Yöntem makalesi

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

DOI:

10.3791/61680

⸱

20 Eylül 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen transkripsiyon, hücre biyolojisinde önemli bir süreçtir ve hücrelerin iç ve dış ipuçlarını yorumlamasına ve yanıt vermesine izin verir. mRNA düzeylerini ölçen geleneksel toplu popülasyon yöntemleri (Kuzey blot, PCR ve RNAseq), yanıtlarda hücreden hücreye varyasyon hakkında bilgi sağlama yeteneğinden yoksundur. Hassas tek hücreli ve alelik görselleştirme ve niceleme, tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH) ile mümkündür. RNA-FISH, hedef RNA'ların etiketli oligonükleotid problarla hibridize ederek gerçekleştirilir. Bunlar orta/yüksek aktarım hızı yöntemleriyle görüntülenebilir ve görüntü analizi işlem hatları aracılığıyla, hem olgun hem de nascent RNA'lar üzerinde tek hücre düzeyinde nicel veriler sağlar. Fiksasyon, permeabilizasyon, hibridizasyon ve görüntüleme adımları, burada açıklanan model sistemi kullanılarak laboratuvarda uzun yıllar boyunca optimize edilmiştir ve bu da smFISH etiketlemesinin başarılı ve sağlam tek hücre analizi ile sonuçlanır. Numune hazırlama ve işleme ile temel amaç, yanlış pozitifleri azaltmak ve daha doğru veriler sağlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı ile karakterize yüksek kaliteli görüntüler üretmektir. Burada, belirli örneklere uyarlamak için öneriler ve optimizasyon adımlarıyla birlikte numune hazırlamadan veri analizine kadar işlem hattını açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen transkripsiyon ve çeviri, DNA dizisinden RNA'ya ve protein1'ekadar biyolojinin merkezi dogmasında yer alan iki ana süreçtir. Bu çalışmada transkripsiyon sırasında haberci RNA (mRNA) üretimine odaklanıyoruz. Nascent RNA molekülü hem kodlamayan intronları hem de kodlama eksonlarını içerir. Intronlar, mRNA ribozomlar üzerinde çeviri için sitoplazma hareket etmeden önce eş-transkripsiyonel olarak birlenir2,3.

Geleneksel olarak, mRNA ölçümü, RT-qPCR veya Kuzey şişkinliği gibi klasik tahlillerle hücrelerin toplu popülasyonlarında (yüzlerce ila milyon) gerçekleştirilir. Çok güçlü olsa da, bu yöntemler hücreden hücreye varyasyon (fenotipik heterojenlik), transkripsiyonel olarak aktif alellerin sayısının tanımlanması ve belki de daha da önemlisi mekansal bilgi eksikliği hakkında içgörü sağlamadıkları için sınırlıdır. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizilimine (RNAseq) izin sağlayan genom geniş teknolojileri görüntüleme yöntemleri ile sıralama4arasındaki boşluğu kapatmaya başladı. Bununla birlikte, RNAseq nispeten düşük algılama verimliliklerinden muzdariptir ve işleme adımları uzamsal bilgilerin tamamen kaybolmasına neden5. Tek hücreli RNAseq, izojenik hücre popülasyonu arasında fenotipik heterojenlik hakkında içgörüler sağlayabilse de, RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) mekansal düzeyde ve aletle bazında hedef gen ekspresyonunun daha eksiksiz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırabilir6,7.

