Nöronlar için çeşitli sinaptik girdilerin entegrasyonu en iyi doğal zamanlama ve devre plastisite için tüm pre-sinaptik çekirdekleri koruyan bir hazırlık ölçülür, ancak beyin dilimleri genellikle birçok bağlantıları sever. In vitro deney yeteneğini korurken in vivo devre aktivitesini taklit etmek için değiştirilmiş bir beyin dilimi geliştirdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık
Bu makalede
Özet
Özet
In vitro dilim elektrofizyoloji teknikleri hassas elektriksel ve zamansal çözünürlük ile tek hücreli aktiviteölçmek. Beyin dilimleri düzgün görselleştirmek ve yama-kelepçeleme veya görüntüleme için nöronlar erişmek için nispeten ince olmalıdır, ve beyin devrelerinin in vitro muayene sadece fiziksel olarak akut dilim mevcut ne sınırlıdır. Presinaptik çekirdeklerin daha büyük bir kısmını korurken in vitro dilim denemenin faydalarını korumak için yeni bir dilim hazırlığı geliştirdik. Bu "kama dilimi" beyin sapındaki medial olivocochlear (MOC) nöronlara çeşitli monaural, ses odaklı girdileri karakterize etmek için yama-kelepçe elektrofizyoloji kayıtları için tasarlanmıştır. Bu nöronlar kontralateral kulak ve buna karşılık gelen koklear çekirdek (CN) uyaranlarla aktive nöronlardan birincil afferent uyarıcı ve inhibitör girdileri alırsınız. Asimetrik bir beyin dilimi, bir yarımkürenin lateral kenarında ki rostro-kaudal etki alanında en kalın olan ve daha sonra karşı yarımkürenin lateral kenarına doğru incelen tasarlanmıştır. Bu dilim içerir, kalın tarafında, işitsel sinir kökü beyne işitsel uyaranlar hakkında bilgi iletiyor, içsel CN devre, ve hem disynaptic uyarıcı ve trisinaptik inhibitör arayolları kontralateral MOC nöronlar üzerinde yakınsama. Kayıt, dilimin ince tarafındaki MOC nöronlarından gerçekleştirilir ve burada tipik yama-kıskaç deneyleri için DIC optikleri kullanılarak görselleştirilir. İşitsel sinirin doğrudan uyarılması, işitsel beyin sapına girerken yapılır, içsel CN devre aktivitesi ve sinaptik plastisite için MOC nöronların sinapsupstream meydana izin. Bu teknikle in vivo devre aktivasyonunu dilim içinde mümkün olduğunca yakından taklit edebilirsiniz. Bu kama dilimi hazırlığı, devre analizlerinin in vitro dilim fizyolojisinin teknik avantajlarıyla birlikte yukarı akım bağlantısının ve uzun menzilli girdilerin korunmasından yararlanacağı diğer beyin devreleri için geçerlidir.
Giriş
Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel prosedürler Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından onaylandı.
1. Deneysel preparatlar
NOT: Dilimleme çözeltisi, dilimleme sıcaklığı, dilim kuluçka sıcaklığı ve aparatlar (vb.) dahil olmak üzere dilim hazırlama ile ilgili ayrıntılar bu deneyde yapılan beyin sapı hazırlığı için özeldir. Dilim kuluçka detayları laboratuvar deneyimi başına değiştirilebilir.
- Yama bağlama için dahili çözümler hazırlayın.
