In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirmek için zor, kolayca erişilebilen beyin bölgelerinde bile. Tek hücreli çözümlü deneylerin teknik zorlukları, beynin derinliklerinde bulunan bazı nöron popülasyonlarında veya canlı hücreleri bulmak için genetik araçlar gerektiren mekansal olarak dağınık popülasyonlarda (örn. optrode kaydı yla eşleştirilmiş kanaloidofinin genetik ekspresyonu) veya site etiketlemesinden sonra post-hoc histokimyasal tanımlamada (örn. nörotransmisyona özgü belirteçlerle) daha da artırılır. Beyin sapı ventral yüzeyine yakın diffüz bulunan olmak, medial olivocochlear (MOC) nöronlar yukarıdaki sınırlamalar muzdarip¹, onları in vivo deney için erişim son derece zor hale.

Beyin dilimleri (~ 100-500 μm kalınlığı) uzun beyin devreleri çalışmak için kullanılmıştır, işitsel beyin sapı devredahil, aynı dilim içinde bulunan bağlı nöronların fiziksel ayrımı nedeniyle^2,3,4,5,^6,7,^8,9. Çok daha kalın dilimler (>1 mm) kullanarak deneyler, ikili girdilerin medial superior zeytin^10,11dahil olmak üzere üstün olivary kompleksi (SOC) alanlarında nasıl entegre olduğunu anlamak için diğer laboratuvarlarda kullanılmıştır. Bu dilimler, işitsel sinirin aksonlari (AN) dilim içinde bozulmadan kaldı ve cn sinaptik nörotransmitter salınımını başlatmak için elektriksel olarak uyarıldı, ilk derecede işitsel nöronların aktivitesini taklit olarak sese tepki verecekti. Bu kalın dilimlerin en büyük dezavantajlarından biri yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar ("yama") için nöronların görünürlüğüdür. Bu alanda çok sayıda akson yaş 12 ile miyelinated hale olarak Patching giderek daha zor halegelir^13,14,15, doku optik yoğun hale ve tipik bir, ince beyin dilimi bile nöronlar gizleme. Amacımız in vivo kayıtların devre bağlantısına daha çok benzeyen, ancak beyin dilimlerinde görsel güdümlü yama-kelepçe elektrofizyolojisinin yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü kayıt yetenekleriyle in vitro preparatlar oluşturmaktır.

Laboratuvarımız, MOC nöronları da dahil olmak üzere işitsel efferent sistemin nöronların fizyolojisini araştırır. Bu kolinerjik nöronlar dış saç hücrelerinin aktivitesini modüle ederek koklea efferent geribildirim sağlamak (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Önceki çalışmalar da bu modülasyon koklea²¹,^22,23^,24,25,26 ve akustik travma^{27,28,29,30,31,32,33}de kazanım kontrolü bir rol oynadığını göstermiştir . Farelerde, MOC nöronlar diffüz yamuk vücudun ventral çekirdeğinde yer almaktadır (VNTB) işitsel beyin sapı^1. Grubumuz epifloresan aydınlatma altında beyin sapı dilimleri MOC nöronlar hedef tdTomato muhabiri fare hattı ile geçti ChAT-IRES-Cre fare hattı kullanmıştır. Biz MOC nöronlar trapez vücudun ipsilateral medial çekirdeğinden afferent inhibitör girdi almak gösterdi (MNTB), hangi heyecanlı, sırayla, küresel gür hücrelerden akson tarafından (GBC) kontralateral koklear çekirdeği (CN)^{34,35,36,37,38}. Ayrıca, MOC nöronlar büyük olasılıkla kontralateral CN^39,40,41T-stellat hücrelerinden uyarıcı giriş alırsınız. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MOC nöronlar aynı (kontralateral) kulak tan türetilen hem uyarıcı ve inhibitör girdileri almak göstermektedir. Ancak, presinaptik nöronlar, ve MOC nöronlar üzerinde yakınsama aksonları, oldukça tipik bir koronal dilim hazırlanmasında tam olarak bozulmamış olması için birbirlerine yeterince yakın değildir. Sinaptik girdilerin MOC nöronlarına entegrasyonunun eylem potansiyeli ateşleme kalıplarını nasıl etkilediğini araştırmak için, yeni tanımlanan inhibisyona odaklanarak, bir kulaktan MOC nöronlarına kadar olan çeşitli afferentleri fizyolojik olarak en gerçekçi şekilde uyarabileceğimiz, ancak in vitro beyin dilimi deneylerinin teknik yararları ile birlikte bir hazırlık geliştirdik.