RNA FISH, sabit hücrelerdeki hedef RNA moleküllerinin tespitini ve lokalizasyonunu sağlayan bir tekniktir. Daha önceki, zahmetli yöntemlerden farklı olarak, mevcut son teknoloji RNA-FISH, hedef RNA dizilerinin tamamlayıcısı olan ticari olarak mevcut nükleik asit problarını kullanır ve bu problar Watson-Crick tabaneşleştirmesi 8ile hedeflerine melezlenir. Erken yerinde hibridizasyon teknikleri, Gall ve Pardue tarafından 1969'da kurulan benzer bir protokolü içeriyordu, çünkü bir örnek özellikle bir hedef RNA9'amelezlenen nükleik asit probları ile işlendi. Başlangıçta test radyoaktif veya kolorimetrik algılama kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, 1980'lerde, DNA FISH ve daha sonra RNA FISH'e floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokollerinin geliştirilmesi, daha hassas tespite giden yolu ve çoklama potansiyelini10,11'e açtı.

RNA FISH'teki diğer gelişmeler, tek RNA moleküllerini (smFISH)12 , 13tespit etme ve ölçmeyeteneğineyolaçmıştır. Doğrudan algılama, probların kendilerinin floroforlarla etiket edildiği bir yöntemdir. SmFISH ile ilgili bir zorluk, floresan sinyallerin farklı, kırınım sınırlı noktalar olarak algılanmasını kolaylaştırmak için yeterli melezleme problarına / hedefine ihtiyaç olmasıdır. Bu sorunu gidermek için, hedef RNA 8,12,14'ünçeşitli bölgelerine tamamlayıcıkısa tek iplikli DNA oligonükleotidlerinden oluşan bir prob kümesi kullanılabilir. Birden fazla probun bağlanması yerel florofor yoğunluğunu arttırır ve RNA'yı floresan mikroskopi ile belirgin, yüksek yoğunluklu bir nokta olarak görünür hale getirir. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü prob kümesi havuzundaki oligonükleotidlerin hedef dışı bağlanması, gerçek sinyal ve sahte oligonükleotid bağlama arasında ayrım yapmak için spot boyutunu ve yoğunluğunu nicel olarak analiz ederek gerçek RNA spot sinyalinden ayırt edilebilir, böylece yanlış pozitifleri azaltarak daha doğru analizleri kolaylaştırır12.

mRNA'yı tespit etmek için alternatif yöntemler klasik BAC klon tabanlı nick çeviri yöntemi ve daha yeni geliştirilen dallı DNA sistemidir. BAC klonlanmış, nick çeviri yönteminde, etiketlenecek DNA enzimmatik olarak çalınır ve maruz kalan 3' uca yeni bir nükleotid eklenir. DNA polimerazının aktivitesi I, istenen prob15 , 16ile sonuçlanan etiketli bir nükleotid ekler. Dallı DNA tekniği, RNA hedeflerine çiftler halinde melezlenen oligonükleotid probları içerir ve bu problar birden fazla sinyal amplifikasyon molekülü kullanılarak yükseltilir. Bu yöntem sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırabilir, ancak floresan lekeler boyut ve yoğunluk bakımından çılgınca farklı olabileceğinden amplifikasyon doğru miktarlamayı çarpıtabilir17.

Galveston Körfezi/Houston Gemi Kanalı'nda endokrin bozucu kimyasalların etkilerini ölçmek için NIEHS Superfund Araştırma Programı katılımının bir parçası olarak tam olarak kullanılan bu protokol için bir model sistem olarak, bir ER agonisti, 17β-estradiol (E2) 7 ,18,19 ile bir gecede tedavi edilen östrojen reseptör (ER) pozitif meme kanseri hücre hattı MCF-7'yi kullandık. E2, prototipik ER hedef geni, GREB17, 20,21,22dahil olmak üzere birçok ER-hedef geni düzenler. Burada açıklanan smFISH protokolü, GREB1'i hedefleyen iki spektral olarak ayrılmış prob kümesinden yararlanır; biri akonlara ve diğeri intronlara melezlenerek hem olgun hem de nascent RNA7'ninölçülenliğine izin verir. Daha sonra görüntü smFISH etiketli örneklere dekonvolüsiyon ile birlikte epifluoresans mikroskopisi kullanıyoruz ve ardından hücre başına aktif alel ve olgun RNA'ların sayısını ölçmek için görüntü analizi rutinleri uyguluyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En iyi sonuçları elde etmek için, bu protokolün ıslak laboratuvar kısmı tüm adımlarda standart RNase içermeyen önlemler gerektirir. Örneğin, filtrelenmiş pipet uçları, steril kaplar ve RNase içermeyen tamponların kullanımı oldukça teşvik edilir. Özellikle düşük bolluk hedef RNA'ları için vanadyl ribononcleoside kompleksleri gibi RNaz inhibitörlerinin kullanılması da önerilir.

