Yöntem makalesi

Murine Eksizyonel Yara İyileştirme Modeli ve Histolojik Morfometrik Yara Analizi

13.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61616

⸱

21 Ağustos 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaraların nasıl üretileceğin ve yaraların morfometrik analiziçin nasıl izlendiğini, hasat edilip hazırlanacağını açıklar. Morfometrik kusurları tanımlamak, tam olarak ölçmek ve tespit etmek için seri histolojik bölümlerin nasıl kullanılacağına iliş bir açıklama dahildir.

Özet

Murine eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin ardışık olarak örtüşen evrelerinin her birini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır: inflamasyon, proliferasyon ve remodeling. Mürin yaraları, iyileşme sürecinin bu farklı evrelerinin ölçülebilir olduğu histolojik olarak iyi tanımlanmış ve kolayca tanınabilir bir yara yatağına sahiptir. Alan içinde histolojik analizler için yaranın keyfi olarak tanımlanmış bir "orta" kullanmak yaygındır. Ancak, yaralar üç boyutlu bir varlıktır ve genellikle histolojik olarak simetrik değildir, küçük bir etki boyutuile morfometrik kusurları tespit etmek için iyi tanımlanmış ve sağlam bir nicel yöntem ihtiyacını destekler. Bu protokolde, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaralar oluşturma prosedürünün yanı sıra belirli seri bölümlerde bir görüntü işleme programı kullanılarak morfometrik parametrelerin nasıl ölçülmeye cerenebilir ayrıntılı bir talimatı açıklanmıştır. Yara uzunluğu, epidermal uzunluk, epidermal alan ve yara alanının iki boyutlu ölçümleri, yarayı kaplayan üç boyutlu epidermal alanı, genel yara alanı, epidermal hacim ve yara hacmini tahmin etmek için kesitler arasındaki bilinen uzaklıkla birlikte kullanılır. Bu ayrıntılı histolojik analiz konvansiyonel analizlere göre daha fazla zaman ve kaynak tüketen olmasına rağmen, titizliği doğal olarak karmaşık bir yara iyileşme sürecinde yeni fenotipleri tespit etme olasılığını artırır.

Giriş

Kutanöz yara iyileşmesi sırayla örtüşen aşamaları ile karmaşık bir biyolojik süreçtir. Hasarlı epitelin bariyer işlevini geri getirmek için zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş hücresel ve moleküler süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. İlk aşamada, inflamasyon, nötrofiller ve makrofajlar yaraya göç, lokal ve sistemik savunma seferber1. İnflamatuar evrenin takibi ve üst üste bindirilen proliferasyon aşamasıdır. Fibroblastlar hızla çoğalmaya ve granülasyon dokusuna göç etmeye başlar. Önden uzak keratinositler, öndeki kenardaki farklılaştırılmış keratinositler yarayı yeniden epitelize etmek için göç ederken yaraya doğru çoğalır2. Son olarak, remodeling ve olgunlaşma aşaması başlar, granülasyon dokusunda fibroblastlar sentez ve mevduat kollajen başlar sırasında. Yeni matrisin yeniden biçimlendirilmesi ve düzenlenmesi yaralanmadan sonra 1 yıla kadar sürebilir3. Birden fazla hücre tipi arasında çapraz konuşma içeren örtüşen olayların karmaşıklığı nedeniyle, ve araştırma yıl rağmen, hücresel ve moleküler mekanizmaların altta yatan yara iyileşmesi nin altında yatan kötü anlaşılmış kalır.

Fare modeli kullanım kolaylığı nedeniyle yara iyileşme mekanizmaları araştırmak için baskın memeli modelidir, nispeten düşük maliyetli ve genetik manipulability1,4,5. Murine modelinde farklı tiplerde yara tanımlanmış olsa da, en sık görülen eksizyonel yaradır (ya bilateral punch ya da direkt punch biyopsisi), ardından kesi yara modelleri4. Eksizyonel yara modeli, doğal olarak iyileşme sürecinden geçmiş olan kontrol dokusunu ürettiği için kesi modeline göre belirgin bir avantaja sahiptir. Cerrahi protokol kapsamında eksizlenen punch biyopsi dokusu, yaralı doku ile aynı şekilde işlenebilir ve istenilen kriter için homeostatik koşulların oluşturulmasında kullanılabilir. Eksizlü kontrol dokusu da bir cilt ön tedavi etkilerini değerlendirmek veya yaralanma sırasında başarılı gen değişikliği teyit yararlı olabilir4.