Kama dilimi, MOC nöronlarında devre entegrasyonunun araştırılması için tasarlanmış değiştirilmiş kalın bir dilim hazırlığıdır (Şekil 1A'daşematize). Dilimin kalın tarafında, kama işitsel sinir kopmuş aksonlar içerir (bundan sonra "işitsel sinir kökü" olarak adlandırılır) onlar CN çevre ve sinaps gelen beyin sapı girerken. İşitsel sinir kökü elektriksel nörotransmitter salınımı ve tamamen bozulmamış CN hücrelerinin sinaptik aktivasyon uyandırmak için uyarılmış olabilir^{42,43,44,45,46}. Bu stimülasyon biçimi devre analizi için çeşitli faydaları vardır. İlk olarak, MOC nöronlarına afferent girdi sağlayan T-stellat ve GBC aksonları doğrudan uyarmak yerine, CN'de bol miktarda bulunan içsel devrelerin aktivasyonuna izin vermek için AN'yi uyarıyoruz. Bu devreler beyin boyunca hedeflerine CN nöronların çıkış modüle, MOC nöronlar dahil^{46,47,48,49,50,51}. İkinci olarak, AN'den MOC nöronlarının CN upstream'ine kadar olan afferent devrelerin polisinetik aktivasyonu, işitsel stimülasyon sırasında in vivo olduğu gibi daha doğal aktivasyon zamanlaması na ve plastisitenin bu sinapslarda oluşmasına olanak sağlar. Üçüncü olarak, an aktivitesini taklit etmek için stimülasyon kalıplarımızı değiştirebiliriz. Son olarak, MOC nöronlar için hem uyarıcı ve inhibitör monaural projeksiyonlar kama dilim bozulmamış, ve bunların entegrasyonu yama-kelepçe elektrofizyoloji hassasiyeti ile bir MOC nöron ölçülebilir. Bir bütün olarak, bu aktivasyon şeması tipik bir beyin dilimi hazırlık ile karşılaştırıldığında MOC nöronlar için daha sağlam bir devre sağlar. Bu beyin sapı kama dilimi de lateral superior zeytin, üstün oliyum çekirdeği ve medial üstün zeytin^{10, 11,52,53,54,55,56}dahil olmak üzere ipsilateral MNTB inhibitör girdi almak diğer işitsel alanları araştırmak için kullanılabilir. Bizim özel hazırlık ötesinde, bu dilimleme yöntemi kullanılabilir veya uzun menzilli girdilerin bağlantı bakımı ve tek hücreli çözünürlükte elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri çeşitli nöronların görselleştirme iyileştirilmesi yararları ile diğer sistemleri değerlendirmek için değiştirilebilir.

Bu protokol yaklaşık 15 ° yatırılabilir bir vibratom sahne veya platform kullanımını gerektirir. Burada "sahne" bir içbükey manyetik "sahne tabanı yerleştirilir kavisli bir alt ile metal bir disk olduğu bir ticari olarak kullanılabilir 2 parçalı manyetik sahne kullanın." Daha sonra dilim açısını ayarlamak için aşama kaydırılabilir. Sahne tabanındaki eşmerkezli daireler açıyı tekrarlı olarak tahmin etmek için kullanılır. Sahne ve sahne tabanı dilimleme odasına yerleştirilir, burada manyetik sahne tabanı da döndürülebilir.

Tüm deneysel prosedürler Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından onaylandı.

1. Deneysel preparatlar

NOT: Dilimleme çözeltisi, dilimleme sıcaklığı, dilim kuluçka sıcaklığı ve aparatlar (vb.) dahil olmak üzere dilim hazırlama ile ilgili ayrıntılar bu deneyde yapılan beyin sapı hazırlığı için özeldir. Dilim kuluçka detayları laboratuvar deneyimi başına değiştirilebilir.

1. Yama bağlama için dahili çözümler hazırlayın.
   1. (mM' de) 76 Cs-methanesulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl_2,1 CaCl_2,10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na₂-fosfokreatin, 5 QX-314 ve 0.01 Alexa Flor-48 8 hidraziti içeren voltaj kelepçesi çözeltisi hazırlayın. CsOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
   2. (mM) 125 K-glukonat, 5 KCl, 1 MgCl_2,0.1 CaCl_2,10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na₂-fosfokreatin ve 0.01 Alexa Fluor-488 hidraziyonu içeren akım kelepçe çözeltisi hazırlayın. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
2. 100 mL sıcak (kaynamaya yakın) suya 4 g agar ekleyerek %4 agar 100 mL hazırlayın. Isıtılmış karıştırın plaka üzerine yerleştirin sıcaklığını korumak ve tamamen eriyene kadar karıştırın. Yaklaşık 1 cm derinliğe 100 mm plastik Petri kapları dökün ve soğumaya bırakın. İhtiyaç duyulana kadar buzdolabında bekletin.
3. Hazırlamak 1 L yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) mM içeren: 124 NaCl, 1.2 CaCl₂, 1.3 MgSO₄, 5 KCl, 26 NaHCO₃, 1.25 KH₂PO₄, ve 10 dekstroz. En az 10 dakika karbogen (%5 CO₂ / %95 O₂₎ile kabarcık, sonra gerekirse 1 M NaOH ile 7,4 için son pH ayarlayın. Deney boyunca karbogen ile sürekli köpürerek çözeltinin oksijenasyonunu ve pH'ını koruyun.
4. ACSF'ye 1 mM kynurenic asit ekleyerek 200 mL dilimleme çözeltisi hazırlayın. Kinenik asit eriyene kadar 10 dakika boyunca sonicating su banyosunda sonicate çözeltisi. Sürekli karbogen ve buz üzerinde yer ile kabarcık.
   DİkKAT: Kinenik asit kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
5. Üreticinin talimatlarına uygun bir bıçağı vibratome monte edin. Buz ile çevreleyerek chill vibratom dilimleme odası.

