına aktarın²¹ (Şekil 1E)
      NOT: Manuel diklorinasyon çamaşır suyu decorination²⁴alternatif olarak kullanılabilir.

Şekil 1: Embriyo dechorionation. (A) Embriyolar DI H20 fışkırtma şişesi, boya fırçası ve 140 nm elek kullanılarak toplanmıştır. (B) Embriyolar bir DI H20 fışkırtma şişesi kullanılarak şiddetle durulanır ve kağıt havlu üzerinde kuru lekeler. (C) Embriyoların dechorionation 2 dakika için% 50 çamaşır suyu yapıldı ve 45 s. (D) Embriyolar şiddetle bir DI H20 fışkırtma şişesi kullanılarak durulanır ve bir kağıt havlu üzerinde kuru leke. Bu aşırı chorion kaldırmak için 4 kez tekrarlandı. (E) Embriyolar daha sonra bir boya fırçası kullanılarak 10 cm üzüm plakasına aktarıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Embriyoların kapaklara montajı

1. Bir stereomikroskop altında tepeden kaz boyun aydınlatma ile donatılmış, bir yumurta toplayıcı aracı kullanarak üzüm plakatemiz bir bölümünde 15-20 embriyolar iki satır düzenlemek. Ön ve posterior uçları ile ilgili olarak aynı yönde ventral tarafında embriyolar hizalamak. Yumurta toplayıcıları 45 ° açı ya da ince ucu paslanmaz çelik cımbız viraj yapmak için. D / V embriyolar oryantasyon gözden geçirmek için Campos-Ortega ve ark.²⁰bakın.
   NOT: Ventral yüzeyin üzüm plakasının üzerine oturması önemlidir, çünkü embriyolar 3.5.adımda bir kapak kaymasına bastırılarak dorsal yüzeyi görüntüleme için açığa çıkaracaktır. Sırt yüzeyi ventral yüzeyden çok daha düz olduğundan, dorsal yan yüzeyin görüntülenmesi tek bir Z düzleminde bulunan çekirdek sayısını artırır.
2. 75 mm x 25 mm silikon spacer coverslip hazırlayın.
   NOT: Bu önceden hazırlanabilir. Birkaç kapak lı dudak hazırlayın ve temiz tutmak için bir slayt kutusunda saklayın.
   1. 75 mm x 25 mm'lik bir kapağın ana hatlarını 1,6 mm kalınlığındaki silikon boşluk tabakasına yerleştirin ve silikon boşluk tabakasını makas kullanarak kesin(Şekil 2A).
   2. Jilet kullanarak, spacer'dan 40 mm x 15 mm'lik bir inset(Şekil 2A)kesin.
   3. Spacer'ı kapak kaymasına yapıştırın ve 10 μL'lik heptane tutkalaçık kapağı cam insetinden aşağı doğru çizgileyin(Şekil 2A).
      NOT: Aşağı ve çift çizgi koyarak aynı z düzleminde görüntüleme embriyolar sağlayacaktır.
3. Adım 3.2.3'ten gelen heptane tutkal kururken, 3.1.adımdaki embriyoları içeren üzüm plakasının dikdörtgen bir bölümünü keser.
   1. İki embriyo sırasının etrafında dikdörtgen (40 mm x 15 mm'den küçük) kesmek için jilet kullanın. Dikdörtgeni henüz çıkarmayın.
   2. İlkinin yanında ikinci bir dikdörtgen kesin. Paslanmaz çelik spatulanın düz kenar tarafını kullanarak ikinci dikdörtgeni çıkarın.
   3. Paslanmaz çelik bir spatulanın düz kenarını ilk dikdörtgenin altına dikkatlice kaydırın ve çıkarın(Şekil 2B).
4. 3,5 cm'lik bir yemeğin dış tarafına embriyolarla üzüm tabağı kesiği yerleştirin(Şekil 2C).
5. Stereomikroskop altında, embriyoların üzerine hazırlanmış bir kapak kapağını düşürün ve iki embriyo sırasını tutkalüzerine hafifçe bastırın(Şekil 2D).
6. Eğer embriyoenjekte ederseniz, adım 4.1'e geçin. Mikro enjeksiyon değilse adım 3.7 devam edin.
7. 1:1 - halokarbon yağı 700: halokarbon yağı 27 ile silikon spacer (yarım üst) doldurarak embriyolar kapak.
8. Kapağın hareket etmesini önlemek için 4 slaytlı plaka adaptörünün alt kenarlarını çift taraflı bantla hizalayın, ancak bandı objektif lensin yoluna yerleştirmeyin. Bu kaset çok önemli. Coverslip sadece adaptör üzerinde oturuyorsa, satın alma boyunca hareket edecektir. 4 slayt plakası adaptörü üzerinde kapak kayma monte.