1. Hücre kültürü ve deneysel kurulum

  1. Bir T75 doku kültürü şişesinde yapışık MCF-7 meme kanseri hücrelerini (ATCC #HTB-22) fenol-kırmızı içermeyen (sadece hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir) Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) ile desteklenmiş % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin.
  2. Asitle kazınmış, poli-D-lizin kaplı yuvarlak kapakları (0,16 ila 0,19 mm kalınlığında, 12 mm çapında) 24 çokwell doku kültürü plakasına yerleştirin.
    NOT: Standart protokollere göre steril PBS'de (Ca++ ve Mg ++ içermeyen fosfat tamponlu salin)yeniden inşa edilmiş 1 mg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile kapakları ve kaplamayı asitle kazımak için 1 M HCl kullanın.
  3. Büyüme ortamını hücrelerden çıkarın ve 5 mL steril PBS (Ca++ ve Mg++içermeyen fosfat tamponlu salin) ile bir kez yıkayın. MCF-7 hücrelerini 2-3 mL Trypsin-EDTA%0.25 çözeltisi kullanarak ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, Trypsin-EDTA% 0.25 çözeltisini eşit hacimli büyüme ortamıyla nötralize edin.
  4. Ortam süspansiyonundaki hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın, hücreleri saçmak için 1 dakika boyunca 391 x g'da aşağı çevirin. Hücre peletini bozmadan ortamı konik tüpten dikkatlice çıkarın ve hücreleri uygun miktarda tedavi ortamına yeniden biriktirin.
    NOT: Tedavi ortamı% 5 kömür-dektran soyulmuş ve dialyzed FBS, 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş fenol-kırmızısız DMEM'dir. Bu medya steroid hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir, çünkü serum bileşeni büyük ölçüde medyayı sıyırarak steroidlerin tükendi ve diyaliz yoluyla büyüme faktörlerini azalttı.
  5. Hücreleri, 500 μL tedavi medyasında kuyu başına 60.000 ila 70.000 hücrede 24 multiwell plakadaki kapaklara tohumlayın. Bu deney için tedavi başlatmada hücre konflüensi %70-80 civarında olmalıdır. Görüntü analizini zorlaştıran izdiahtan kaçınmak için hücre tipine, büyüme hızına ve denemenin uzunluğuna bağlı olarak hücre tohumlama yoğunluğunu optimize edin.
    NOT: En iyi görüntüleme ve görüntü analizi için hücre topaklamadan kaçının. Bu amaçla, kuyulara dağıtmadan önce hücreleri birkaç kez pipetleme (veya kısaca girdap) ile hücrelerin aliquot'unu iyice karıştırın. Kaplamalı hücreleri inkübatöre geri yerleştirmeden önce, hücrelerin doku kültürü başlığına yaklaşık 20 dakika yerleşmesine izin vermek hücre topaklamayı azaltmaya yardımcı olur.
  6. Büyüme ortamlarının sıyrılmış/çaprazlanmış serumunda kalan sinyal molekülleri nedeniyle hücre döngüsü senkronizasyonunu ve arka plan küçültmesini sağlamak için tedavilerden önce hücreleri en az iki gün kuluçkaya yatırın.
  7. Tedavi ortamlarında 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, MCF-7 hücrelerini 24 saat boyunca tedavi medyasında seyreltilmiş 10 nM 17β-estradiol (E2) ve araç kontrolü (DMSO) ile tedavi edin. Bu tedavi, maksimum tepki vermek için doygun bir E2 dozu kullanır. Farklı hedef genler, hücre modelleri ve tedavi türü için koşulları ampirik olarak belirlemek için zaman seyri ve doz-yanıt deneyleri yapın. Örnek olarak, son yayınımıza bakın7.