2. Stimülasyon için sağlam işitsel sinir kökü ile beyin kaldırma

NOT: Bu deneyler için fareler, C57BL/6J arka plan üzerinde ChAT-IRES-Cre transgenik farelerin tdTomato muhabiri fareler (Ai14) ile geçerek elde edilmiştir. Histoloji ve elektrofizyoloji için kullanılan fareler, farelerde P12 civarında olan işitme sonrası başlangıçlı (P14-P23) idi. Yamuk vücudun ventral çekirdeğinde tdTomato ifade nöronlar (VNTB) daha önce bu fare hattı MOC nöronlar olarak karakterize edilmiştir⁵⁷.

1. Ötenazi (örneğin, CO₂ boğulma) ve onaylanmış kurumsal prosedürleri kullanarak hayvanın kafasını kesmek.
2. Bir jilet kullanarak, burundan boynun arkasına kafatasının orta ucundaki deriyi kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için derisini soy.
3. Küçük makas kullanarak, kafatasının tabanından başlayarak (omurilik yakın kaudal uç) ve burun doğru devam orta hat üzerinden kafatasında bir kesi yapmak.
4. Lambda sütür de, orta hattan kafatasında kesikler yapmak, her iki tarafta kulak doğru yanal. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını soy.
5. Rostral ucundan başlayarak, yavaşça küçük bir laboratuvar spatula veya künt forseps ile kafatası ndan beyin kaldırın. Optik sinir ivedi ve yavaşça geriye doğru beyin çalışmaya devam, ventral yüzey açığa.
6. Beyin sapının ventral yüzeyine yakın ince forceps ile çimdikleyerek trigeminal sinirleri kesin.
   NOT: Vestibulocochlear sinir hemen altında yatıyor ve nihai stimülasyon için bozulmamış olması gerekir gibi dikkatle bunu yapın.
7. Soğuk dilimleme çözeltisi ile dolu bir cam Petri kabına hazırlık yerleştirin. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin. Yavaşça carbogen ile kabarcık.
8. Yüz sinirini beyin sapına yakın kırpın ve vestibulocochlear siniri ortaya çıkar.
9. İnce forseps kullanarak, vestibulocochlear sinir mümkün olduğunca kafatası çıkar ve onu kesmek için sinir çimdik, beyin sapı bağlı sinir kökü bırakarak foramina içine ipuçlarıit. Bunu diğer tarafta tekrarlayın.
10. Bir kez her iki sinir kökleri serbest, menineler ve yamuk vücut yakınındaki beyin sapı ventral yüzeyinden vaskülatür kaldırın.
11. Kalan kranial sinirleri ve mümkünse kalan omuriliği korumak için dikkat bağlanan bağ dokusunu çimdikleyerek beyni kafatasından tamamen kurtarın.

3. Blok ve sahnede beyin monte (manyetik disk)

1. Optik kiazma düzeyinde beyin engelleyerek sahneye düzeltmek için beyin yüzeyini hazırlayın.
   1. Ventral yüzey yukarı ile, yavaşça beyin aşağıdaki adım sırasında eğim yok, böylece omurilik hareketsiz leştirmek için künt bir araç kullanarak beyin stabilize.
   2. Optik kiazma düzeyinde, çanak altına aşağı beyin yoluyla ekleyerek beyin engelleme için düzlem oluşturmak için açık forseps kullanın. Uçların beyin kaudalinin dorsal yüzeyinden optik kiazma çıkması için uçları dikeyden yaklaşık 20° bir açıyla yerleştirin.
   3. Jilet kullanarak forceps boyunca kesin.
2. Beyni sahnenin yüzeyine yapıştır.
   1. Beyni desteklemek için %4 agarlık küçük bir blok (~1 cm³⁾hazırlayın.
   2. Sahnede tutkal küçük bir damla yerleştirin ve hem beyin ve agar blok aşağı yapıştırılmış olabilir, böylece bir dikdörtgen içine yayıldı.
   3. Forseps kullanarak, dikkatle beyin kaldırın ve nazikçe bir kağıt havlu kenarı kullanarak aşırı sıvı dab. Tutkal üzerine bloke yüzey yerleştirin, ventral yüzey dilimleme sırasında bıçak doğru olacaktır.
   4. Agar bloğunu, dilimleme sırasında desteklemek ve uygun beyin konumlandırmasını sağlamak için beynin sırt yüzeyine hafifçe bastırın (yani açı).