Şekil 2: Kapak kayması hazırlama ve montaj. (A) 75 mm x 25 mm kapaklı bir anahat 1,6 mm kalınlığındasilikon levha üzerine izlendi. Anahattı kesmek için makas kullanın. 40 mm x 15 mm inset silikon boşluktan kesildi ve coverslip üzerine monte edildi. Insetin merkezinde 15 μL aşağı çizgili. (B) 40 mm x 15 mm'den daha küçük bir alanda üzüm plakası üzerinde 15-20 embriyodan oluşan iki sıra düzenlenmiştir, daha sonra bu alan jilet ve paslanmaz çelik spatula kullanılarak kesilmiştir. (C) Üzüm tabağı kesilmiş boş bir 3,5 cm çanak üstüne yerleştirildi. (D) Stereomikroskop altında, (A)'dan gelen kapak kapağı indirildi ve embriyolar tutkal çizgisine yapıştı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Embriyoların kurutuculanması ve mikroenjekte ediletilmesi

1. Desiccation ve mikroenjeksiyon sırasında kapak alt kirli olmasını önlemek için bir slayt üzerinde bir slayt üzerinde embriyolar ile coverslip yerleştirin.
   NOT: Kapak fişi, slayt asıymadan görüntülenecektir. Bu nedenle görüntüleme için ters bir mikroskop gereklidir.
2. Odanın sıcaklığına bağlı olarak embriyoları 5-10 dk kurutun. Temsili sonuçlarda görüntüleme için kullanılan embriyolar, kurutma maddesi üzerinde 1:1 kat silika jel boncuk içeren bir odada 20 °C'de 7 dakika boyunca kurutuldu (Şekil 3A).
3. Desiccation hemen sonra, 1:1 ile embriyolar kapak - halokarbon yağı 700: halokarbon yağı 27. Silikon boşluk alanını yarıya kadar doldurun.
   NOT: Yüksek viskoziteli halokarbon yağı ile düşük viskoziteli halokarbon yağının karıştırılması önemlidir. Saf halokarbon yağı 700 (yüksek viskozite) uygulama sonrası hücre döngülerinin ilerlemesini 30 dk yavaşlatır. 1:1 halokarbon yağı 700 ve halokarbon yağı 27 karışımı bu objeyi düzeltti.
4. Mikroenjeksiyon iğnelerini enjektörle yükleyin, sonra bir tanesini mikroenjektöre tonuyla tartın ve basınç altında kesin.
   NOT: Değerli reaktiflerle tam titreci yapmadan önce adım 4.4'e birkaç kez uygulayın. Bu mikroenjeksiyon sürecinde ki en zor adımdır.
   1. Uzun bir yükleme ucu kullanarak 2 μL enjektör ile mikroenjeksiyon iğneleri yükleyin. Sadece bir mikroenjeksiyon iğnesi gereklidir, ancak yedek yüklü iğnelerin 2 veya 3 iğne hazırlaması iyi olur.
      NOT: Genişletilmiş yükleme ipuçlarının özellikleri için Malzeme Tablosuna bakın. Mikroenjeksiyon iğneleri, ucunu açmadan önce kapalı ve dolu bir iğnenin içindeki hava basıncını oluşturmaya dayanan mikroenjeksiyon tekniğimizin benzersiz doğası nedeniyle uzatılmış yükleme uçları olmadan yüklenemez.
   2. Mikroenjektöre bir iğne sapla ve pistonu ucun yarısına kadar bastır. Amaç cam kılcal damar içindeki hava basıncını artırmaktır (Şekil 4A).
      NOT: Mineral yağ olmadan bir piston mineral yağ bazlı mikroenjektör kullanın. Bunun yerine mineral yağ ile basınç bina, hava basıncı oluşturmak için piston kullanın.
   3. Cam iğneyi cam bir kaydırağın üzerine indirin ve yeni bir #9 jilet kullanarak iğnenin ucunu kesin. Keskin bir açık uç üretmek için iğneyi 45° açıyla kesin. Enjektör iğneden dışarı akmadan ucun dibine doğru akmalıdır. Dikkatlice iğneucu üzerine halokarbon yağı 20 μL ekleyin ve 45 ° de tekrar açık kesin. Enjektör hızla akmaya başlamalı.
   4. Pistonu geri çekerek hemen hava basıncını düşürün, ancak iğnenin enjeksiyonlar arasında embriyo zarı ile tıkanmasını önlemek için sürekli akış hızını koruyun. (Şekil 4B).
      NOT: Enjektör temizse, mikroenjeksiyon iğnesini halokarbon yağının içinde ve dışında kaldırıp çıkarak ve stereomikroskop altında enjektör damlacıklarının oluşum hızını gözlemleyerek enjektör akış hızını görüntüleyin. Bir seferde birkaç tıklama ile piston depresif hava basıncı ayarlayın, sonra yeni damlacıklar sonrası ayarlama için oluşum oranını görüntülemek için halokarbon yağı içine ve dışına mikroenjeksiyon ucu daldırma.
   5. İğneyi görüş alanının ortasına konumlandırmak için mikromanipülörü kullanın, ardından mikromanipülörü kullanarak iğneyi kaldırın ve altındaki cam kaydırağı çıkarın. İğne enjeksiyon için ayarlandı.