İyileştirme parametreleri planimetri veya histoloji de dahil olmak üzere birçok farklı teknikle değerlendirilebilir. Ancak, planimetri sadece yaranın görünür özelliklerini değerlendirebilir, ve bir yara varlığı nedeniyle, genellikle histoloji tarafından görselleştirilmiş şifa ölçümleri ile ilişkili değildir, bu nedenle histoloji analiz "altın standart" yapma4. Histolojik analiz altın standart olmasına rağmen, en sık yara nın keyfi bir alt kümesi üzerinde yapılır6,7. Örneğin, yarayı gömmeden ve kesmeden önce yarayı "yarıya" kesmek, malzeme ve veri analizi için harcanan zamanı ve kaynakları azaltmak için şu anda yaygın bir uygulamadır. Bu protokolde tanımlanan morfometrik analiz yöntemi, yara dokusunun tamamını kapsayacak, yaranın morfolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtacak ve küçük bir etki boyutunda yara iyileştirici kusurlarıtespit etme olasılığını artırmak için geliştirilmiştir. Bu protokolde, en sık çalışılan murine yarasını, bilateral tam kalınlıktaki eksizyonel yarayı oluşturmak için cerrahi bir yöntemin yanı sıra histolojik analiz için detaylı ve titiz bir yöntem insa edilen bu tür alanlarda nadiren kullanılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlanmıştır ve Iowa Üniversitesi'nin politika ve prosedürleri Iowa IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar ve hayvancılık

  1. Saç folikülü evresi telogen olduğunda 8-10 yaş arasında istenilen fare hattının yetişkin fareler kullanın.
  2. Ameliyat günü, temiz kafesler halinde fareler ayrı ve ayrı ayrı ev yara bozulmasını en aza indirmek için.

2. Cerrahi

NOT: Steril cerrahi koşulların sürdürülmesi gereksizdir. Hayvanlar arasında kısırlığı korumaya özen gösterilmesi gerekirken, yumruğun kendisi temiz ama steril olmayan bir yüzeyde yapılır. Hayvan başına ameliyat süresi 10 ile 15 dk arasındadır.