4. Dilim beyin kama dilimi oluşturmak için

NOT: Kalın tarafında koklear sinir kökü ve medial olivokoklear (MOC) nöronlar ve ince tarafta trapez cisim (MNTB) medial çekirdeği olan vibratom kullanarak bir beyin dilimi hazırlayın.

1. Manyetik diski bağlı beyinli bir şekilde sahne tabanına yerleştirin ve bıçağın mendil yüzeyi ile dilimleme odasına yerleştirin.
2. Buz soğuk dilimleme çözeltisi ve karbogen ile kabarcık ile oda doldurun.
3. Bıçağı çözeltinin içine indirin ve dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için ilgi çeken bölgeye dilimler kesin. Dilimler asimetrik görünüyorsa, simetri elde etmek için sahneyi hafifçe yatırın.
   NOT: 0.05-0.10 mm/s arasındaki bıçak hızları sağlıklı dilimlerin kesilmesinde etkili olup hayvan yaşına ve beyin bölgesine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
4. Dilimler simetrik olduktan sonra, sahneyi ~15° (sahne tabanında yaklaşık 3 eşmerkezli halkaya karşılık gelen) bir tarafa kaydırın.
   NOT: Aşamayı dilimde korumak istediğiniz işitsel sinir kökünden uzaklaştırın.
5. İşitsel sinir kökü bir tarafta yüzeye yakın olana kadar dikkatlice dilimleme devam, ve yüz sinir diğer tarafta yüzeyinde görülebilir.
6. Sahneyi 15° geriye, orijinal konuma kaydırın.
7. Bıçağı dokudan uzaklaştırın ve sahne tabanını 90° döndürün, böylece ince tarafın yanal kenarı bıçakla karşı karşıya dır. Bıçağı birkaç yüz mikron indirin ve bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırın. Bıçak lateral kenarına değene kadar bunu tekrarlayın. Bıçağı dilimin ince kenarının istenilen kalınlığına indirin, burada iki yüz mikron daha.
   NOT: Elde edilen dilim ideal ~ 300 mm kalınlığında yamuk vücut ventral çekirdeği düzeyinde (VNTB) yama sıkma gerçekleşecek tarafında.
8. Bıçağı dokudan geri hareket ettirin ve sahne tabanını geri döndürün, böylece ventral yüzey ona bakacak.
9. Kama diliminin rostral yüzeyini belirleyen kesimi yapın. Dilimi bir arayüz kağıdına (1 cm²) kaudal yüzeye aktarın. Dilimi kuluçka odasına veya kurtarma için uygun diğer kuluçka cihazlarına taşıyın (35 °C'de 30 dk).
   NOT: Yüz siniri, dilimin her iki hemisferinde rostral yüzeyde görülmelidir (Bkz. Şekil 1B).

5. Elektrofizyoloji kurulumu ve kaydı

1. Kama dilimini kayıt odasına yerleştirin ve bir arp veya sabitleme sistemi yle sabit dilim. 7-10 mL/dk hızla karbogen ile kabarmış sıcak (35 °C) ACSF ile sürekli olarak dokuyu perfüzyon.
2. Yama kelepçesi kayıtları için 561 nm emisyon filtresi ile epifloresans kullanarak VNTB'de genetik olarak etiketlenmiş MOC nöronlarını tanımlayın. Yama lanabilir hücre yoksa dilim çevirin.
3. DIC optik kullanarak, dilimin kalın tarafında işitsel sinir kökü odaklanmak ve bipolar tungsten uyarıcı elektrot aşağı işitsel sinir kökü ve yavaşça doku yüzeyine taşımak için bir mikromanipülatör kullanın.
   NOT: Emme elektrotları diğer laboratuvarlarda işitsel sinir stimülasyon deneylerinde kullanılmıştır. Teta cam elektrotlar, ya da optik stimülasyon yöntemleri diğer özel preparatlar için varsa uygulanabilir.
4. Yama kıskaç elektrofizyolojisi için hedef bir MOC nöron seçmek için VNTB geri görüş alanı taşıyın.
5. Bir kayıt pipetini önerilen deneme için uygun dahili çözümle doldurun.
6. Tüm hücre konfigürasyonunda MOC nöronundan yama ve kayıt. Gerekirse membran kapasitansını ve seri direncini dengeler.
7. MOC nöron tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın.
   NOT: Stimülasyon elektrotunu hareket ettirmek gerekebilir.
8. MOC (voltaj kıskacı) veya etki potansiyel desenleri (akım kelepçesi) uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokolleri çalıştırın.
   NOT: Kama dilimi hazırlama gevşek yama kayıtları, farmakoloji, optogenetik, kalsiyum görüntüleme, nörotransmitter uncaging, vb gibi herhangi bir tipik yama-kelepçe araçları ile kullanılabilir.