Şekil 3: Kurutuculuk odası diyagramı. (A) Bu bir kurutma odasının diyagramıdır. Oda drierite bir tabaka üzerinde silika jel boncuk bir 1:1 tabaka oluşur. Desiccation gerçekleştirmek için, embriyolar tek bir kuyu plaka kapağı üstüne yerleştirildi. Kurutma odası 7 dk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız kapalıdır.

5. Mikroenjekte embriyolar
   1. Embriyoları mikroenjeksiyon iğnesi altında stereomikroskop aşamasına yerleştirin, ancak iğneyi düşürmeyin.
   2. 50x büyütmede embriyolara odaklanın.
   3. İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine gelene kadar indirin. Bir el ile slayt taşıma ve diğer mikroenjektör işletim, embriyoların bir satır enjekte.
   4. İğneyi kaldırın ve ikinci embriyo sırasını mikroenjeksiyon iğnesine maruz bırakmak için kaydırağı 180° döndürün. İğneyi indirve ikinci sıra embriyoları enjekte edin.
      NOT: 10 dk altında bunu deneyin. Bazı enjekte edilmemiş embriyoları kontrol olarak kullanılması için bırakın.

Şekil 4: Mikroenjeksiyon iğne sipreparat. (A) Buresimde, iğnedeki macentanın yoğunluğu hava basıncını temsil eder. Yüklü bir iğne mikroenjektörüzerine monte edildi ve piston iğne içinde hava basıncını artırmak için% 50 uzatıldı. Montajdan önce pistonun maksimum olarak geri çekildiğinden emin olun. (B) İğne ucu basınç altında kesildi ve hava basıncını ve akış hızını azaltmak için piston geri çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Yüksek içerik analizöründe görüntüleme

