Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61669

⸱

10 Eylül 2020

 ,  , 
1Laboratory of Biochemistry, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Bu makalede

Özet

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Özet

Bu protokolün amacı, nükleotid şeker taşıyıcıları (NST'ler) tarafından oluşturulan heterolog kompleksleri göstermek için bölünmüş lusiferaz komplemansiyonunun en son varyantının uygulanabilirliğini araştırmaktır. Bu ER ve Golgi'de yerleşik multitransmembran proteinleri, substratlarıyla glikozilasyona aracılık eden enzimleri sağlamak için sitoplazmik olarak sentezlenmiş nükleotid şekerlerini organel membranları boyunca taşır. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler olarak bulunur. Farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir. Tekniğin NST heteromerizasyonu fenomenini incelemek için uygun olup olmadığını doğrulamak için, daha önce birkaç başka yolla ilişkili olduğu gösterilen iki Golgi'de yerleşik NST'nin bir kombinasyonuna karşı test ettik. Lusiferaz kompleman testi, Golgi'de yerleşik membran proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle uygun görünmektedir, çünkü genellikle protein yanlış lokalizasyonunu tetikleyen ve yanlış pozitif riskini artıran yüksek ekspresyon seviyeleri gerektirmez.

Giriş

Bu makalede, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, geçici olarak transfekte edilmiş insan hücrelerinde Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin varlığını kontrol etmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, nükleotid şeker taşıyıcılarına (NST'ler) karşı en kapsamlı şekilde test edilmiştir, ancak N- ve / veya C-termini sitoplazmaya bakan diğer Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri için de olumlu sonuçlar elde edebildik.

Araştırma grubumuz, NST'lerin makromoleküllerin glikozilasyonundaki rolünü araştırmaktadır. NST'ler, organellar membranın sitoplazmik tarafına bakan N- ve C-termini ile Golgi ve/veya ER'de yerleşik tip III membran proteinleridir1. NST'lerin, glikoziltransferazları substratlarıyla beslemek için nükleotid ile aktive olmuş şekerleri organel zarları boyunca taşıdığı düşünülmektedir. NST'ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler oluşturur2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ayrıca, farklı NST'ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir6,11. NST'lerin fonksiyonel olarak ilişkili glikozilasyon enzimleri ile kompleksler oluşturduğu da gösterilmiştir12,13,14. NST'lerin ve fonksiyonel olarak ilişkili Golgi'de yerleşik proteinlerin etkileşimlerini incelemek için günümüzde kullanılan floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) tabanlı FRET yaklaşımına bir alternatif aradık, bu yüzden bölünmüş lusiferaz kompleman testini test etmeye karar verdik. Bir NST ile fonksiyonel olarak ilişkili bir glikozilasyon enzimi arasındaki yeni bir etkileşimi tanımlamamızı sağladı9.

Bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son modifikasyonu olan NanoBiT, burada sunulan protokolde kullanılmaktadır15. Lusiferaz enziminin (örneğin, NanoLuc) iki parçadan yeniden yapılandırılmasına dayanır - büyük BiT veya LgBiT olarak adlandırılan büyük olanı, 17.6 kDa'lık bir protein ve küçük BiT veya SmBiT olarak adlandırılan sadece 11 amino asitten oluşan küçük olanı. İlgilenilen iki protein, tamamlayıcı parçalarla kaynaştırılır ve geçici olarak bir insan hücre hattında ifade edilir. İki füzyon proteini etkileşime girerse, hücre geçirgen bir substratın eklenmesiyle in situ olarak bir lüminesans üretilir. Bu iki parça, kaynaştıkları ilgili proteinler arasındaki bir etkileşimle bir araya getirilmedikleri sürece minimum afinite ile ilişkilendirilmeleri için optimize edilmiştir.

Genel olarak, biyolüminesans bazlı yöntemlerin floresan bazlı yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Biyolüminesan sinyaller daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir, çünkü arka plan lüminesansı lusiferaz kaynaklı sinyale kıyasla ihmal edilebilir16. Buna karşılık, floresan temelli yaklaşımlar genellikle otofloresan fenomeninin neden olduğu nispeten yüksek bir arka plandan muzdariptir. Ayrıca, biyolüminesans, analiz edilen hücrelere floresandan daha az zararlıdır, çünkü eski durumda numuneyi uyarmaya gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı, PPI'ları in vivo olarak incelemeye yönelik biyolüminesan yaklaşımlar, Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) gibi yaygın olarak kullanılan floresan yöntemlerden daha fazladır.

Protokolümüz, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansı, kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesansa yönlendirmeye dayanmaktadır. İkincisi, daha büyük bir parça ile kaynaşmış test edilen proteinlerden birini ve daha küçük bir parça ile kaynaşmış bir kontrol proteinini (örneğin, HaloTag) içerir. İkincisi, memeli proteinlerinin hiçbiriyle etkileşime girmesi beklenmeyen bakteriyel kökenli bir proteindir. Bu proteini bir kontrol olarak kullanmak, analiz edilecek Golgi'de yaşayan protein çiftlerinin topolojisinde sınırlamalar getirir. Memeli hücrelerinde bu protein sitoplazmada sentezlendiğinden, ilgilenilen her iki proteinin de en az bir sitoplazmik kuyruğu olmalıdır.