2. Tamponların hazırlanması

  1. Fiksasyon tamponunu hazırlamak için, saflaştırılmış, monomerik formaldehit (elektron-mikroskopi tedarikçileri tarafından% 16 paraformaldehit olarak satılır) steril PBS Ca++/ Mg++ (fosfat tamponlu salin artı Ca++ ve Mg++) içinde% 4'e seyreltin. RNA bozulmasını geciktirmek için 2 mM'lik son konsantrasyon için fiksasyon tamponuna vanadyl ribonucleoside kompleksleri (VRC) ekleyin.
    1. 24 multiwell plakanın kuyusu başına 300-500 μL sabitleyici gerektirerek toplam sabitleme tamponu miktarını hesaplayın. %4 formaldehiti sabitleme adımında gerekli olana kadar buzda saklayın.
      NOT: Sabitleme arabelleği her deneme için taze hale getirin.
      DİkKAT: Formaldehit, deriden emilen bir teraojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelerinize göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.
  2. Permeabilizasyon adımı için çekirdeksiz suda% 70 etanol hazırlayın. Alternatif bir seçenek steril PBS Ca++ /Mg ++artı 2 mM VRC'de %0,5 Triton-X100'dür. Kuyu başına 500 μL tampon kullanarak gereken toplam permeabilizasyon tampon miktarını hesaplayın.
  3. Hibridizasyon tamponunun 9 mL'sini hazırlamak için, 6 mL çekirdeksiz suya 2 mL stok% 50 dektran sülfat ve 1 mL 20x SSC (salin sodyum sitrat) tamponu ekleyin. Hibridizasyon tamponunu iyice karıştırmak için girdap. Bu tampon 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
  4. 2x salin sodyum sitrat (SSC) tampon gerektiren beş ayrı yıkama adımı vardır. Yıkama adımı başına kapak parçası başına 500 μL tampon öngörerek gereken 2x SSC tamponun son hacmini hesaplayın. Gerekli stok miktarını çekirdeksiz suda 20x SSC tamponu seyreltin. Ekstra bir önlem olarak yıkama adımlarına 2 mM VRC eklenebilir. Bu tampon, işlem adımları süresince oda sıcaklığında saklanabilir.

3. RNA FISH için fiksasyon

  1. Tedaviden sonra, medyayı kuyulardan çıkarın ve steril, soğuk PBS Ca++/ Mg++ile bir kez yıkayın. Düşük yapışma hücresi modeli kullanılıyorsa, sıvıyı aspire etmek için vakum kullanmayın; ortamı kuyunun kenarından dikkatlice çıkarmak ve ilk yıkama adımını atlamak için manuel pipetleme kullanın. Buz üzerinde 30 dakika boyunca 500 μL sabitleme tamponu ekleyin.
    NOT: Numune RNA bozulmasına eğilimliyse, bu noktada yıkama adımı için 2 mM VRC'li steril PBS kullanın.
  2. Kurumsal düzenlemelere göre fiksatifi kaldırın ve kimyasal atıklara atın. Hücreleri soğuk steril PBS Ca++/Mg++ ile iki kez 3 dakika yıkayın.
  3. PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 500 μL% 70 etanol ekleyin. 24 kuyu plakasını bir parafin plastik filmle kapatın. En az dört saat boyunca 4 °C'de bir rotator üzerine yerleştirin. Örnekleri bir gecede% 70 etanolde bırakmak en iyisidir. Protokol bu noktada duraklatılabilir ve numuneler% 70 etanolde bir haftaya kadar saklanabilir.
    NOT: Alternatif olarak 2 mM VRC solüsyonlu PBS'de %0,5 Triton-X100 kullanılabilir. Numuneleri bu permeabilizasyon tamponunun 500 μL'sinde bir rotatörde oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bu permeabilizasyon arabelleği kullanılırsa, iletişim kuralı bu noktada duraklatılamaz ve karma oluşturma adımı boyunca devam etmelidir.

