Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Summary

Burada, hücre zarındaki altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin kullanımını gösteriyoruz. Tek AuNR'lerin konumu ve yönü ImageJ ve MATLAB kullanılarak algılanır ve AuNR'lerin difüzif durumları tek parçacık izleme analizi ile karakterize edilir.

Abstract

Hücre zarı üzerindeki nanopartiküllerin difüzyonel dinamiklerinin analiz etmek, hücresel alım sürecinin daha iyi anlaşılmasında önemli bir rol oynar ve nano-tıp teslimatının rasyonel tasarımı için teorik bir temel sağlar. Tek parçacık izleme (SPT) analizi, hücre zarı üzerindeki bireysel nanopartiküllerin konumunu ve yönünü araştırabilir ve çevirisel ve dönme durumlarını ortaya getirebilir. Burada, canlı hücre zarında altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca ImageJ ve MATLAB kullanarak AuNR'lerin konumunun ve yönünün nasıl çıkarılacağını ve AuNR'lerin difüzör durumlarının nasıl karakterize edeceğini gösteriyoruz. Yüzlerce parçacığın istatistiksel analizi, tek AuNR'lerin U87 MG hücre zarının yüzeyinde Brownian hareketi gerçekleştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bireysel uzun yörünge analizi, AuNR'ların membran üzerinde iki belirgin şekilde farklı hareket durumlarının olduğunu göstermektedir, yani uzun menzilli taşıma ve sınırlı alan hapsi. SPT yöntemlerimiz potansiyel olarak farklı biyolojik hücrelerdeki yüzey veya hücre içi parçacık difüzyonunu incelemek için kullanılabilir ve karmaşık hücresel mekanizmaların araştırılması için güçlü bir araç haline gelebilir.

Introduction

Membran üzerindeki nanopartiküllerin (NP) dinamikleri, hücre fonksiyonlarının, viral veya bakteriyel enfeksiyonların anlaşılması ve yapay nanomedikal iletim sistemlerinin geliştirilmesi için gerekli olan hücresel alım süreci ile yakından ilişkilidir^1,2. Tek parçacık izleme (SPT) tekniği, NPs^3,4'ünheterojen davranışlarını karakterize etmek için sağlam bir araçtır. Genel olarak, hücre zarı akışkandır, bu da proteinler ve lipitler gibi bileşenlerin plazma membran düzleminde yanal olarak hareket edebileceği anlamına gelir^5,

Protocol

1. Hücre kültürü

1. Fetal sığır serumu ekleyerek U87 MG hücreleri için komple ortam hazırlayın (son konsantrasyon% 10) ve penisilin-streptomisin (son konsantrasyon %1) minimum temel ortama (MEM). Hücreler alt kültürü için plastik hücre kültürü çanağı kullanın.
2. Pasaj hücreleri haftada 2 ila 3 kez.

3. 
   

Results

Protokolde değiştirilmemiş 40 x 85 nm CTAB-AuNR kullanıldı. Şekil 2B'degösterildiği gibi, boyuna plazmonik maksimum değeri ~650 nm 'dir (kırmızı bölge) ve enine rezonansı 520 nm'dedir (yeşil bölge). Önceki literatürler plazmonik AuNR'lerin optik özelliklerinin (LSPR yoğunluğu gibi) çapları^20,22ile önemli ölçüde değişeceğini ortaya koydu. Şekil 2C'de, U87 hücre zarında CTAB-AuNR'lerden gelen saçılma yoğun.......

Discussion

Sunulan protokol, AuNR'lerin hücre zarı üzerindeki dinamiklerini incelemek için kullanılır. Mikroskobik görüntüleme, veri çıkarma, dinamik parametre hesaplama ve veri analizi yöntemleri olmak üzere dört bölümden oluşan protokolde her bölüm esnek ve evrenseldir. Bu nedenle, örneğin, NP bağlantılı membran moleküllerinin membran üzerindeki hareketini, NP etiketli reseptörlerin endositoz dinamiklerini, hücre içi NP'lerin dinamik analizini ve mikrotübüller boyunca vezikül kaplı NPs taşımacılığını incelemek gibi gelecekteki bi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB kaplı altın nanoçubuklar (CTAB-AuNR'ler)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Renkli CMOS kamera	Olympus	DP74	Japonya
Lameller	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Karanlık alan mikroskobu	Nikon	80i	dik mikroskop
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	Ulusal Sağlık Enstitüleri	2.0.0-rc-69/1.52 p	a ImageJ
Yivli cam kaydırak	dağılımı Yelken markası	7103	Tek içbükey
Resim J	Ulusal Sağlık Enstitüleri	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Kodu			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum esansiyel ortam (MEM)	Fenol kırmızısı ile	Gibco	10-010-CVR
Minimum esansiyel ortam (MEM)	Gibco	51200038	fenol kırmızısı içermez
Origin	OriginLab	Origin Pro 2018C
Penisilin-streptomisin	Gibco	15140122
Plastik hücre kültürü kapları	Falcon	353002
Plastik hücre kültürü çanak çömlek	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG hücreli	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC HTB-14	bir insan primer glioblastoma hücre hattı