  1. Anestezi
    1. Isofluran buharlaştırıcı % 4-5 akış hızı ve oksijen akış ölçer dakikada 1 litre olarak ayarlanmış ayarlanmış bir indüksiyon odasında 1-2 dakika hayvan anestezi. Alternatif anestezi seçenekleri için tartışma konusuna bakın.
    2. İşleme başlamadan önce uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi derinliği sağlam bir parmak çimdik tarafından teyit edilebilir.
    3. Fareyi indüksiyon kabından bir burun konisine aktarın ve izofluran akış hızını %1,5'e, oksijen akış ölçeri ise 0,5 L/dk'ya düşürün.
    4. Prosedür 5 dakikayı aştığı için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
    5. Termal ped kullanarak normal vücut ısısını koruyun.
  2. Yara alanının hazırlanması
    1. Omuz hizasında farenin arka kürk kaldırmak için bir kaudal rostral hareket bir elektrikli jilet makas kullanın. İkiden fazla yara yapıyorsa, gerektiğinde arkadaki tüyleri aşağı doğru çıkarın.
    2. Kesilen alanı yakından tıraş etmek için farenin arkasından 20° olarak tutulan rostral kaudal harekette bir jilet kullanarak kalan tüyleri çıkarın(Şekil 1A).
    3. Bir povidone-iyot bezi ile tıraş alanı temizleyin.
    4. İyot bezinden potansiyel kutanöz tahrişi azaltmak için cildi steril %70 izopropil alkol hazırlık pedi ile silin.
  3. Yaralama
    1. Sırt orta hattı boyunca kürek kemikleri arasındaki deriyi çimdiklayın ve sandviçli deriyi vücuttan çekin(Şekil 1B).
    2. Fareyi, temiz kağıt tabanlı havlu veya eşdeğeri ile kaplı düz bir yüzeyüzerinde deri kıvrımı ile yan tarafta konumlandırın. Altta yatan yüzeyi hasardan korumak için havlunun altında bir diş balmumu yaprağı kullanın(Şekil 1C).
    3. Mümkün olduğunca vücuda yakın istenilen boyutta biyopsi yumruk yerleştirin ve cildin dinlenmek için izin. Cildi esnetmeyin, yoksa yara boyutu belirlenen yumruk boyutundan daha büyük olacaktır(Şekil 1D).
    4. Aşağı bastırarak derini yumrukla, her iki taraftaki derinin tüm katmanlarının delinmesini sağlamak için sallanan bir hareket kullanılabilir(Şekil 1E). Her hayvan için yeni bir biyopsi yumruğu kullanın.
    5. Yaralardan yumruk biyopsileri çıkarın(Şekil 1F). Hala eki siteleri varsa çevredeki deriden yumruk serbest etmek için steril makas ve cımbız kullanın. Yara iyileşmesi analizleri için downstream planlarına göre yumrubiyopsi kontrol dokusunu gerektiği gibi işleyin (öneriler için tartışma ya da bkz.
    6. İlk yara alanını ölçmek ve analizden aykırıları ortadan kaldırmak için yara bölgelerine eşit mesafeden veya çerçevede cetvelle makroskopik fotoğraflar çekin.
    7. Onaylı bir hayvan protokolüne uygun olarak en az 24 saat analjezi uygulayın. Örneğin: Buprenorfin SR-LAB, tek doz subkutan olarak enjekte 0.5-2 mg/kg ağrı kesici 48 saat için (alternatif öneriler ve hususlar için Tartışma bakınız).
    8. Dik duruşu nu koruyana ve kafesin etrafında normal bir şekilde yürüyene kadar fareyi anesteziden çıkarken izleyin.

3. Yara sonrası izleme

  1. Araştırmacı tarafından belirlenen ve kurumsal protokollere uygun olarak deneysel uç noktalar için fareleri günlük olarak izleyin. Örnekler şunlardır: enfeksiyon, görünür kilo kaybı, ya da kambur duruş.
  2. İlk ameliyattan sonra olduğu gibi günlük makroskopik fotoğrafları kontrollü bir şekilde çekin.

4. Hasat yaraları

  1. Fareleri istenilen zamanda, onaylanmış bir hayvan protokolüne uygun olarak yaradan sonra ötenazi.
  2. Önceki fotoğraf edinimi ile tutarlı kontrollü bir şekilde yara sitelerinin makroskopik fotoğraflarını çekmek(Şekil 2A,C).
  3. Neşter kullanarak yara bölgelerinin etrafında geniş bir dikdörtgen kesin(Şekil 2D,E).
  4. Dikdörtgen doku parçasını makas ve cımbız kullanarak serbest bırakıp altta yatan dokudan deri koparın(Şekil 2F). Petri kabına yerleştirin (Şekil 2G).
  5. Yaraları hasat edin. Dikdörtgen şeklinde yaranın her tarafını çevreleyen 2 mm'lik yaralanmamış dokuyı kesin(Şekil 2H,I). Yarayı hasat etmek için alternatif seçenekler için Tartışma'ya bakın.
  6. Sonraki çalışmalar için gerekli yaraları işle. Parafin katıştırma ve histolojik analiz için fare başına en az bir yara ayırın.