- (mM' de) 76 Cs-methanesulfonat, 56 CsCl, 1 MgCl2,1 CaCl2,10 HEPES....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kama diliminin histolojik incelemesi
İşitsel beyin sapı nöron fonksiyonunun araştırılması için, kama dilimi hazırlığı, kayıtlar için hedeflenen MOC nöronların işitsel sinir kökü ve CN kontralateralini içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1B'degösterilen örnek dilim). Preparatın ilk histolojik incelemesi, dilimin devre aktivasyonu için gerekli çekirdekleri içerdiğini ve aksonal projeksiyonların sağlam olduğunu doğrulamak için önemlidir. CN içinde iki hücre tipleri MOC nö.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada bir kama dilimi olarak tanımlanan dilimleme prosedürü bozulmamış presinaptik nöronal devre korumak için güçlü, ancak nöronal fonksiyonun analizi için beyin dilimi deney erişilebilirliği ile. Devre analizine hazırlık kullanımını en üst düzeye çıkarmak için birkaç ilk adımda büyük özen gerekir. Kamanın boyutları, hem presinaptik çekirdeklerin hem de aksonal projeksiyonlarının hazırlanan kama dilimi içinde yer aldığını doğrulamak için integral olan histolojik inceleme kullanılarak doğrulanmalıdır. Projeksiyonlar kesi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Deneysel Hazırlıklar | |||
| Agar, toz | Fisher Scientific | BP1423500 | Vibratom kesiti sırasında beyin dokusunu stabilize etmek için kullanılan %4 agar bloğu |
| AlexaFluor Hidrazid 488 | Invitrogen | A10436 | Başarılı MOC nöron yamasını doğrulamak için dahili çözeltide kullanılan florofor |
| Analitik Denge | Genleri Bilimsel (Intramalls) | AV114 | Tartı kimyasalları |
| Çift kenarlı tıraş bıçağı | Ted Pella | 121-6 | Vibratom kesme bıçağı |
| Kinürenik asit (5g) | Sigma Aldrich | K3375-5G | Dilimleme ACSF katkı maddesi, yama sıkıştırma için doku sağlığını iyileştirmek amacıyla diseksiyon ve dilimleme sırasında nöron aktivitesini azaltmak için kullanılır |
| pH Metre | Fisher Scientific (Intramalls) | 13-620-451 | Çözelti pH test cihazı |
| Plastik petri kapları 100mm çap X 20mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556-002 | %4 Agar Hazırlık |
| Karıştırma Ocak | Gözü Fisher Scientific (Intramalls) | 11-500-150 | %4 Agar için |
| hazırlamaDiseksiyon ve Dilimleme< / güçlü > | |||
| Biyosit | Sigma Aldrich | B4261-250MG | Aksonal izleme için kullanılan kimyasal (Streptavidin 488 ile konjuge edilmiş) |
| Diseksiyon Mikroskobu | Amscope | SM-1BN | Beynin çıkarılması sırasında hassas diseksiyon için |
| Dumont #5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | İnce forseps diseksiyon aleti |
| Ekonomi cımbız #3 | WPI | 501976 | Forseps diseksiyon aleti |
| Cam Petri Kabı 150mm çap x 15mm H | Fisher Scientific (Intramalls) | 08-747E | Diseksiyon çanağı |
| Arayüz kağıdı (203 X 254mm PCTE Membran 10um) | Thomas Scientific | 1220823 | Dilim inkübasyonu/biyosit uygulaması |
| Leica VT1200S Vibratom | Leica | 1491200S001 | Kama dilimi kesitleme için vibratom |
| Mayonez makas | Roboz | RS-6872 | Diseksiyon aleti |
| Tek kenarlı karbon çelik bıçaklar | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-640 | Diseksiyon için tıraş bıçağı |
| Numune diski, | Leica | 14048142068 | Tekrarlanabilir eğme için özel vibratom aşaması |
| Spoonula | FisherSci | 14-375-10 | Diseksiyon aleti |
| Süper Yapıştırıcı | Newegg | 15187 | Dokuyu vibratom aşamasına |
| yapıştırmak için kullanılırVannas Yaylı Makas | Güzel Bilim Araçları | 91500-09 | Diseksiyon aracı |