Bu yaklaşım, ÜFE'lerin ilk taraması için özellikle yararlı olabilir. İlgilenilen füzyon proteinleri, uygulanacak diğer yaklaşımlar için yetersiz olan seviyelerde ifade edildiğinde tercih edilen yöntem haline gelebilir. Benzer şekilde, bölünmüş lusiferaz kompleman testi, ilgili proteinler yüksek seviyelerde eksprese edilirse en iyi seçenek olabilir, ancak bu, hücre altı lokalizasyonlarını olumsuz yönde etkiler veya spesifik olmayan etkileşimleri zorladığı bilinmektedir. Daha küçük fragman sadece 11 amino aside sahip olduğundan, daha büyük etiketler kullanıldığında bölünmüş lusiferaz kompleman testi uygulanabilir. Son olarak, burada sunulan durumda olduğu gibi, diğer teknikler kullanılarak elde edilen verileri daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İfade plazmidlerinin oluşturulması

  1. Bir topoloji tahmin aracı kullanarak ilgilenilen proteinlerin membran topolojisini inceleyin.
  2. Klonlama stratejisini, füzyon proteinleri Golgi membranlarına yerleştirildikten sonra daha büyük ve daha küçük fragmanların sitoplazmaya bakacağı şekilde tasarlayın. Burada sunulan örnekte olduğu gibi, ilgili proteinlerin hem N- hem de C-termini sitoplazmik olarak yönlendirilmişse, proteinleri sekiz olası şekilde etiketleyin (bkz. Şekil 1B). İlgilenilen proteinlerden birinin veya her ikisinin N- veya C-terminusu ışığa yönelikse, etiketlemeyi hariç tutun.
  3. Standart klonlama protokollerini izleyerek ilgilenilen genleri uygun ekspresyon vektörlerine (bakınız Malzeme Tablosu) alt klonlayın.
    NOT: Bazı etiketleme seçenekleri yetersiz yakınlık, yetersiz yönlendirme veya uzamsal kısıtlamalar nedeniyle çalışmayabileceğinden, tüm olası yönlendirmelerin sınanması önerilir.

2. Plazmidlerin ekspresyonunun hücrelere geçici transfeksiyonu

  1. Yapışkan HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile toplayın ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri (2 x 104/100 μL/kuyu) şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 delikli bir plakaya yerleştirin. Toplam kuyu sayısını, replikalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonlara ve kontrollere uyacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Termal kaymaları en aza indirmek ve gece boyunca buharlaşmayı önlemek için plakanın yalnızca iç 60 kuyusunu kullanmaya çalışın. Malzeme Tablosunda belirtilenler gibi poli-D-lizin kaplı plakaların kullanılması şiddetle tavsiye edilir, aksi takdirde sonraki yıkama adımları sırasında hücreler ayrılabilir.
  2. Hücreleri standart koşullarda (37 °C, %5 CO2) gece boyunca kültüre alın.
  3. Ertesi gün, 1.1 numaralı maddede elde edilen ekspresyon plazmidlerinin istenen kombinasyonları ile hücreleri transfekte edin.
    1. İfade plazmidlerini serumsuz bir ortamda seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu) her yapı için 6.25 ng / μL'ye kadar.
    2. Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipit-DNA oranında ekleyin ve üreticinin talimatına göre inkübe edin.
    3. Belirlenen kuyucuklara 8 μL lipid: DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini nazik bir dönüşle karıştırın. Bu, her iki ekspresyon yapısının 50 ng / kuyucukta transfeksiyonu ile sonuçlanır.
  4. Standart koşullarda hücreleri 20-24 saat kültürleyin (37 °C, %5 CO2).
    NOT: Hücrelerin daha uzun süre kültürlenmesi, fragmanlar arasında spesifik olmayan bir ilişkiyi teşvik edebilecek daha yüksek füzyon protein ekspresyonu seviyelerine neden olabilir.

3. Orta değişim

  1. Ertesi gün, şartlandırılmış ortamı her bir kuyucukta 100 μL serumsuz bir ortamla değiştirin. Hücrelerin orta değişimde ayrılmadığından emin olun.
    NOT: Bu adım, furimazin çalışma çözeltisinin eklenmesinden 2-3 saat önce yapılmalıdır. Serum yoksunluğu, furimazinin otolüminesansının neden olduğu arka planı en aza indirir.

4. Furimazin çalışma çözeltisinin hazırlanması

  1. Ölçümden hemen önce, 1 hacim furimazini 19 hacimlik bir seyreltme tamponu (20 katlı seyreltme) ile karıştırın.
    NOT: Hazırlanacak furimazin çalışma çözeltisinin toplam hacmi, analiz edilecek bireysel kuyucukların sayısına bağlıdır (furimazin çalışma çözeltisi, hücre kültürü ortamına 1: 5 oranında eklenir, bu nedenle, daha önce 100 μL serumsuz bir ortam ile doldurulmuş her bir kuyucuğa, furimazin çalışma çözeltisinin 25 μL'si eklenmelidir).
  2. Furimazin çalışma solüsyonunu belirlenmiş kuyucuklara (25 μL/kuyu) ekleyin. Plakayı elle veya yörüngesel bir çalkalayıcı kullanarak yavaşça karıştırın (örneğin, 300-500 rpm'de 15 sn).