5. Yara fiksasyonu ve gömme

  1. Yarayı düzeltin
    1. Yeni hazırlanmış %4 paraformaldehit çözeltisi içinde yara dokusunu oda sıcaklığında 3 saat 8'e düzeltin ve bir gecede 4 °C'ye aktarın. Elektron mikroskobu (EM) sınıfı paraformaldehit ve çözelti filtrasyonu gerekli değildir.
    2. 1x PBS 30 dakika boyunca iki kez yaraları yıkayın.
    3. PBS'yi %70 ETOH ile değiştirin ve katıştırmadan 4 °C'de saklayın. Antijen kaybını önlemek için 24-48 saat içinde veya histolojik özellikleri nin değerlendirilmesi durumunda 1-2 hafta içinde dokuları işleme.
  2. İşleme ve yara gömmek
    1. Her yarayı bir katıştırma kasetine aktarın. İşlem mürekkepleri kaldıracağı için kasetleri kaleme etiketleyin.
    2. Dokuyu el ile veya otomatik bir işlemci kullanarak, dokuyu artan etanol yüzdeleriyle susuz bırakarak, ksilen ile temizleyerek ve sonra parafin balmumu ile dokuya sızarak işleme koyun(Tablo 1).
    3. Yarayı gömme kalıbının yatay yüzeyinden 90° ("ayakta") yerleştirin(Şekil 3A,B).

6. Gün 0 yara alanı analizi

  1. NIH-Image J veya NIH-Fiji özgür yazılım (https://imagej.net/Fiji/Downloads) indirin.
  2. 0. gün yaralarının fotoğrafını içeren bir dosya açın.
  3. Analyze | altında "Alan" kutusunu işaretleyin Ölçümleri Ayarlayın.
  4. Analyze altında "Set Scale" seçeneğini belirleyin. Makroskopik ölçümler çalışmanın bir parçasıysa piksellere, bilinen ilgili mesafeye ve mesafenin birimine (= uzunluk birimi) girin veya yalnızca göreli ölçümler gerekiyorsa bu adımı atlayın.
  5. Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
  6. Yaranın çevresini ana hatlar.
  7. Analiz altında Ölçü'ye tıklayın.
  8. Yara başına hayvan başına ölçümleri takip etmek için bir elektronik tablo oluşturun.
  9. Elektronik tablodaki yara alanının ölçümlerini kopyalayın.
  10. Belirli bir deney için ortalama alanı ve tüm yaraların standart sapması hesaplayın.
  11. Histolojik analizden ortalamanın iki standart sapmadışında herhangi bir yara hariç.

7. Seri kesitleme

  1. Bir gecede parafin gömülü yara bloklarını 4 °C'de soğutun.
  2. Parafin bloğunu mikrotomun blok tutucuya yerleştirin ve yönlendirin, böylece bıçak blok boyunca düz bir şekilde kesecektir. Bloğu, dokunun 90° de "durması" ve epidermisin ve dermisin eş zamanlı olarak kesilmesine olanak sağlayacak şekilde yönlendirin(Şekil 3C,D).
  3. Her biri 7 μm 20-30 parafin bölümlerinden 2-4 şerit yapın.
  4. Kuru boya fırçası ve bir diseksiyon alay iğnesi kullanarak her bir kurdeleyi siyah plastik levha gibi sağlam ama manipüle edilebilir bir yüzeye aktarın.
  5. Her şeridin üst kısmını bir jiletle ayırın ve mikroskop slaytına yerleştirin.
  6. Hangilerinin saç folikülü yokluğunda tespit edilebilen yaralı doku, bağ dokusu nun veya epidermisin görünümündeki değişiklikler ve/veya bir yara parçasının varlığı ile tespit edilebilen yaralı doku içeren bir brightfield mikroskobu altında lekelenmemiş bölümleri gözlemleyin(Şekil 4A,B).
  7. Yara başlamadan önce 20 bölüme kadar yaraalmadan kesitler atın.
  8. Lekesiz kesitlerde yara tespit edilemeyene kadar 7.3 ve 7.4 basamakları tekrarlayarak yaranın içinden kesin.

8. Parafin bölümlerinin montajı

  1. İlk kurdeleden başlayarak her 5 bölümden biri ayrı parafin bölümleri(Şekil 3E).
  2. Mikroskop slaytlarını hem slayt numarasıyla hem de tüm bölüm numaralarını etiketle.
  3. Isliç boya fırçası ile 5 bölümden oluşan grubu alın ve onları düzleştirmek için ılık su banyosunun (40-45 °C) su yüzeyinde yüzdürün.
  4. Etiketli mikroskop kaydıraklarından birini(Şekil 3F)kullanarak su banyosundan 5 bölümden oluşan grubu seçin ve 37 °C'de 24 saate kadar bir kaydırak ısıtıcısı üzerine yerleştirin.
  5. Slaytları bir slayt kutusunda dik olarak saklayın.