| Elektrofizyoloji | |||
| A1R Dik Konfokal Mikroskop | Nikon Instruments Elektrofizyoloji | ve görüntüleme mikroskobu, elektrofizyoloji | |
| ile uyumlu herhangi bir mikroskop olabilirElektrot Borosilikat cam, Filament OD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm uzunluğunda | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Yama sıkıştırma pipet camı |
| Elektrot Dolgusu MicroFil | WPI | CMF20G | Yama elektrot pipet dolgusu |
| Hat içi çözelti ısıtıcısı | Warner Instruments (GSAdvantage) | SH-27B | Dilim perfüzyon sistemi ısıtıcısı |
| Çoklu Mikromanipülatör Sistemleri | Sutter Müdahaleleri | MP285 özellikli MPC-200 | Yama kelepçesi ve stimülasyon elektrot yerleşimi için mikromanipülatörler |
| P-1000 cam mikropipetler için yatay pipet çektirmesi | Sutter aletleri | FG-P1000 | Yama kelepçeli pipetleyici çektirme |
| Yama kelepçeli amplifikatör ve Yazılım | HEKA | EPC-10 / Patchmaster Sonraki | Herhangi bir amplifikatör/yazılım |
| Kayıt Odası | olabilir Warner Instruments | RC26G | Kayıt sırasında dilim "banyosu" |
| Kayıt Odası Arp | Warner Instruments | 640253 | Elektrofizyoloji kaydı sırasında dilimi sabitler |
| Dilim Kuluçka Odası | Özel Yapı | Dilimleme sonrası toparlanma sırasında dilimler için ısıtılmış, oksijenli tutma odası | |
| Uyaran izolasyon ünitesi | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus izolasyon ünitesi |
| 60CC | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-820-11 | Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı işleme |
| Sıcaklık kontrolörü | Warner Instruments (GSAdvantage) | TC-324C | Dilim perfüzyon sistemi sıcaklık kontrolörü |
| Boru 1/8 OD 1/16 ID | Fischer Scientific (Intramalls) | 14-171-129 | Elektrofizyoloji perfüzyon sıvısı taşıma |
| Tugsten konsantrik bipolar mikroelektrot | WPI | TM33CCINS | Elektrofizyoloji |
| Histoloji< / güçlü > | |||
| 24 kuyu Plate | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-556006 | Histoloji dilimi toplama ve immün boyama |
| Alexa Fluor 488 Streptavidin | Jackson İmmüno laboratuvarları | 016-540-084 | Biyosit görselleştirme için ikincil antikor |
| İmmünohistokimya ajitasyonu için | Corning Orbital Shaker | Sigma | CLS6780FP |
| Cresil Menekşe Asetat | Sigma Aldrich (Intramalls) | C5042-10G | Histoloji için hücresel boyama |
| Tek Kullanımlık Mikrotom Bıçakları | Fisher Scientific | 22-210-052 | Kayar mikrotom bıçağı |
| Filtre şırıngası Nalgene 4mm Selüloz Asetat 0.2um | Fisher Scientific (Intramalls) | 09-740-34A | Kayıt pipetlerini dahili çözelti ile doldurmak için şırınga filtresi |
| Fluoromount-G Slayt Montaj Ortamı | Fisher Scientific | OB100-01 | İmmünohistokimya floresan montaj ortamı |
| raflı cam slayt boyama kabı | Fisher Scientific ( Intramalls) | 08-812 | Cresyl Violet boyama odası |
| Microm HM450 Kayar Mikrotom | ThermoFisher | 910020 | Histoloji için donma mikrotomu |
| Mikroskop Kapağı Gözlükler: Dikdörtgenler 50mm x 24mm | Fisher Scientific (Intramalls) | 12-543D | Histokimya sürgülü kapak camı |
| Permount montaj ortamı | Fisher Scientific | SP15-100 | Cresyl menekşe kesit montajı orta |
| Superfrost Slaytları | Fisher Scientific | 22-034980 | Histoloji slaytları |
Kaynaklar
- Campbell, J. P., Henson, M. M. Olivocochlear neurons in the brainstem of the mouse. Hearing Research. 35 (2-3), 271-274 (1988).
- Grothe, B., Sanes, D. H. Synaptic inhibition influences the temporal coding properties of medial superior ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