1. Bu çıktıtayı çalıştırmadan önce slayt bağdaştırıcısı için bir plaka eşlemi oluşturun. Özel bir plaka bağdaştırıcısı için boyut alabilmek için Plaka Haritası Yöneticisi menüsünde bulunan plaka tutucu düzenleyicisini kullanın.
   NOT: Ticari olarak kullanılabilen plaka adaptörü için özel bir plaka haritası yapılmıştır (bkz. Malzemeler Tablosu). Plaka haritası aşağıdaki ayarları içerir; Slayt kalınlığı: 1000 μm, Alt yükseklik: 1.607 mm, alt yükseklik değişkenliği: 100 μm, substrat malzemesi: cam, kapak kalınlığı: 150 μm, kapak lı pozisyon: alt – satır: 1 – boşluk: 56.987 mm, kolon: 4 – aralık28.391, boyut ve şekil: dikdörtgen, genişlik 23.00 mm, yükseklik: 73.00 mm, Ofset A1 21.29 mm – 42.74 mm)
2. Slayt bağdaştırıcısını mikroskoba yükleyin ve kapak kaymasının brightfield 10x görüntüsünü döşemek için Önizleme özelliğini kullanın.
3. Bir satırın üst veya alt kısmından bir embriyo seçin, ardından Hedef'i seçin ve 60x'e (NA 0,95) geçin. İstenilen floresan kanalı için uygun bir pozlama belirleyin.
   NOT: Canlı hücre görüntülemesi için lazer yoğunluğunu %'in altında koruyun.
4. Ana panoda, her iki embriyo satırını da içeren floresan 60x bir görüntüyü döşemek için Önizleme özelliğini kullanın.
5. Ana gösterge panelinde Binning açılan menüsünü seçin ve en iyi çözünürlük için binning'i 1 x 1 olarak ayarlayın.
6. z yığınları için parametreleri tanımlamak için z Yığını Kurulumu sekmesini kullanın.
   1. z Yığını Kurulumu sekmesinde, yukarı ve aşağı okları kullanarak üst ve alt z yığını sınırlarını tanımlayın. Üst ve alt sınırlar tanımlandıktan sonra, z yığını konumunu kaydetmek için Yeşil Kalem Simgesi'ni seçin. Adım 5.6.5'te kullanılacağı için z yığını konumuna dikkat edin.
   2. z Yığını Kurulumu sekmesinde, z Dilimleri arasındaki aralığı tanımlayan z Adım giriş kutusunu kullanın.
      NOT: Toplam dilim sayısı 5.6.1 ve 5.6.2 adımı modüle edilerek belirlenir.
   3. Ana panoda, Floresan Kanal'a sağ tıklayın ve görüntüleme modunu 3B olarak ayarlamak için Görüntü Modu açılır menüsünü kullanın.
   4. Ana panoda, otomatik netlemi devre dışı kakmak için Lazer Otomatik Netleme Kutusu'nu seçin.
   5. Ana panoda, adım 5.6.1'den z-stack konumuyla İlk Odaklama'yı tanımlayın ve"Her Zaman Noktasında Yeniden Odaklama"özelliğini devre dışı katmak için Başlangıç Odak Kutusu'nu seçin.
7. Alanlar sekmesinde, Özel Noktalar'ıetkinleştirmek için Alan yerleşimi açılır menüsünü kullanın, ardından görüntüleme için noktaları seçmek için Okları kullanın.
   NOT: Satın almalar arasındaki zaman aralığı (adım 5.8) aynı anda kaç özel noktagörüntülenebildiğini belirler.
8. Zaman Serisi sekmesinde, zaman serisi özelliğini etkinleştirmek için Zaman Serisi Kazan kutusunu seçin ve ardından toplam zaman puanı sayısını tanımlayın.
   NOT: 6 özel nokta x 5 z dilimleri x 80 yığın = 2.400 görüntü, 2.400 görüntü x görüntü başına 8.2 MB = 19.68 GB disk alanı.
9. Ana panoda, edinme ayarlarını adlandırmak için Ad Giriş Kutusu'nu kullanın ve ardından edinme ayarlarını kaydetmek için Dosya ve Kaydet'i seçin.
10. Ana panoda, satın almayı çalıştırmak için Tazyik düğmesini seçin.

