Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

4.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61603

⸱

5 Mart 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

Bu makalede

Özet

Burada, hücre zarındaki altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin kullanımını gösteriyoruz. Tek AuNR'lerin konumu ve yönü ImageJ ve MATLAB kullanılarak algılanır ve AuNR'lerin difüzif durumları tek parçacık izleme analizi ile karakterize edilir.

Özet

Hücre zarı üzerindeki nanopartiküllerin difüzyonel dinamiklerinin analiz etmek, hücresel alım sürecinin daha iyi anlaşılmasında önemli bir rol oynar ve nano-tıp teslimatının rasyonel tasarımı için teorik bir temel sağlar. Tek parçacık izleme (SPT) analizi, hücre zarı üzerindeki bireysel nanopartiküllerin konumunu ve yönünü araştırabilir ve çevirisel ve dönme durumlarını ortaya getirebilir. Burada, canlı hücre zarında altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca ImageJ ve MATLAB kullanarak AuNR'lerin konumunun ve yönünün nasıl çıkarılacağını ve AuNR'lerin difüzör durumlarının nasıl karakterize edeceğini gösteriyoruz. Yüzlerce parçacığın istatistiksel analizi, tek AuNR'lerin U87 MG hücre zarının yüzeyinde Brownian hareketi gerçekleştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bireysel uzun yörünge analizi, AuNR'ların membran üzerinde iki belirgin şekilde farklı hareket durumlarının olduğunu göstermektedir, yani uzun menzilli taşıma ve sınırlı alan hapsi. SPT yöntemlerimiz potansiyel olarak farklı biyolojik hücrelerdeki yüzey veya hücre içi parçacık difüzyonunu incelemek için kullanılabilir ve karmaşık hücresel mekanizmaların araştırılması için güçlü bir araç haline gelebilir.

Giriş

Membran üzerindeki nanopartiküllerin (NP) dinamikleri, hücre fonksiyonlarının, viral veya bakteriyel enfeksiyonların anlaşılması ve yapay nanomedikal iletim sistemlerinin geliştirilmesi için gerekli olan hücresel alım süreci ile yakından ilişkilidir1,2. Tek parçacık izleme (SPT) tekniği, NPs3,4'ünheterojen davranışlarını karakterize etmek için sağlam bir araçtır. Genel olarak, hücre zarı akışkandır, bu da proteinler ve lipitler gibi bileşenlerin plazma membran düzleminde yanal olarak hareket edebileceği anlamına gelir5,6,7. Membran organizasyonu ve yapısının mekansal karmaşıklığı, NP'ler ve membran arasındaki etkileşimin mekansal heterojenliğine yol açabilir. Bu nedenle, NP'lerin membran üzerindeki hareketinin doğrudan görselleştirilmesi hem yüksek uzamsal hem de zamansal çözünürlük gerektirir.

Canlı hücrelerdeki tek tek parçacıkların lokalizasyonunu onlarca nanometre uzamsal çözünürlük ve milisaniyelik bir zaman çözünürlüğü ile izleyen tek parçacık izleme mikroskopisi, NP'leri veya membran molekülleri dinamiklerini incelemek için iyi geliştirilmiştir8,9. Floresan bazlı mikroskobik görüntüleme teknikleri canlı hücre ortamında NP/molekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir9,10,11,12. Örneğin, numunenin ince katmanlarını (~100 nm) yüksek patiotemporal çözünürlüğe sahip substrat/çözelti arayüzünde gösteren toplam iç yansıma floresan mikroskopisi, membran molekülleri dinamikleri13,14çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu ve hızlı geri dönüşü olmayan fotobleaching gibi tek floroforların doğal dezavantajları izleme doğruluğunu ve süresini azaltır13. Bu nedenle, floresan probların yerini alan floresan olmayan plazmonik NP'ler, benzersiz optik özellikleri nedeniyle uzun süreli görüntüleme çalışmalarında giderek daha fazla dikkat çekmiştir15. Plazmonik NP problarının saçılma sinyallerine dayanarak, karanlık alan mikroskopisi (DFM)16,interferometrik saçılma (iSCAT) mikroskopisi 17 ve diferansiyel girişim kontrastı mikroskopisi(DICM) 18 gibi biyolojik süreçlerin mekanizmasını incelemek için çeşitli optik mikroskobik görüntüleme teknolojileri kullanılmıştır. Ek olarak, AuNR'ların hareket ve dönme dinamiği DFM ve DICM18 , 19,20,21,22kullanılarak elde edilebilir. Tipik olarak, bir SPT deneyinde, nesnenin hareketi optik mikroskop tarafından kaydedilir ve daha sonra SPT analiz yöntemleri ile analiz edilir3. Bireysel NP'ler tarafından oluşturulan zaman çözümlenmiş yörüngeler ve oryantasyonsal açılar normalde stokastik ve heterojendir, bu nedenle çeşitli analiz yöntemleriyle bol dinamik bilgi sunmak gerekir.