6. Beyin sapı çekirdeklerinin histolojik teyidi

NOT: Bu sabit, yeniden kesitli kama dilim, cresyl menekşe boyama ile yapılır. Bu yöntem, dilimde bulunan çekirdeklerin görselleştirilmesine olanak sağlar.

1. Bir kama dilimi hazırladıktan sonra, bir gecede dilimin fiksatife batırılmış (PBS'de %4'ü PFA). PBS 10 dakika (bir shaker üzerinde oda sıcaklığında) için dilim 3x durulayın, sonra kriyokoruma kıvrak 4 ° C'de bir gecede PBS% 30 sakaroz yerleştirin.
2. Dilimi dondurucu bir mikrotom (40-70 mm) üzerine yeniden bölve PBS'de 24 kuyuplakasında seri bölümler toplayın.
3. Jelatin kaplı slaytlar üzerine montaj bölümleri ve tamamen kurumasını bekleyin. Slaytları slayt taşımaya yerleştirin.
4. Cresyl menekşe solüsyonları hazırlayın
   1. 500 mL dH₂O'da 5 g cresyl violet asetat karıştırarak %1 krem menekşe asetat hazırlayın
   2. İlk olarak 90 mL çözelti A (540 mL buzul asetik asit + 89,46 mL dH₂O) ve 10 mL çözelti B (10 mL dH₂O'da 136 mg sodyum asetat) hazırlayarak asetat tamponu hazırlayın. A solüsyonu A ve b çözeltisini birleştirerek asetat arabelleği verir.
   3. Asetat tampon% 0.5 krem menekşe için asetat tampon 1:1 ile% 1 tere mor asetat birleştirin. Kullanmadan önce filtreuygulayın.
   4. Uygun dH₂O hacimleri ile %100 etanol seyrelterek %95 ve %70 etanol hazırlayın
5. Terezil menekşe boyama protokolü uygulayın. Slayt taşıyıcısını çözelti tepsileri arasında taşıyın, fazla çözeltiyi tepsiler arasında kağıt havlu üzerinde lekeleyin: ksilen – 5 dk; %95 etanol – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; dH₂O – 3 dk; % 0.5 krem menekşe çözeltisi – nükleer boyama koyu mor hale dönene kadar sık sık 8-14 dk izleme; dH₂O – 3 dk; %70 etanol – 3 dk; %95 etanol – 1-2 dk; % 100 etanol - iki kez slaytlar daldırma; ksilen – 5 dk; ksilen: montaj yapılana kadar 25 dk.
   DİkKAT: Sadece bir duman başlık altında ksilenes kullanın.
6. Slaytları teker teker ksilenden çıkarın ve hemen montaj ortamını kullanarak slaytlara kapak fişleri yerleştirin. Montaj ortamının kurumasını bekleyin (bir gecede).
7. Görüntü bölümleri.