6. Görüntü işleme sonrası

1. Çok boyutlu bir hiperyığın olarak görüntü serisini açmak için xdce dosyasını Fiji'ye sürükleyin ve bırakın.
2. Hyperstack'i tif dosyası olarak kaydedin.
3. Maksimum yoğunluklu projeksiyonlar oluşturun ve bunları tif dosyaları olarak kaydedin.
4. Maksimum yoğunlukprojeksiyonlarından oluşan bir kitaplık oluşturun ve veri ayıklama ve analiz için bir boru hattı oluşturun.

Sonuçlar

Bu protokolde sunulan yaklaşım Drosophila embriyo¹⁵mitoz sırasında Endoplazmik Retikulum (ER) reorganizasyon mikrotübüllerin rolünü incelemek için kullanılmıştır. Mitoz sırasında, ER yapısı dramatik bir yeniden yapılanma görüntüler, ancak, bu değişiklikleri sürücü güçler kötü anlaşılmaktadır. Son zamanlarda, ER şekillendirme proteinleri bir aile ER tübül oluşumunu teşvik gösterilmiştir^25,26,27,28, mikrotübüller ile yakın yakınlığı için bilinen²⁸. ER morfolojisi üzerinde mikrotübüllerin rulo çalışma için, protokolde sağlanan yöntemler nicel mitoz sırasında ER yeniden yapılanma birkaç mikroenjekte ilaç tedavilerin etkilerini karşılaştırmak için veri üretmek için kullanılmıştır. Yeni mikrotübül polimerizasyonunu engelleyen kolşisin, Şekil 5 ve Şekil 6'dagösterildiği gibi mitoz sırasında ER'nin yeniden yapılanmasını önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Ayrıca, burada açıklanan yaklaşım 32 embriyo için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin üretimini sağladı. Ortalama ve maksimum yoğunluk ölçümleri, ilaç tedavileri arasında karşılaştırmalar yapmak için hayati önem taşıyan açıklayıcı ve çıkarsal istatistikler de üreten özel bir MATLAB komut dosyası kullanılarak 12.800 bölgeden üretilmiştir. Moleküler probların kullanılabilirliği ve mikroenjeksiyonların kolaylığı nedeniyle, burada açıklanan yöntemler floresan yoğunluğu nicelemesi yoluyla çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Şekil 5: Mitoz sırasında mil direklerinde Rtnl1-GFP ve ReepB-GFP zenginleştirme temsili görüntüler. (A) Hücre döngüsünde mitoz sırasında ReepB-GFP 60x görüş alanı 10. Mavi kare, B-E panelleri için kullanılan görüş alanını temsil eder. Panel A eşik ikili filtre ile işlenir. Bu filtre, ayarlanan eşiğin altındaki piksellerden veri hariç olduğu için B-E panellerine uygulanmadı. (B,D) ReepB-GFP kontrolünde ve kolşisinde. (C,E) Rtnl1-GFP kontrolünde ve kolşisin. Bu rakam Diaz ve ark.^15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Mitoz sırasında mil kutuplarında Rtnl1-GFP ve ReepB-GFP zenginleştirmelerinin ölçülmesi. Aşağıdaki koşullarda 32 embriyo için 10 karede 20 iğ ve 20 sitoplazma ROI analiz edildi. Rtnl1-GFP için DMSO kontrol enjeksiyonları Kontrol embriyoları, enjekte edilmeyen numunelere kıyasla zenginleştirmede 0,1 kat artış (P<0,001) enjekte edilmeyen numunelere (P < 0,001) göstermiştir. (B) ReepB-GFP embriyoları kontrol olarak hizmet etmek için % 10 DMSO enjekte. Kontrol embriyoları, enjekte edilmeyen numunelere kıyasla zenginleştirmede 0,1 kat artış gösterdi (P<0.001 T210'daki tüm numuneler için)(Şekil 1E; p < T210'daki tüm numuneler için 0,001). (C) Rtnl1-GFP embriyoları 5 μM Kolşisin enjekte edilir. Burada rtnl1-GFP zenginleştirmesinde iğlere (p < T210'daki tüm numuneler için 0,001) bir azalma ölçtük kontroller (A) (p < T210'daki tüm numuneler için 0,001). (D) ReepB-GFP embriyoları 5 μM Kolşisin enjekte edilir. ReepB-GFP zenginleştirmesinde iğlere kadar bir azalma ölçtük (P<0.001 T210'daki tüm numuneler için) kontrollere göre (B) (p<0.001 T210'daki tüm numuneler için). Bu rakam Diaz ve ark.^15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Maya Yapıştır21	2. Üzüm Tabakları21	3. Heptane Tutkal24
1.1 50 ml konik aktif kuru maya 7 gram ekleyin. 9 mililitre DI su ekleyin ve metal bir spatula ile eşit olarak karıştırın.	2.1 Çözelti bir olun: 250ml şişe de DI su 140ml 6 gram agar ekleyin ve otoklav.	3.1 Bir cam ışıltı şişesini 50 inç çift taraflı bantla doldurun.
1.1 50 ml konik aktif kuru maya 7 gram ekleyin. 9 mililitre DI su ekleyin ve metal bir spatula ile eşit olarak karıştırın.	2.2 Çözelti b olun: Etanol 2ml metil paraben 0,1 gram karıştırın, sonra greyfurt suyu konsantresi 60ml bu çözelti ekleyin.	3.2 Parafilm ile 20 ml heptane ve mühür cam ışıltılı flakon ekleyin. Oda sıcaklığında bir gecede döndürün.
	2.3 Otoklavlama çözeltisi a'dan hemen sonra b çözeltisine karıştırın ve karışımı 10 x 35mm perti tabaklara dökün. (35 üzüm tabağı yapar)	3.3 2 15 ml konik tüplere tutkal aktararak plastik bant enkazlarını çıkarın ve 3000 RPM'de 15 dakika santrifüj edin.
	2.4 Üzüm tabaklarının bir gecede oda sıcaklığında plaka kapakları kapalı olarak ayarlanın. Plakaları kapaklarla kapatın ve setten sonra 4C°'de saklayın.	3.4 Depolama için 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleriçine yapıştırıcı supernatant aktarın.