5. Lüminesans ölçümü

  1. Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.
    1. 37 ° C'de yapılacak deneyler için plakayı belirtilen sıcaklıkta 10-15 dakika dengeleyin.
  2. Analiz edilecek kuyuları seçin.
  3. 0,3 sn entegrasyon süresi ile ışıltıyı okuyun. Gerektiğinde 2 saate kadar parlaklığı izlemeye devam edin.

6. Veri analizi

  1. Test edilen ve kontrol edilen tüm kombinasyonlar için ortalama değerleri ve standart sapmaları hesaplayın.
  2. Birden fazla karşılaştırmayla tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin.
  3. Faiz kombinasyonları için elde edilen ortalama bir lüminesansı, karşılık gelen negatif kontroller için elde edilen ortalama bir lüminesansa bölerek katlama değişim değerlerini hesaplayın. Sonuçları değerlendirin.
    NOT: Burada önerilen veri analizine yaklaşım, test edilen kombinasyon için elde edilen lüminesansın, karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesanstan istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olması ve aynı zamanda bu iki değerin oranının 10'u aşması durumunda etkileşimin talep edilebileceğini varsayar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yaklaşımda en güvenilir verileri elde etmek için tüm olası kombinasyonlar test edilmelidir (bkz. Şekil 1). Paralel olarak, pozitif ve negatif kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, etkileşime girdiği bilinen iki proteinden oluşmalıdır, bunlardan biri daha büyük parça ile kaynaştırılır ve diğeri daha küçük parça ile kaynaştırılır. Negatif kontrol ideal olarak, aynı şekilde etiketlenmiş iki etkileşimsiz tip III membran proteininden oluşmalıdır. Bununla birlikte, böyle bir kontrolün ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, bölünmüş lusiferaz kompleman testi kullanılarak NST'ler gibi Golgi'de yerleşik tip III membran proteinleri arasında oluşan heterolog komplekslerin gösterilmesini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Veri analizi ve yorumlanması için önerilen yaklaşım, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansın, daha büyük parça ile kaynaşmış ilgili proteinlerden birinden ve daha küçük parça ile kaynaşmış bir bakteri kökenli kontrol proteininden oluşan karşılık gelen kontrol kombinasyonu için elde edilen ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Polonya'nın Krakow kentindeki Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/23/D/NZ3/01314 no'lu hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi
Yapışık memeli hücre hattı
BioCoat Poly-D-Lizin 96 oyuklu Beyaz/Şeffaf Düz Tabanlı TC ile tedavi edilmiş Mikroplaka, KapaklıCorning356651
Hücre kültürü santrifüjü
Hücre kültürü takviyeleri (ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, L-glutamin, penisilin, streptamisin)
CO2 inkübatörü
NanoBiT fragmanları
FuGENE HD Transfeksiyon ReaktifiPromegaE2311
GloMax Discover Mikroplaka Okuyucu (veya farklı bir lüminesans mikroplaka okuyucu)PromegaGM3000
hücre hattına adanmış büyüme ortamı
Standart moleküler klonlama için malzemeler ve reaktifler (bakteriler, termostabil polimeraz, restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, nükleik asit saflaştırması için malzemeler ve reaktifler)
NanoBiT MCS Başlangıç SistemiPromegaN2014Bu kit, ilgilenilen proteinlerin farklı oryantasyonlarda NanoBiT fragmanları ile etiketlenmesini sağlayan vektörlerin yanı sıra SmBiT ile kaynaşmış HaloTag proteinini kodlayan kontrol plazmidi ve pozitif bir kontrol plazmid çifti içerir.
Nano-Glo Canlı Hücre Test SistemiPromegaN2011Bu kit, canlı hücrelerde NanoLuc aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan bir substrat olan furimazin ve özel bir seyreltme tamponu içerir.
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı içermezGibco11058021
Oribital çalkalayıcı
Veri analizi için yazılım (örn. GraphPad Prism)
Thermocycler
ile etiketlenmemiş ilgilenilen protein(ler)i kodlayan ekspresyon plazmitleriKullanılan

Kaynaklar

  1. Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
  2. Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
  3. Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
  4. Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
  5. Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
  6. Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
  7. Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
  8. Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).
  9. Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).
  10. Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
  11. Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
  12. Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
  13. Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
  14. Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
  15. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  16. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  17. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  18. Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
  19. White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
  20. Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
  21. Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
  22. Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275(2020).
  23. Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N kleotid eker Ta y c larGolgi Yerle ik Membran ProteinleriHeterolog Kompleks Olu umuProtein Protein Etkile im AnaliziHEK293 H cre TransfeksiyonuL minesans Mikroplaka OkuyucuFurimazin al ma zeltisiDoza Ba l nhibisyonSLC35A2 SLC35A3 Etkile imi
Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.