9. Histolojik boyama

  1. Her 8mikroskop slaytı (her40'ına eşdeğer) hematoksilin ve eozin ile boyama rafına ve lekeye aktarın.

10. Mikroskobik görüntüleme

  1. 4x nesnel ve dijital satın alma özellikleriyle donatılmış parlak bir alan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin. Görüntünün alındığı ölçeği kaydedin.
  2. Her lekeli slayt üst bölümünün tüm yara görüntü ve her iki tarafta bazı yaralanmamış doku içerdiğinden emin olun. Yara tek bir resmin çerçevesinden daha büyükse, çakışan birden çok resim çekin.
  3. Morfometrik çözümleme için bölüm numarasını içeren dosyayı kaydedin. Aynı yaranın üst üste binen resimleri için a, b, c, vb. bölüm numarasını kullanın.

11. Morfometrik analiz

NOT: Yara birden fazla resmi kapsadığında, elektronik tabloya kaydetmek için yara bölümü başına metrik başına bir değer elde etmek için tek tek resimlerden alınan ölçümleri özetleyin.

  1. Resim J'de, lekeli bir yara resminin dijital dosyalarını açın. Analiz için dikişli resimler kullanmayın. Kapalı bırakmak ve resimden resme ölçümleri almak için yer işaretleri bularak yakınlaştırılmış çakışan resimlerüzerinde ölçümler gerçekleştirin.
  2. Ölçek ve ölçüm tercihlerini ayarlayın.
    1. Analyze altında "Set Scale" seçeneğini belirleyin. Piksellere mesafeyi, bilinen ilgili mesafeyi ve mesafenin birimini (= uzunluk birimi) girin. Ölçek pencerede görünmeli ve görüntünün elde edildiği ölçeğe karşılık gelir.
    2. Ölçeği her açık görüntü için aynı tutmak için "Global" kutusunu işaretleyin.
    3. Resim J her kapatıldığında ve yeniden açıldığında 11.2.1 ile 11.2.2 adımlarını yineleyin.
    4. Analyze | altında "Alan" kutusunu işaretleyin Ölçümleri Ayarlayın.
  3. Yara uzunluğunu ölçün
    1. Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
    2. Yaranın bir tarafındaki yaralanmamış dokunun son saç folikülünden başlayarak yaranın diğer tarafındaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülüne ölçüm yapılır(Şekil 4A,B).
    3. Bu iki simgesel yapıya ulaşmak için dermo-epidermal kavşak boyunca iz. Epidermis yaranın tamamını kaplamıyorsa, yaranın bir tarafındaki dermo-epidermal kavşağı takip edin ve göç eden dilin bittiği yerde granülasyon dokusunun üstün yönünü veya göçmen dile ulaşana kadar granülasyon dokusu ile kabuk arasındaki kavşak ve son olarak diğer taraftaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülünü takip edin(Şekil 4E,F).
    4. Analiz altında, Ölçü'yetıklayın. Ölçümün uzunluğu, ölçekte ayarlanan birimlerde görünür.
    5. Ölçümleri izlemek için bir elektronik tablo oluşturun (Ek Tablo 1).
    6. Yara uzunluğunu elektronik tabloya kopyalayın.
  4. Epidermal uzunluğu ölçün
    1. Eğer epidermis yaranın tamamını kapsıyorsa, epidermal uzunluk yara uzunluğuyla aynıdır.
      1. "Yara uzunluğu" ölçüsünü Excel elektronik tablosundaki "epidermal uzunluk" sütununa kopyalayın ve 11.5 adıma atlayın.
    2. Epidermis yaranın tamamını kaplamazsa, "Freehand seçimleri" seçeneğini seçin ve granülasyon dokusunun üstün yönünü veya granülasyon dokusu ile ilk saç folikülüne giden kabuk arasındaki kavşağı izleyen her epidermal öncü kenar arasındaki mesafeyi ölçün(Şekil 4C,D).
      1. Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
      2. Bu ölçümü yara uzunluğundan çıkarın ve Excel elektronik tablosundaki "epidermal uzunluk" altındaki sayıyı kaydedin.
  5. Yara alanını ölçün
    1. Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
    2. Yaranın bir tarafındaki yaralanmamış dokunun son saç folikülünden başlayarak yaranın diğer tarafındaki yaralanmamış dokunun ilk saç folikülüne kadar ölçüt(Şekil 4A,B,E,F).
    3. Yara tamamen epidermis ile kaplı değilse epidermisin üstün yönü boyunca iz (kabuk içermez) veya granülasyon dokusunun üstün yönü.