Burada, DFM kullanarak Hücre zarı üzerindeki AuNR'lerin dinamiklerini izleyen, ImageJ ve MATLAB ile AuNR'lerin konumunu ve yönünü çıkaran ve AuNR'lerin difüzyonunu SPT analiz yöntemleriyle karakterize eden entegre bir protokol sunuyoruz. Bir gösteri olarak, U87 MG hücre zarında değiştirilmemiş AuNR'lerin (Cetyltrimethylammonium amonyum bromür molekülü tarafından koruyucu ajan olarak sentezlenen CTAB-AuNRs) dinamiklerini görselleştirmek için SPT protokolünün nasıl kullanılacağını burada gösteriyoruz. CTAB-AuNR'lerin biyolojik ortamda proteinleri adsorbe edebileceği, hücre zarı üzerinde hareket edebileceği ve daha sonra 2,20,22hücrelerine girebileceği gösterilmiştir. U87 MG hücre merkezi sinir sisteminin en sık görülen ve en kötü huylu tümörüdür ve membran reseptörleri anormal bir şekilde ifade edilir. Membran reseptörleri, AuNR'lerin dinamiklerini etkileyen AuNR'lerdeki proteinlerle etkileşime girebilir. Protokolümüz genellikle biyoloji alanındaki diğer SPT deneyleri için geçerlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre kültürü

  1. Fetal sığır serumu ekleyerek U87 MG hücreleri için komple ortam hazırlayın (son konsantrasyon% 10) ve penisilin-streptomisin (son konsantrasyon %1) minimum temel ortama (MEM). Hücreler alt kültürü için plastik hücre kültürü çanağı kullanın.
  2. Pasaj hücreleri haftada 2 ila 3 kez.











    1. figure-protocol-1


figure-protocol-2
figure-protocol-3
figure-protocol-4
figure-protocol-5
figure-protocol-6
figure-protocol-7
figure-protocol-8
figure-protocol-9
figure-protocol-10
figure-protocol-11










Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokolde değiştirilmemiş 40 x 85 nm CTAB-AuNR kullanıldı. Şekil 2B'degösterildiği gibi, boyuna plazmonik maksimum değeri ~650 nm 'dir (kırmızı bölge) ve enine rezonansı 520 nm'dedir (yeşil bölge). Önceki literatürler plazmonik AuNR'lerin optik özelliklerinin (LSPR yoğunluğu gibi) çapları20,22ile önemli ölçüde değişeceğini ortaya koydu. Şekil 2C'de, U87 hücre zarında CTAB-AuNR'lerden gelen saçılma yoğun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sunulan protokol, AuNR'lerin hücre zarı üzerindeki dinamiklerini incelemek için kullanılır. Mikroskobik görüntüleme, veri çıkarma, dinamik parametre hesaplama ve veri analizi yöntemleri olmak üzere dört bölümden oluşan protokolde her bölüm esnek ve evrenseldir. Bu nedenle, örneğin, NP bağlantılı membran moleküllerinin membran üzerindeki hareketini, NP etiketli reseptörlerin endositoz dinamiklerini, hücre içi NP'lerin dinamik analizini ve mikrotübüller boyunca vezikül kaplı NPs taşımacılığını incelemek gibi gelecekteki bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından 21425519, 91853105 ve 21621003 hibe numaralarıyla desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CTAB kaplı altın nanoçubuklar (CTAB-AuNR'ler)NanoseedzNR-40-65085 nm * 40 nm
Renkli CMOS kameraOlympusDP74Japonya
LamellerCitoglasz10212222C22*22 mm
Karanlık alan mikroskobuNikon80idik mikroskop
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco10099141
FijiUlusal Sağlık Enstitüleri2.0.0-rc-69/1.52 pa ImageJ
Yivli cam kaydırakdağılımı Yelken markası7103Tek içbükey
Resim JUlusal Sağlık Enstitüleri1.52 j
MATLABMathWorksR2019b
MATLAB Koduhttps://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum esansiyel ortam (MEM)Fenol kırmızısı ileGibco10-010-CVR
Minimum esansiyel ortam (MEM)Gibco51200038fenol kırmızısı içermez
OriginOriginLabOrigin Pro 2018C
Penisilin-streptomisinGibco15140122
Plastik hücre kültürü kaplarıFalcon353002
Plastik hücre kültürü çanak çömlekFalcon35300135*10 mm
U87 MG hücreliAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC HTB-14bir insan primer glioblastoma hücre hattı

Kaynaklar

  1. Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).
  2. Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
  3. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  4. Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
  5. Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
  6. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  7. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  8. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  9. Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914(2020).
  10. Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
  11. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).
  12. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177(2014).
  13. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
  14. Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
  15. Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
  16. Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
  17. Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
  18. Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887(2017).
  19. Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
  20. Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
  21. Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
  22. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  23. Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103(2015).
  24. Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
  25. Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001(2018).
  26. Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
  27. Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
  28. Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
  29. Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Parçacık İzlemeImageJ AnaliziMATLAB AnaliziOrtalama Kare Yer DeğiştirmeBrown HareketiUzun Menzilli TaşımaSınırlı Difüzyon
Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.