Tablo 1: Medya ve çözümlerin tarifleri.

Tartışma

Burada açıklanan protokol drosophila embriyonik gelişiminde çeşitli aşamalarda biyolojik olayları incelemek için son derece çok yönlü ve kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, uzun süreler boyunca meydana gelen biyolojik süreçleri incelemek için uygundur. Örneğin, hücreselleşme çalışmaları^29,30 veya Drosophilaheterokromatin etki alanlarının oluşumu^31,32 bu süreçler uzun bir süre içinde meydana beri bu protokolde açıklanan yöntemlerin kullanımı yararlanabilir. Buna ek olarak, daha az optik çözünürlük gerektiren soruları incelemek için büyütme azaltılarak örnekboyutu artırılabilir, örneğin seniyel bölümler arasındaki zamanlama³³ veya gastrulation süresi³⁴.  Aynı şekilde, 20x hedefi iki embriyonun bir görüntüleme düzleminde görüntülenmesine olanak tanır. Bu protokoldeki yöntemler, embriyonik gelişimi kantitatif analiz için bir model sistem olarak kullanarak biyolojik sorular sormak için dinamik bir platform sağlamaktadır.

Bu protokolde 3 kritik adım vardır. %50 çamaşır suyunda dechorionation sonrası embriyoların durulanıp 5 kez (2.3.4) şiddetle kurutulan olması zorunludur. Bu adım chorion kalan küçük parçalar kaldırır. Artık chorion embriyo görüntüleme görüş alanını engelleyecektir. Embriyoları cam kapak kaymasına (3.5) monte ederken, embriyoların tek tip basınçla tutkal üzerine basılması önemlidir. Bu embriyoları aynı z düzlemine yerleştirecektir. Mikroenjeksiyon iğnesini keserken, iğnenin akış hızını ayarlamak için hemen pistonu geri çekmek önemlidir, yoksa tüm enjektörükaybedersiniz.

