Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Neonates onlar yaşamın ilk aylarında görüntülemek benzersiz bağışıklık profili nedeniyle bakteriyel sepsis riski altındadır. Yeninelerde yüksek mortalite oranlarından sorumlu bir serotip olan E. coli O1:K1:H7 patogenezinin incelenmesi için bir protokol oluşturduk. Yöntemimizde enfeksiyonun ilerlemesi sırasında farklı zaman noktalarında yenidoğan yavrularının intravital görüntülemesi kullanılmaktadır. Kandaki bakterilerin ölçülmesi, inflamatuar profilleme ve doku histopatolojisi ile paralel lik gösteren bu görüntüleme, sepsis sırasında enfeksiyon dinamiklerini anlamak için titiz bir yaklaşım anlamına gelir. Mevcut raporda, bakteriyel yüklerin karşılaştırılması ve hastalığın şiddetini karşılaştırmak için iki enfeksiyöz inokül modellenmiştir. Subscapular enfeksiyonun enfeksiyon sonrası 10 saat ile yaygın enfeksiyona yol açtığını bulduk. 24 saat, Parlak E. coli enfeksiyonu kan, akciğerler ve diğer periferik dokularda bol oldu. Akciğerlerde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu 24 saat önemlidir, ve bu hücresel infiltrasyon ve enfeksiyöz doz ile artar doku hasarı kanıt takip eder. İntravital görüntülemenin bazı sınırlamaları vardır. Bu bir Parlak sinyal eşiği ve anestezi sırasında neonates ile ortaya çıkabilecek bazı komplikasyonlar içerir. Bazı sınırlamalara rağmen, enfeksiyon modelimizin yenidoğan mürin sepsisi sırasında uzunlamasına enfeksiyon dinamiklerini anlamak için bir fikir verdiğini ve bugüne kadar iyice incelenmediğini görüyoruz. Biz bu model de erken yaşam sırasında diğer kritik bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir bekliyoruz.
Giriş
Bakteriyel sepsisenfeksiyonakarşı yeterli koruma sağlamaz yaşamın ilk günlerinde benzersiz bir bağışıklık profili sergileyen yeniler için önemli bir endişe 1 . Yenidoğan sepsis önemli bir ABD sağlık sorunu sadeceABD'deyılda 75.000 'den fazla vaka için muhasebe olmaya devam ediyor 2 . Bu enfeksiyonları derinlemesine incelemek için, insan hastalığının yönlerini özetleyen yeni hayvan modelleri gereklidir. Biz Escherichia colikullanarak bir neonatal fare enfeksiyonu modeli kurduk , O1:K1:H73. E. coli ABD'de yenidoğan sepsisin ikinci önde gelen nedenidir, ancak sepsi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler West Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi18tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür.
1. Bakteriyel Inokül Hazırlanması
- Streak bir Tryptic soya agar (TSA) e. coli O1:K1:H7-lux bir dondurucu stok tek bir koloni izolasyon için bir aşılama döngü ile plaka bu stiferase ifade eder ve kanamisin direncitaşır 3. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün Luria suyu (LB) oda sıcaklığına (25 °C) bir biyogüvenlik k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol neonatal farelerde bakteriyel sepsise neden oldu ve hastalığın seyrini incelemek için uzunlamasına intravital görüntüleme, kandaki bakterilerin numaralandırılması, patolojinin histolojik değerlendirmeleri ve inflamatuar sitokin ekspresyon profilleri kullandık. Zaman içinde hem düşük (~2 x 106 CPU) hem de yüksek (~7 x 106 CPU) inokülleri ile enfekte olan yenidoğan yavrularında morbidite belirtileri gözlendi. Daha fazla inokül alan yavrular, hareket kabiliyetinin azalması, duruşla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Neonatal farelerde bakteriyel sepsisi indükleyen subskapular enfeksiyon modelimiz, bakteriyel patojenlerin uzunlamasına yayılmasını gerçek zamanlı olarak incelemek için yeni bir yöntemdir. İntravital görüntüleme, bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak yenini keşfetme fırsatı sağlar. Bu bakteriyel yayma kinetik anlamak ve daha fazla hastalığın uygun aşamasında konak yanıt ve hasar çalışma için önemlidir. Fare yavrularına bakteriyel inokülin subskapular enjeksiyonu deri altı, subskapular enjeksiyonuygulanır. Bu enjeksi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Kurumsal Fonlar tarafından C.M.R.'ye destek ve.M.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL İnsülin Şırınga | Coviden | 1188128012 | İnokulum veya PBS enjeksiyonu |
| % 10 Nötr Tamponlu Formalin | VWR | 89370-094 | Histopatoloji |
| ACK Lizis Tamponu | Gibco | LSA1049201 | Bakteriyel klirens testi |
| Hayvan Dövme Mürekkebi Yapıştır | Ketchum | KI1482039 | Hayvan tanımlama |
| Hayvan Dövme Mürekkebi Yeşil Macun | Ketchum | KI1471039 | Hayvan tanımlama |
| Anti-Ly-6B.2 Mikro boncuklar | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Hücre |
| izolasyonuEscherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (lusiferazı ifade eder) | N/A | N/A | WVU'da |
| şirket içinde inşa edilmiştirE.Z.N.A. HP Toplam Ekstraksiyon RNA Kiti | Omega Bio-tek | R6812 | RNA ekstraksiyonu |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Triptik Soya Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bakteri üremesi |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Sitokin ekspresyonu qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Sitokin ekspresyonu qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Gerçek zamanlı kantitatif PCR |
| iScript cDNA Sentez Kiti | Bio-Rad | 1708891 | cDNA sentezi |
| İzolasyon Tamponu | Miltenyi Biotec | N/A | Bakteriyel klirens testi |
| IVIS Spektrumu CT ve Canlı Görüntü 4.5 Yazılım | Perkin Elmer | N/A | İntravital görüntüleme |
| LB Et suyu, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bakteri üremesi |
| EASYstrainer (Naylon Sepet) | Greiner Bio-one | 542 040 | Hücre süzgeci |
| SpectraMax iD3 | Moleküler Cihazlar | N/A | Plaka okuyucu |
| Pelet Havaneli Motor | Grainger | 6HAZ6 | Doku homojenizasyonu |
| Polipropilen Pelet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Doku homojenizasyonu |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA sentezi |
| TNF-alfa Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Sitokin ekspresyonu qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Moleküler Araştırma Merkezi | TR 118 | RNA ekstraksiyonu |
Kaynaklar
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