4. RNA FISH için hibridizasyon

  1. Permeabilizasyon tamponunu çıkarın ve bir rotatörde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı% 10 formamid olarak bir kez yıkayın.
  2. Tüm karma arabelleği hazırlayın. Kapak sapası başına yaklaşık 30 μL tam hibridizasyon tamponu hesaplayın. Gereken yüzdeye ulaşmak için karma arabelleğe formamid ekleyin. Örneğin, 500 μL tam hibridizasyon tamponu gerekiyorsa, daha önce yapılan hibridizasyon tamponunun 450 μL'sine ek olarak% 10 vol/ vol'a ulaşmak için 50 μL moleküler sınıf formamidden oluşacaktır. Vortex kısaca karıştırmak için.
    DİkKAT: Formamid, deriden emilen bir teraratojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelere göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.
  3. Greb1 intronunu (Atto 647N ile etiketlenmiştir) ve GREB1 eksonunu (Quasar 570 ile etiketlenmiştir) probları 1:300 hibridizasyon tamponunda seyreltin. Pipetleme ile karıştırın. Bu arabelleği ışığa karşı koruyun ve hemen kullanın.
    NOT: Problar Stossi ve ark7'deayrıntılı olarak belirtildiği gibi tasarlanmış ve üretilmiştir. Problar genellikle üretici protokolü14'egöre RNA içermeyen TE arabelleği içinde yeniden uzlaştırılması gereken kurutulmuş bir oligonükleotid prob havuzu olarak sağlanır. Bu problar için stok çözeltisi 12,5 μM idi, bu nedenle; probların çalışma konsantrasyonu 42 nM'dir.
  4. Gece hibridizasyon adımı için nemlendirici bir oda hazırlayın. RNases kaldırmak için bir yüzey dekontaminant ile temizlenmiş bir cam Petri kabı içine, pozlanmamış tarafı yukarı bir parafin plastik film parçası yerleştirin. İki kağıt havluyu steril suyla doyutun ve kurutma belirli etiketlemeyi yok edebileceğinden, nem sağlamak için Petri kabının kenarlarına yerleştirin.
  5. Parafin plastik filminin temiz tarafına hibridizasyon tamponunda 30 μL prob noktalama ile probları aliquot. Kapakların birbirleriyle temas etmemeleri için probların aliquotlarını dağıtın.
  6. Sterilize edilmiş tokseps kullanarak, kapak hücre tarafını cam Petri kabındaki problara hafifçe aşağı çevirin. Hava kabarcıklarından kaçının ve kapaklara basınç uygulamayın.
    NOT: Sonraki adımlar için gerekli olacağından, doku kültürü plakasını 2x SSC tamponu ile atmayın.
  7. Cam Petri kabını parafin plastik filmle kapatın ve floroforlara ışığın maruz kalmasını önlemek için plakayı folyo ile örtün. Düz dönmeyen bir yüzeyde 37 °C'de 16 saate kadar gece boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresi ampirik olarak değiştirilebilir, ancak en az 4 saat önerilir.
    NOT: Kapaklar, hibridizasyon tamponunda kuluçka yaparken kaymaya karşı hassastır, bu da kapakta kuru noktalara yol açabilir ve numuneye zarar verebilir.