7. Canlı, sabitlenmemiş dokuda aksonun anterograd takibi için biyositin etiketleme

1. Yukarıdaki gibi bir kama dilimi hazırlayın (Adımlar 2-4).
2. Dilimi arayüz kağıdına aktarın (~1 cm²). Bir kesme mikroskobu altında, dilimin kalın tarafında CN yerini.
3. ACSF'yi dokudan uzaklaştırmak için bir kağıt mendil ini bükerek dilimin çevresindeki alandaki fazla ACSF'yi dikkatlice çıkarın. Bu cn dışında hücrelere alımına yol açabilir dilimin çevre bölgelerine yayılmasını biyositin önler.
4. İnce çerkediklerle, küçük bir biyositin kristali seçin ve CN'nin yüzeyine yerleştirin. Nazikçe nöronların temas ve somata içine sonraki alımı teşvik etmek için doku içine kristal basın. Bu durumda T-stellat ve GBC nöronlar içeren CN bölgeleri, ilgi istenilen bölgeyi kapsayacak şekilde bu adımı tekrarlayın.
5. Dilimi kuluçka odasına yerleştirin. Biyositin alımı ve taşınması için dilimin 35 °C'de 2-4 saat kuluçkaya yatırmasını bekleyin. Kuluçkadan sonra, herhangi bir biyosit inparçacıklarını çıkarmak için acsf dilim durulamak.
6. Bir gecede dilimi fiksatife (PBS'de %4 PFA) yerleştirin. PBS 10 dakika için 3x durula.
7. 4 °C'de veya dilim batana kadar PBS'de %30 sakarozda kriyokoruma dilimi.
8. 70-100 mm dondurucu bir mikrotom üzerinde enine kesitler üretmek için dokuyu rezeksiyon.
9. Bir floresan konjuge streptavidin ile standart immünohistokimyasal yöntemler kullanarak doku süreci.
   NOT: Presinaptik hücre cisimlerinin, aksonlarin, reseptörlerin veya devre görselleştirmesi için önemli olan diğer sinaptik moleküllerin etiketlenmesinde yardımcı olunması durumunda bölümlere ek immünohistokimya yapılabilir (örn. primer antikor basamakları biyositin sekonder görüntülemesini olumsuz etkilememelidir).
10. Dokuyu görüntüle.

Kama diliminin histolojik incelemesi
İşitsel beyin sapı nöron fonksiyonunun araştırılması için, kama dilimi hazırlığı, kayıtlar için hedeflenen MOC nöronların işitsel sinir kökü ve CN kontralateralini içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1B'degösterilen örnek dilim). Preparatın ilk histolojik incelemesi, dilimin devre aktivasyonu için gerekli çekirdekleri içerdiğini ve aksonal projeksiyonların sağlam olduğunu doğrulamak için önemlidir. CN içinde iki hücre tipleri MOC nöronlar için ses bilgisi sağlar. T-stellat hücreleri MOC nöronlar için uyarıcı giriş sağlamak için hipotez vardır39,40,41,58. Küresel gür hücreler (GBC) kontralateral hemisfer (Held sinaps özel kaliks yoluyla) MNTB nöronlar heyecanlandırmak34,36,37,38,59,60 hangi, sırayla, MOC nöronlarinhibitör giriş sağlamak 57 (şematik Şekil 1A). Hem T-stellat hücrelerinin hem de GBC'lerin varlığını doğrulamak için, %4 PFA'da daldırma ile sabitlenen ve somata etiketine cresyl violet boyama yapılan bir kama dilimini (50 μm'ye) yeniden bölümledik. Kama diliminin kalın tarafında(Şekil 2, sol hemisfer), CN neredeyse tam rostro-kaudal ölçüde mevcuttu. Ayrıca CN'nin dorsal ve ventral alt bölümleri sağlamdı(Şekil 2; S19'da ok ve ok ucu). T-stellat nöronlar ve GBCs küme ventral koklear çekirdeği yakınında nerede işitsel sinir(Şekil 2; S17 ok) CN61girer,62,63,64,65. Kama dilimi ayrıca kayıtların yapıldığı MOC nöronlarına MNTB ipsilateral nöronları içerir (orijinal kama diliminin ince yarımküresi, Şekil 2'desağ tarafı). Bu, MOC nöronların inhibitör girişinin en azından bir kısmının sağlam olduğunu doğrular(Şekil 2, dilimler 1-15, S11'de kesik ovallerle vurgulanır).

Ayrı deneylerde, CN nöronlarının aksonların ve presinaptik terminallerinin biyositinle anterograd etiketleme kullanılarak kama diliminde sağlam olduğunu doğruladık. İlk olarak, canlı kama dilimi hazırlandı ve arayüz kağıda yerleştirildi. Kama dilimihazırlandıktan hemen sonra, biocytin kristalleri cn yerleştirildi ve bu da kuluçka döneminde akson boyunca alım ve anterograd taşınmasına izin verdi. Daha sonra dokunun sabitlenmesi ve yeniden kesilmesi (70 mm kesitler) yapıldı. Biyositin ile etiketlenmiş aksonları görselleştirmek için floresan olarak etiketlenmiş streptavidin içeren kesitlerin boyanması yapıldı. Bu bölümlerin konfokal görüntüleri, kristallerin yerleştirildiği ve hücre gövdelerine götürüldüğü CN'de parlak etiketleme yi göstermektedir(Şekil 3A, sol hemisfer, kesik alan). Ventral akustik stria boyunca CN'den çıkan aksonların(Şekil 3A, beyaz ok uçları) açıkça etiketlenmiş ve sonlandırma noktalarına kadar takip edilebilmiştir. Kontralateral MOC nöronlarını çevreleyen biyositin-pozitif puncta, hazırlığımızın CN kaynaklı sinaptik kontamı koruduğunu göstermektedir (Şekil 3B). Aynı şekilde, kontralateral MNTB'de tutulan klüksin etiketlenmiş közler, GBC'lerden MNTB nöronlarına yansıtılan aksonların kama diliminde korunduğunu göstermektedir(Şekil 3C). Bu histolojik incelemeler, kama dilimimizin hem hücre cisimlerini hem de MOC nöronlarına afferent giriş devresinin aksonal projeksiyonlarını içerdiğini doğrular, bu nedenle, işitsel sinirin uyarılması ve artan devreler aracılığıyla aktivitenin daha sonra yayılması ile uyarılmış postsinaptik yanıtları ölçmemizi sağlar.