Çalışmamız iki faktörle sınırlıydı. İlk faktör otomatik bir segmentasyon işlemi olmamasıydı. Ancak MATLAB kullanarak manuel segmentasyon komut dosyası tasarladık; genetik olarak kodlanmış bir mil işareti ile bu işlem otomatik olabilir. Gelecekte biz CNN-RFP^21,Rtln1-GFP ve CNN-RFP üretmek istiyorum; Otomatik mil segmentasyonunu etkinleştirmek için ReepB-GFP transgenik hatları. Bizim MATLAB komut dosyası ve analiz boru hattı ile ilgili daha fazla bilgi için, Diaz ve ark¹⁵ek malzemelerbakın. İkinci olarak, 35 s'lik alım aralığımızla da sınırlıydık, bu da sadece 6 embriyonun aynı anda görüntülenebildi. Daha uzun bir edinme aralığı aynı anda daha fazla embriyo görüntü sağlayacaktır. Mikroenjeksiyonun permeasyon adımı ile değiştirilmesiyle ilaç teslim hacmi artabilir, ancak numune büyüklüğümüz zaten edinme aralığıyla sınırlı olduğu için bunun gereksiz olduğunu gördük.

Bu protokol Drosophila embriyonik gelişimi görüntü için kullanılırken, genel yaklaşım c. elegansgibi diğer çok hücreli model sistemlerinde embriyonik gelişimi incelemek için uyarlanabilir, Deniz Kestanesi, ve Xenopus. Embriyolar, toplama veya döllenme yoluyla kolayca senkronize edildiklerinden kantitatif analiz için son derece yararlıdırlar. Buna ek olarak, embriyolar hareket etmez veya görüş alanından yüzerek, sayısal analiz için birden fazla zaman atlamalı video üretmek için basit bir çok noktalı edinim yeteneğine sahip yazılım kullanımını sağlar. Çalışmamızda yüksek içerik analizörü kullanmamıza rağmen, çok noktalı edinim yapabilen ters mikroskop sistemi burada belirtilen yöntemlerle eşleşebilir.