5. Görüntüleme için numunelerin hazırlanması

  1. Ertesi gün, kapakları nemlendirici hazneden tokmaklar kullanarak çıkarın ve hücre tarafı yukarı olacak şekilde 24 kuyu plakasına geri döndürün. Fazla probu ve spesifik olmayan hibridizasyonu yıkamak için 500 μL taze 2x SSC tampon artı% 10 formamid ekleyin.
    NOT: Numuneleri bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.
  2. Isıtılmış bir rotatörde her biri 37°C'de 15 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı %10 formamid ile hücreleri iki kez yıkayın.
  3. DNA'yı 2x SSC tamponda 1 μg/mL'de DAPI ile bir rotatörde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karşı verin.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2x SSC tampon ile bir kez yıkayın.
  5. Kapakları, fazla tuzları ortadan kaldırmak için kağıt havlu ve nükleaz içermeyen suda hızlı bir yıkama ile fazla 2x SSC tamponu çıkardıktan sonra sertleşmeyen montaj ortamı kullanarak cam slaytlara monte edin. Son olarak, kapakları açık oje ile kapatın.

6. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve görüntü işleme

  1. Örnekleri 60x veya 100x yağ hedefi ve bir sCMOS kamera kullanarak geniş alan epifluoresans mikroskobuna görüntüleyin. Bu deney için kullanılan belirli mikroskop ve amaç için malzeme tablosuna bakın.
    1. Sinyalin zamana bağlı bozulmasını önlemek için numuneler tam olarak işlenir işlenmez görüntülemeyi tamamlayın.
      NOT: Bu deneyde kırılma indisi (RI) 1.516 olan daldırma yağı kullanılmaktadır. RI uyuşmazlıkları görüntü bozulmasını etkileyecek nokta yayılma işlevinin sapmalarına neden olacağından, yağ RI'sını belirli örneklerle eşleştirmek için ampirik test yapılmalıdır.
  2. Görüntüler 0,10827 μm yanal piksel boyutuyla yakalanır.
  3. En yüksek yoğunluğa (yani pozitif kontrollere) sahip olması beklenen örneği kullanarak ışık kaynağından aydınlatma miktarını (yani, yüzde geçirgenlik) ve her kanal için pozlama sürelerini (bu özel örnekteki DAPI, TRITC, CY5 filtreleri) optimize edin. Bu deneyde, E2 ile işlenmiş numunenin her iki GREB1 prob seti için daha yüksek yoğunluğa sahip olması beklenmiştir. Genellikle GREB1 intron ve exon probları için yüzde geçirgenlik %50 – 100'dür ve maruz kalma süreleri 0,25 – 0,60 saniye arasında değişmektedir.
  4. Ayrıca, fotobleaching ve/veya kamera piksellerinin doygunluğunu önleyen koşullar altında görüntüler alıp alın. Deneyimlerimize göre, arka plan ve sinyal yoğunluğu arasında en az ~ on kat fark olmalıdır. Birkaç piksel/alanın doygunluğu, numunedeki spesifik olmayan sinyaller (örneğin, kapaktaki kir, hücre dışındaki prob agregaları) nedeniyle oluşabilir, ancak yalnızca doymuş bölgeler niceme dahil değilse.
  5. z yığınının alımını ayarlamak için DAPI kanalındaki örneğe odaklanın. DAPI lekeli çekirdeklerin odak dışı kaldığı mesafelerde z yığınının üst ve alt kısmını seçin. Kullandığımız z-yığını adım boyutu dilim başına 0,25 μm'dir ve toplam z-yığını tüm hücreyi kapsamalıdır (MCF-7 hücrelerinde yaklaşık 10 μm). Ancak, z-yığını adım boyutu kullanılan hedefe göre değişecektir ve Nyquist örnekleme kriterini izlemelidir.
    NOT: intronlar genellikle sadece çekirdekte bulunur; ancak, eksonlar hem çekirdekte hem de sitoplazmdadır. Bu nedenle, z yığınını yukarıda açıklandığı gibi ayarlamak, z yığını tüm hücreyi kapsadığı için intron ve exon etiketlemesinin çoğunu yakalar.
  6. Tipik olarak, hücreler arasındaki yanıt ve varyasyonun büyüklüğünün anlık görüntüsünü yakalamak için ön deneylerde nicel analiz için en az 200 hücre görüntüleyin.
  7. Bazı görüntülenmiş hücreler, analiz ardışık düzeni (örneğin, görüntünün kenarlıklarına dokunan hücreler, apoptotik/mitotik hücreler) tarafından filtrelenecekleri için son analizden (yani bırakma oranından) hariç tutulur.
    NOT: Görüntü alanlarını seçerken, akılda tutulması gereken birkaç faktör vardır. DAPI etiketli, nükleer floresan tarafından tanımlanan eşit yayılmış, örtüşmeyen hücrelere sahip alanları seçin. Ayrıca, kısmi hücrelerin sayılmasını önlemek için görüntü alanının kenarları boyunca en az çekirdek sayısına sahip alanları seçmeye çalışın. İstatistiksel analiz gerektiren deneyler için her zaman otomatik, tarafsız görüntüleme tercih edilir.
  8. Edinimden sonra, 10 döngü (yani yineleme sayısı) kullanarak agresif bir restoratif algoritma kullanarak görüntüleri deconvolve edin. Görüntü analizi için maksimum yoğunluklu projeksiyonlar oluşturun (belirli bir 3D analiz gerekiyorsa bu adımı atla). Kullanılan kameranın bit derinliğine göre tüm projeksiyon görüntülerini kaydedin; Bizim durumumuzda 16-bit TIFF gri tonlamalı görüntüler kaydedildi. RGB görüntüler, bilgi kaybına neden olan daha az bit derinliğine sahiptir; bu nedenle, RGB görüntüler görüntü analizi için uygun değildir.

