Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde Pseudomonas aeruginosa'nın erken tespiti ve eradikasyonu, kronik enfeksiyon gelişme şansını azaltabilir. Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlarının gelişimi, akciğer fonksiyonlarında azalma ve artmış morbidite ile ilişkilidir. Bu nedenle, pediatrik hastaların yaklaşık %10-40'ında görülen antibiyotik tedavisi ile P. aeruginosa'nın eradike edilememesinin nedenlerinin aydınlatılmasına büyük ilgi vardır. P. aeruginosa'nın konakçı klirensini ve antibiyotik duyarlılığını etkileyebilecek birçok faktörden biri, mekansal organizasyondaki (agregasyon veya biyofilm oluşumu gibi) ve polisakkarit üretimindeki farklılıklardır. Bu nedenle, KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın in situ özelliklerini görselleştirmek istedik. Balgam örneklerine, konakçı hücrelere göre 3 boyutlu yapıları korumak için örnekleri bir hidrojel matrisine gömdükten sonra bir doku temizleme tekniği uygulandı. Doku temizlendikten sonra, görselleştirmeye izin vermek için floresan etiketler ve boyalar eklendi. Bakteri hücrelerinin görselleştirilmesi için floresan in situ hibridizasyon, ekzopolisakkaritin görselleştirilmesi için floresan etiketli anti-Psl-antikorlarının bağlanması ve yapısal içgörü elde etmek için konakçı hücreleri boyamak için DAPI boyama gerçekleştirildi. Bu yöntemler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verdi.
Giriş
Bu çalışmada, pediatrik kistik fibrozis (KF) hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın in vivo yapısını görselleştirmek için deneyler tasarlanmıştır. P. aeruginosa enfeksiyonları pediatrik KF popülasyonunun% 30-40'ında kronikleşir; Kronik enfeksiyonlar bir kez yerleştikten sonra, ortadan kaldırılması neredeyse imkansızdır1. Erken enfeksiyonu olan hastalardan P. aeruginosa izolatları genellikle antimikrobiyallere daha duyarlıdır, bu nedenle bunlar kronik enfeksiyonun oluşmasını önlemek için anti-psödomonal antibiyotiklerle tedavi edilir2. Ne yazık ki, tüm P. aeruginosa izolatla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve saklanması için Araştırma Etik Kurulu (REB) onayı gereklidir. Burada sunulan çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.
1. Balgam Toplama
- Balgam söktürücü balgamı steril bir toplama kabında saklayın ve fiksasyondan hemen önce en fazla 24 saat 4 °C'de saklayın.
NOT: Balgamı fiksasyon olmadan 4 ° C'de çok uzun süre bırakmak, hücresel bozulmaya, özellikle beyaz kan hücrelerinin bozulmasına neden olabilir. Mümkün olan en kısa sürede sabitleme tercih edilir. - Balgam örneklerini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Balgam örnekler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deneyin genel tasarımı Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Şekil 1 , balgam işleme ve balgam temizleme protokollerinin bir özetini sağlar. Balgam işleme ve temizleme 17 güne kadar sürebilir. Bununla birlikte, protokol durdurulabilir ve numuneler PFA ile fiksasyondan sonra (2. gün) veya doku temizliğinden sonra (temizleme süresine bağlı olarak 5-17. günler) saklanabilir. Şekil 2'de FISH ve antikor bağla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün amacı, KF hastalarından balgamda P. aeruginosa hücrelerinin in-situ organizasyonuna bir bakış sağlamaktır. Balgam örnekleri, hemen sabitlenemiyorlarsa işlenene kadar 4 °C'de saklanmalıdır. Balgamdaki P. aeruginosa hücre sayılarının, 4 °C'de saklandığında 1 saat, 24 saat veya 48 saatte işlenirse önemli ölçüde değişmediği, ancak 24 veya 48 saat boyunca 25 °C'de bırakılırsa, bakteri büyümesinin bir sonucu olarak bakteri hücre sayılarının önemli ölçüde artacağı gösterilmiştir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiç kimse.
Teşekkürler
Yazarlar, bu araştırma için fon sağlayan Kistik Fibrozis Vakfı'na ve cömert anti-Psl0096 antikor bağışları için MedImmuno'ya teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma için görüntüleme, Toronto Üniversitesi'ndeki CAMiLoD görüntüleme tesisinde gerçekleştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 29:1 akrilamid bisakrilamid, %30 çözelti | BioRad | 161-0146 | |
| 8 Odacıklı Kapak Camı Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfüzyon odaları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| RNA Rnaz İnhibitörü Sigma | R7387 | ||
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Sipariş Detayları: Ürün: Modifiye DNA Oligo; İsim: PseaerA; Sıra: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Sentez: 50 nmol; Arıtma: HPLC; Gemi durumu: Tam verim (kuru) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Psl0096-Texas kırmızı antikorları, Medimmune tarafından nazikçe sağlanan bir hediyeydi ve sipariş sorguları için şirketle iletişime geçilmelidir. | |
| VA-044 Sertleştirici | Wako | 27776-21-21 |
Kaynaklar
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