Kama diliminde sinaptik fizyoloji
Uyarıcı ve inhibitör sinaptik girdilerin entegrasyonu nöronal aktiviteyi kritik şekilde şekillendirir. Yakın zamanda MNTB57nöronlarından MOC nöronlarıninhibitör girdileri açıklanan , ancak MOC nöron aktivitesi üzerinde uyarıcı girişleri ile bu girdilerin entegrasyonunun etkisi bilinmemektedir. ChAT-IRES-Cre x tdTomato fareden bir kama diliminde, voltaj-kelepçe kayıtları bir MOC nörondan yapıldı. Akım, presinaptik aksonların nörotransmitter salınımını uyandırmak için bir uyarıcı izolasyon ünitesi tarafından yönlendirilen bipolar tungsten uyarıcı elektrot ile uygulandı. İlk olarak orta hattaki ventral akustik stria (VAS) t-stellat aksonları doğrudan aktive etmek için elektriksel olarak uyarıldı ve MNTB nöronları GBC akson stimülasyonu(Şekil 4A)ile aktive edildi, tipik ince dilim deneylerini taklit eden bir kayıt yapılandırmasında sinaptik tepkilerin gecikmesini ölçmek için(Şekil 4B),örnek izler, gri, potansiyel -60 mV tutun. Ayrı deneylerde, işitsel sinir kökü monaural artan devreleri aktive etmek için uyarılmış ve post-sinaptik yanıtları yukarıda açıklandığı gibi MOC nöronlarda ölçüldü. Her iki yerde de elektriksel stimülasyon hızlı-elektriksel bir artifakı ve ardından çok tepeli akım yanıtlarını çağrıştırdı (Şekil 4C'dekiAN stimülasyonundan alınan örnek tepkiler , siyah izler, potansiyel -60 mV' tutma). VAS'ın doğrudan uyarılmasıyla uyarılanan ilk postsinaptik akımın (PSC) başlangıç gecikme ölçümlerini, işitsel sinir stimülasyonu ile uyarılmış olanlarla karşılaştırdık ve AN stimülasyon olaylarına önemli ölçüde daha uzun bir gecikme gecikmesi bulduk. Bu, AN/CN sinaps (AN stimülasyon: 5,27 ± 0,43 ms, ortanca ± ortanca mutlak sapma (MAD), aralık 4.26-5.93 ms, n = 8; VAS stimülasyon: 1.98 ± 0.28 ms, mad ± ortanca, dağılım 0.75-3.46 ms, n = 17; Wilcoxon İmzalı Rütbeler Testi, p = 0.014, Şekil 4D). Bu sonuçlar, işitsel sinir kökünün uyarılmasının CN nöronların ve sonraki devre aktivitelerinin sinaptik aktivasyonuyla sonuçlanmasıyla sonuçlandırılmasını, in vivo'yu daha yakından temsil ettiğini – T-stellat veya GBC/MNTB aksonların doğrudan uyarılmasından daha fazla zamanlama gibi.

Bizim sezyum bazlı, yüksek [Cl-] iç solüsyon gerilim kelepçesi kullanılan, uyarıcı (glutamaterjik) ve inhibitör (GABA ve gliserin) PSC'ler hem membran potansiyeli (-60 mV) ve bu nedenle ayırt edilemez içe doğru. AN-uyarıcı yapılandırmada devre aktivitesini çağrıştırırken, ampa aracılı glutamaterjik akımlar için yaklaşık geri dönüş potansiyeli olan 0 mV'ye tutunma potansiyelini kaydırarak, tahmin edilen inhibitör girdiyi elektriksel olarak izole ettik. Örneğimizde nöron, klorür iletkenlerinin göstergesi olan 0 mV(Şekil 4Ci,kırmızı iz) dışa akım yanıtları gözlendi. Bu GABA olması muhtemeldir- veya gliserinjik sinaptik yanıtlar. Bu veriler, işitsel sinir kökünü uyararak, sonraki afferent devrelerin aktivasyonu ile, MOC nöronların hem uyarıcı hem de inhibitör girdileri etkinleştirmek için kama diliminin yarar göstermektedir. Ayrıca, post-sinaptik yanıtların çeşitli desenleri AN stimülasyon tarafından uyarılmış, AN akson aynı stimülasyon koşulları altında bile düşündüren, tüm devre aktivitesi dinamik ve karmaşık olduğunu düşündürmektedir. Bu deneysel paradigma, karmaşık işitsel uyaranların beyin sapı boyunca nasıl yayıp MOC nöronlarında entegre edildiklerinin ayrıntılı bir analizini sağlar, MOC efferent sisteminin çıktısını ve koklea üzerindeki nihai etkisini belirler.