7. Görüntü analizi

  1. Talimatları okuyun ve jupyter dizüstü bilgisayarı github'dan indirin(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Python anakonda dağıtımını (https://www.anaconda.com/distribution/) sürüm 3.6 veya üst sürümünü yükleyin.
  3. Anaconda istemini açın ve anakonda için Basit ITK Yüklemek için yükleme komutunu yazın(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Anaconda navigator'ı açın ve jupyter dizüstü bilgisayarı başlatın. Dizinleri ve dosyaları gösteren bir web tarayıcısı açacaktır. Github'dan indirilen jupyter not defterini içeren dizine ulaşmak için dizin yapılarına göz atın.
  5. Not defterini açın ve Shift ve Enter tuşlarına aynı anda basarak her hücreyi çalıştırın.
  6. Not defterinde sağlanan her işlevin ve adımın ayrıntılarını izleyin. Farklı bir görüntü kümesi için bazı parametre değerlerinin değiştirilmesi gerekebilir.
    NOT: Kısacası, çekirdekler 251 piksel blok boyutuyla yerel eşik kullanılarak DAPI kanalından bölünür, delikler doldurulur ve 100 pikselden küçük nesneler kaldırılır. Dokunan çekirdekler bir havza algoritması kullanılarak bölündü. Nükleer maske daha sonra 100 piksel genişletildi ve çekirdekleri havza olarak kullanarak dokunaklı nesneleri ayırmak için su havzası kullanıldı. Sabit durum RNA'sını (eksonları) tanımlamak için Otsu eşiği kullanıldı; transkripsiyonel aktif aleller (intron) için önce Gauss bulanıklığı (sigma=1) uygulandı ve daha sonra maksimum entropi eşiği kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SmFISH yoluyla hormonal yanıtları analiz etmek için, örnek olarak, NIEHS Superfund Araştırma Programı7'yekatılım bağlamında çevre felaketlerinde endokrin bozucu kimyasalların varlığını belirlemek için yüksek verim testlerinde kullanılan östrojen reseptör (ER) modelini seçtik. Bu deneyde, bağlı MCF-7 meme kanseri hücreleri 24 saat boyunca ER agonist 17β-estradiol (E2, 10 nM) veya araç (DMSO) ile tedavi edildi. GREB1 intronic (Atto 647N, Şekil 1'dekırmızı) ve exonic (Qu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan smFISH metodolojisi daha önce yayınlanan7, 12,14protokollerine dayanmaktadır. Bu protokolde, ıslak laboratuvardan (tohumlama yoğunluğu, sabitleme süresi, permeabilizasyon ve prob konsantrasyonu dahil) görüntüleme ve görüntü analizine kadar optimize edilen kritik adımları açıklıyoruz ve gen transkripsiyonunun tek hücreli analizini yapmak isteyen laboratuvarlar için tam bir deneysel boru hattı sağlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM, FS ve MGM NIEHS (Proje 4, P42ES027704, PI, Rusyn) tarafından finanse edilmektedir. MAM, FS, RMM, MGM ve PKS, CPRIT tarafından finanse edilen GCC İleri Mikroskopi ve Görüntü Bilişim Merkezi (RP170719) tarafından desteklenmektedir. Görüntüleme ayrıca Baylor College of Medicine'daki Entegre Mikroskopi Çekirdeği tarafından NIH (DK56338 ve CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Kapsamlı Kanser Merkezi ve John S. Dunn Gulf Coast Kimyasal Genomik Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