    4. Karşı saç folikülüne ulaşıldıktan ve yağ dokusu veya kas ulaşılıncaya kadar, saç folikülü boyunca granülasyon dokusuna dikey olarak iz sürmeye devam edin. Granülasyon dokusunun alt sınırını yaranın karşı tarafına doğru takip edin ve alanı kapatmak için saç folikülü boyunca başlangıç noktasına katılın(Şekil 4E,F).
    5. Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
    6. Yara alanını "ölçülen yara alanı" altında elektronik tabloya kopyalayın.
  6. Epidermal alanı ölçün
    1. Fiji araç çubuğunda "Freehand seçimleri" seçeneğini belirleyin.
    2. Yara tamamen epitelize ise:
      1. Karşı saç folikülüne ulaşılıncaya kadar epidermisin üstün yönü boyunca iz ve epidermis ve dermis arasındaki dermo-epidermal kavşağı takip eden başlangıç noktasına "geri dönerek" alanı tamamlamak(Şekil 4D).
      2. Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
      3. Epidermal alanı "ölçülen epidermal alan" altında Excel elektronik tablosuna kopyalayın ve adım 11.7'ye atlayın.
    3. Yara tam olarak epitelize edilmezse:
      1. Epidermisin üstün yönü boyunca önden gelene kadar iz ve dermo-epidermal kavşaktaki başlangıç noktasına geri dönün (Şekil 4C).
      2. Analiz altında, Ölçü'yetıklayın.
      3. Yaranın karşı tarafında 11.6.3.1 ve 11.6.3.2 adımını tekrarlayın.
      4. Analiz altında Ölçü'ye tıklayın.
      5. 11.6.3.2 ve 11.6.3.4 adımlarında elde edilen iki sayıyı özetleyin ve sonucu elektronik tabloda "ölçülen epidermal alan" altında girin.
  7. Her40 bölüm (her8 slayt) üzerinde 11,3 ila 11,6 adımlarını tekrarlayın.
  8. Tüm yaranın epidermal bölgesini hesaplayın.
    1. Elektronik tabloda "epidermal alan hesaplanmış" yanında "epidermal uzunluk" yanında yeni bir sütun oluşturun.
    2. "Epidermal uzunluk" sayısını, sonuncusu (7 μm kalınlığında bölüm x 40 kesit) hariç her bir bölüm için 280 ile çarpın.
    3. "Epidermal uzunluk" sayısını son bölüm için 7 ile çarpın (bölümün kalınlığı).
    4. Tüm yaranın epidermal alanını elde etmek için her bir bölüm için hesaplanan "epidermal alanın" değerini özetleyin.
  9. Tüm yaranın yara alanını hesapla.
    1. Yara uzunluğu ölçümlerini kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
  10. Tüm yaranın epidermal hacmini hesaplayın.
    1. "Epidermal alan ölçülen" ölçümleri kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
  11. Tüm yaranın yara hacmini hesapla.
    1. "Yara alanı ölçülen" ölçümleri kullanarak 11.8.1 ile 11.8.4 adımlarını tekrarlayın.
  12. Yaradaki epidermal hacim yüzdesini hesaplayın.
    1. Toplam epidermal hacmi toplam yara hacmine bölün ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpın (her bölüm için bu oranı yapmayın).
  13. Yara alanı arasındaki epidermal alanın yüzdesini hesaplayın.
    1. Toplam epidermal alanı toplam yara alanına bölün ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpın. Eğer bir yara tamamen epitelize edilmişse, bu sayı 100 olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 5, birden fazla cerrah tarafından farklı fare suşlarında üretilen ve farklı bireyler tarafından analiz edilen yabani tip yaralar üzerinde morfometrik analiz ler yaparak elde edilen ölçülen ve hesaplanan değerlerdeki aralığı gösterir. Farklı suşlardan gelen yabani fareler hem çalışmalarımızda hem de literatürde açıklandığı gibi istatistiksel farklılıklar gösterebilir9,10. Bu temsili sonuçlara dayanarak, bir çalışmada, sadece bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İki taraflı eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin birçok farklı yönünü incelemek için kullanılabilecek son derece özelleştirilebilir bir işlemdir. Bir yara iyileştirme projesi başlamadan önce, araştırmacılar belirli bir etki boyutu nda bir kusur tespit etmek için gerekli yaraların sayısını belirlemek için bir güç analizi yapmak gerekir. Literatürde tek tek farelerin veya yaraların biyolojik kopya olarak kullanılıp kullanılmadığı konusunda tutarsızlıklar mevcut, ancak yeni yapılan bir çalışma, tek bir hayvanda buluna...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