Şekil 1: Kama dilimi şeması ve örnek görüntü. (A) Medial olivocochlear geri besleme devresinin şeması. Mavi oklar MOC nöronlar ve siyah oklar için afferent artan yolu gösterir dış saç hücrelerinin tabanına MOC nöronlar gelen azalan geribildirim yolu gösterir (OHC). (B) Kalın tarafında işitsel sinir kökü (ANR) ve koklear çekirdeğin (kesikli anahat) etiketleri ile bir kama dilimi brightfield görüntü. Yıldız, MOC nöronlarının kama diliminin ince tarafında yama bağlamaiçin hedeflendiği yamuk vücudun ventral çekirdeğinin yaklaşık konumunu gösterir. Kesikli siyah çizgiler, dilimin her iki yarımküresinde de görülebilen yüz sinirlerini gösterir. IHC - iç saç hücresi, GBC - küresel gür hücre, SPN - üstün paraolion çekirdeği, MNTB - yamuk vücut medial çekirdeği, VNTB - yamuk vücut ventral çekirdeği, LSO - lateral üstün zeytin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 50 μm'de yeniden kesitlenmiş bir kama diliminden cresyl menekşe lekeli kesitler. Diğer tüm bölümler de görüntülendi. Bölümler numaralandırılır --> kaudal. Kama dilimleri hem dorsal CN (S19'da ok) hem de ventral CN (S19'da ok ucu), işitsel sinir kökü (S17'de açık ok ucu) ve MNTB'nin (S3-S15'te havalandırma yüzeyinin yakınındaki karanlık alan) dahil olmak üzere koklear çekirdeğin (CN) tamamını içerme eğilimindedir. Ölçek çubuğundaki D ve V, dilim yönlendirmesinde dorsal ve ventral temsil emzdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kontralateral koklear çekirdekten MOC nöronlarına artan girdiaksons kama dilim bozulmamış kalır. (A) P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (kırmızı floresan) fareden alınan ve biyositin görselleştirmesi için yeniden işlenen bir kama diliminin en çok olan kesiti. Konfokal görüntü karo, maksimum yoğunluklu projeksiyon z-yığınıdır. Ventral akustik stria daki aksonlar beyaz ok uçları ile vurgulanır. Kesikli anahat, koklear çekirdeğin bu rostral-en dilimde kalan küçük bir kısmını gösterir. Ölçek çubuğu 500 μm. (B) VNTB'de bir ChAT-IRES-Cre x tdTomato pozitif nöronun konfokal görüntüsü ve çevredeki nöropilde biyositin pozitif puncta. Ölçek çubuğu 50 μm. (C) Biyositin etiketli aksonlar, kontralateral MNTB'de Held'in kalyces'i olarak sonlandırılır. Dikey kesik çizgi dilimin orta çizgisini temsil eder. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Voltaj kıskacındaki afferent girdilerin elektriksel uyarılması MOC nöronlarında çok tepeli postsinaptik akımlar verir. (A) Hem ventral akustik stria (VAS) stimülasyon (gri uyarıcı elektrot) hem de işitsel sinir (AN) stimülasyon (siyah uyarıcı elektrot) için kayıt kurulumu ile kama dilimi şeması MOC afferent girişleri. (B) -60 mV'de orta hat yakınında tek bir elektriksel uyarımla uyarılmış tek bir P17 nöronundan postinaptik akım (PSC) örnekleri. (C) PsC'ler Bir P15 nöronunda -60 mV'de AN stimülasyon sırasında uyarılmış. (Ci) C ile aynı hücredeki örnek PSC'ler 0 mV tutma potansiyeline uyarılmış (kayıt kurulumumuzda AMPA aracılı akımlar için yaklaşık ters potansiyel, kırmızı). (D) VAS ve AN stimülasyonu için ilk PSC gecikmesinin nicelliği için nüfus verileri. Kutular: dörtte biri, çizgi inset: ortanca, kare inset: ortalama, bıyık: ortanca mutlak sapma. * p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.