Benzer sonuçlar ters konfokal mikroskop yeteneğine sahip çok noktalı bir edinim kullanılarak elde edilebilir; ancak, yüksek içerik çözümleyicisinin avantajları, zaman içinde daha az çözünürlük gerektiren soruları incelemek için örneklem boyutunu artırdıkça ortaya çıkar. Yüksek içerik çözümleyicisi kullanmanın bariz bir avantajı, geleneksel sistemlerde 1 slayta kıyasla aynı anda 4 ayrı slayt görüntülenebilme yeteneğidir. Her slaytta 4 slayt ve 40 embriyodan oluşan tam bir set le, kazanım aralığı kareler arasında en az 15 dakika olduğu sürece, 160 embriyo birkaç saat içinde görüntülenebilir. Yüksek içerik analizörü kullanmanın bir diğer önemli avantajı da numunelerin floresan yoğunluğuna dayalı ölçümler için gerekli olan harici ışık kaynaklarından tamamen kapalı olmasıdır. Son olarak, çalışmamızda kullanılan yüksek içerik analizörü 60x büyütme de görüş cömert bir 221,87 μm alan sağlayan bir 5.5 megapiksel CMOS kamera vardır. Bu daha büyük görüş alanı, satın alma noktası başına yarım embriyo görüntüsü elde etmemizi sağladı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 x 35mm Mikro Çanak	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
%100 üzüm suyu konsantresi	Welch's,% 100 Konsantre Üzüm Suyu	Yok	Marketten Satın Alma
250ml Erlenmeyer Şişeleri, Dar Ağızlı	VWR	Cat #: 10536-914	Yok
3" Metalik Olmayan Elek No. 140	Gilson Company	SV-165 #140	Yok
4 Slayt Görüntüleme Tepsi	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/
A ACROS Organics, N-Heptan, %99+, spektroskopi için	Fisher Scientific	Cat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Etanol, %99,5, ACS reaktifi, mutlak, 200 kanıt	Fisher Scientific	Cat#: AC615095000	N/A
Acros Organics, Metil 4-hidroksibenzoat, %99. (metil paraben)	Fisher Scientific Cat	#: AC126961000	Yok
Kapak Kayması, Dikdörtgen, 25 x 75mm, # 1 Düz Cam	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	N / A
Kültür Kuyusu Silikon Levha Malzemesi - 1.6mm kalınlığında	Grace Biolabs	SKU: 664273	N / A
DWK Yaşam Bilimleri Wheaton 20mL PET Sıvı Sintilasyon	Şişeleri Fisher Scientific	Cat #: 03-341-71A	N/A
Embriyo Toplama Kafesi-Mini	Genesee Scientific	Cat #: 59-105	N/A
Eppendorf Mikro Yükleyici Pipet Uçları	Fisher Scientific	Ürün Kodu: 10289651	N/A
Falcon 15mL Konik Santrifüj	Fisher Scientific	Cat #: 05-527-90	N/A
Falcon 50mL Konik Santrifüj Tüpleri	Fisher Scientific	Cat #: 14-432-22	N/A
Fleischmann'ın, Aktif Kuru Maya	Fleischmann'ın Marketten		Satın Aldığı
Yok Üzüm Tabakları	TARİF HAZIRLAMAYA BAKIN	N/A	N/A
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	Cat #: 59-133	N/A
Halocarbon 700 Oil	Genesee Scientific	Cat #: 59-131	N/A
Heptan Tutkal	TARİF HAZIRLAMAYA BAKIN	N/A	N/A
Endüstriyel Tıraş Bıçakları (Cerrahi Karbon Çeliği) Tek Kenarlı No. 9	VWR	Cat #: 55411-050	N / A
Parafilm M Laboratuvar Sızdırmazlık Filmi, 4 inç x 250 fit Rulo	Fisher Scientific	Cat #: 50-998-944	N / A
Dağıtıcılı Scotch Çift Taraflı Bant, Dar Genişlik, Yapıştırma için Tasarlanmış, 1/2 "x 7 yds., 3/Pack Caddy	Fisher Scientific	Cat
#: NC0879005 YokSilika jel boncuklar, kurutucu ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU: 1077351000	Yok
Paslanmaz Çelik Kaşık / Spatula	VWR	Cat #: 470149-044	NA
WA Hammond Kurutucu Emicileri Gösteren	Fisher Scientific	Cat #: 23-116582	Yok
Maya Macunu	TARİF HAZIRLAMAYA BAKIN	N/A	N/A
EQUIPMENT
Allegra X-12 Tezgah Üstü, Santrifüj	Beckman Coulter	N/A	15 ml konik santrifüj eklerine erişmeniz gerekecektir.
Otoklav	N/A	N/A	Herhangi bir otoklav yeterli olacaktır.
Drummond Nanoject II Mikro Enjektör.	Drummond Scientific	N/A	Bu mineral yağ bazlı bir enjeksiyon sistemidir.
GE Healthcare IN Hücre Analiz Cihazı 6000.	GE healthcare	N/A	Çok noktalı yakalama yeteneğine sahip hızlı bir konfokal mikroskop ikame edilebilir.
Buzdolabı (4C°)	N/A	N/A	Fly ortamı ve maya macunu (4C°) de saklanmalıdır.
Zies Stemi 508 Transillüminasyon tabanlı 300 ve üstten deveboynu aydınlatmalı Stereo Mikroskop.	Zeiss Mikroskobu	N/A	Transillüminasyon tabanı ve deveboynu aydınlatması gereklidir.