Dunnwald Laboratuarı'nın yıllar boyunca bu protokolün optimizasyonuna katkıda bulunan tüm üyelerine ve yara analizi için seri kesit kullanımını teşvik etmedeki ısrarı yaratılmasını mümkün kılan Gina Schatteman'a minnettarız. Bu çalışma NIH/NIAMS'tan Martine Dunnwald'a (AR067739) yapılan fonla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%100 etanol
%70 etanol
%80 etanol
%95 etanol
Alkol HazırlamaNOVAPLUSV9100%70 İzopropil alkol, steril
Amonyum hidroksit
Biyopsi pedleriHücre yolu22-222-012
Siyah plastik levhaBir kağıt yaprağının boyutu hakkında sağlam ancak manipüle edilebilir bir şey
Brightfield mikroskobuDijital alım yetenekleri ve 4X objektif ile
Pamuk uçlu aplikatörler
Lameller22 x 60 # 1
Dijital kameraVarsa ölçek için bir cetvel ekleyin
Diseksiyon alay iğnesi (düz)
Gömme kalıpları22 x 22 x 12
Gömme halkalarıSimport Scientific Inc.M460
Eosin Y Buzlu
asetik asit
Saç kesme makinesi
Isıtma yastığıConairNemli kuru Isıtma Yastığı
Hematoksilen
Mikrotom Mikrotom
bıçakları
Boya fırçaları
Parafin Tip 6
Paraformaldehit
Permount
Fosfat tampon çözeltisi (PBS)
Povidon-iyotAplicare82-255
İşleme kasetiSimport Scientific Inc.M490-2
Tıraş bıçaklarıASR.009
Neşter bıçakları #10
Neşter sapı
Ameliyat için sterilcerrahi makas
Cilt biyopsisi yumruklarıAraştırmacı tarafından belirlenen boyut
Slayt kutuları
Slayt ısıtıcıları
Süper buzlu mikroskop slaytlarıFisher Scientific22 037 246
Sıcaklık kontrollü su banyosu
Doku gömme istasyonuMinimum parafin dağıtıcısı ve soğuk plaka
Doku işlemcisiMinimum vakum pompalı fırın
Üçlü antibiyotik oftalmik merhem
cımbız, cerrahi cımbız için kavisli uçsteril
ameliyat içinkonik uç
WypAll X60Kimberly-Clark34865
Dental balmumu levhaları Düzenli Hizmetkeskin, steril

Kaynaklar

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040(2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Histolojik Morfometrik AnalizSeri Kesit AlmaEpidermal Alan l mYara Hacmi HesaplamasTam Kat YaralarBiyopsi Punch Tekni iG r nt leme ProgramEpidermal Hacim Ekstrapolasyonu

İlgili makaleler