17 ve beta; EstradiolSigma-AldrichE2257CAS Numarası 50-28-2
Ambion SSC (20X) Tampon, Rnaz İçermeyenThermoFisher ScientificAM9770
L-Glutamin ve 4.5 g/L Glikozlu Corning DMEMFisher ScientificMT10017CVInvitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Tarafından Üretilmiştir Sodyum piruvat
Dekstran Sülfat İçermez, %50 Çözelti SterilSigma-Aldrich3730-100ML
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu Ca++/Mg++Corning21030CVCalbiochem Etanol Tarafından Üretilmiştir
, 200 Kanıt (% 100)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24 Kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı TC ile Muamele Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıCorning353047Decon Laboratories Fetal Tarafından Üretilmiştir
Sığır Serumu (FBS), 500 mLFisher Scientific50-753-2978Gemini Bio Products tarafından üretilmiştir
GE Healthcare DeltaVision LIVE Yüksek Çözünürlüklü Dekonvolüsyon MikroskobuGE Healthcare
Hyclone Su, Moleküler Biyoloji SınıfıFisher ScientificSH3053802
Daldırma Yağı 1.516GE Healthcare Yaşam Bilimleri29162940GE Tarafından Üretilmiştir Sağlık Biyo-Bilim
L-glutamin ÇözeltisiFisher ScientificMT25005ClCorning
MCF-7 hücreleritarafından üretilmiştir ATCCHTB-22
Moleküler Sınıf FormamidPromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA AmaçOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076VWR
Paraformaldehit, %16 Çözelti, EM Dereceli ElektronMikroskobu Bilimleri15710
Penisisilin-Streptomisin ÇözeltisiFisher ScientificMT3001ClCorning
Ribonükleozit Vanadil KompleksiVWR101229-716Üretilmiştir New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780 tarafından üretilmiştir
Sodyum piruvat, 100 mMFisher Scientific11-360-070Gibco
Thermo Scientific tarafından üretilmiştir Cam Lameller, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mLFisher ScientificBP151-100Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Çözeltisi tarafından üretilmiştir %0.25Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Antifade Montaj Ortamı 10 mLFisher ScientificNC9265087Vector Laboratories tarafından üretilmiştir
Tarafından

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA Floresan Yerinde HibritlemeGREB1 ntron Ekzon Problarstrojen Resept r Agonisti TedavisiGeni Alan Epifloresans MikroskopisiG r nt Analiz AkDAPI Kar BoyamaNukleaz ermeyen Su ile Durulama

İlgili makaleler