Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

Özet

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Özet

Nötron makromoleküler kristalografinin (NMX) kullanımı, inşa edilen yeni NMX kiriş hatları ve yapı iyileştirme yazılımının kullanılabilirliğinin artması sayesinde son on yılda belirlenen çoğu yapıyla hızla genişliyor. Bununla birlikte, şu anda NMX için mevcut olan nötron kaynakları, X-ışını kristalografisi için eşdeğer kaynaklardan önemli ölçüde daha zayıftır. Bu alandaki gelişmelere rağmen, nötron kırınım çalışmaları için, özellikle de daha büyük makromolekülleri ve kompleksleri inceleme eğilimi ile her zaman önemli ölçüde daha büyük kristaller gerekecektir. Bu nedenle, NMX'in genişlemesi için daha büyük kristaller yetiştirmeye uygun yöntemler ve enstrümantasyonda daha fazla iyileştirme yapılması gerekir.

Bu çalışmada, laboratuvarımızda geliştirilen ve mikroskopla monte edilmiş bir video kamera aracılığıyla gerçek zamanlı gözlemi kristalizasyon çözeltilerinin hassas otomatik kontrolüyle (örneğin, çökelti konsantrasyonu, pH, katkı maddesi, sıcaklık) birleştiren rasyonel stratejiler ve bir kristal büyüme tezgahı (OptiCrys) sunuyoruz. Daha sonra bu sıcaklık ve kimyasal bileşim kontrolünün model çözünür proteinleri kullanarak optimum kristalizasyon koşullarının aranmasını nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Kristalizasyon faz diyagramı hakkında kapsamlı bilgi, herhangi bir kristalizasyon deneyi için başlangıç konumunu ve kinetik yolu seçmek için çok önemlidir. Rasyonel bir yaklaşımın, çok boyutlu faz diyagramlarının bilgisine dayanarak üretilen kristallerin boyutunu ve sayısını nasıl kontrol edebileceğini gösteriyoruz.

Giriş

Proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisini ve fizyolojik yolların mekanizmasını anlamak genellikle hidrojen atomlarının (H) konumlarını ve yükün bir protein içinde nasıl aktarıldığını^bilmeyedayanır¹,². Hidrojen atomları X ışınlarını zayıf bir şekilde dağıttığından, konumları sadece çok yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınım verileri (>1 Å)^3,4ile belirlenebilir. Tersine, nötron kristalografisi hidrojen ve döteryum (H^2,hidrojen izotopu) atomlarının oksijen, azot ve karbon⁵olarak kabaca eşit büyüklükte saçılma uzunluklarına sahip olması nedeniyle biyolojik makromoleküllerde hidrojen atomlarının doğru bir konumunu elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mevcut nötron kaynaklarından gelen nötron akısı X-ışını ışınlarından daha zayıftır, bu nedenle bu genellikle^2,3için telafi edilmelidir. Bu, H² ile H alışverişi ve / veya hidrojenlerin tutarsız saçılmasını azaltmak ve kırınım görüntülerinin sinyal-gürültü oranını artırmak için kristallerin hacmini artırarak elde edilebilir.

Hem X-ışını hem de nötron biyo-makromoleküler kristalografi için büyük ve yüksek kaliteli kristaller elde etmek için çeşitli kristalleşme yaklaşımları vardır (ilgili şematik faz diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir⁶. Buhar difüzyonunda, bir protein ve kristalizasyon çözeltisinin karışımından hazırlanan bir damlacık, zaman içinde, su veya diğer uçucu türlerin buharlaşması yoluyla, aynı kristalizasyon çözeltisinin daha yüksek bir çökelti konsantrasyonunu içeren bir rezervuara karşı denge edilir. Damlacıktaki protein ve çökelti konsantrasyonundaki artış, spontan çekirdeklenme için gerekli olan aşırı doyma ve ardından bu çekirdeklerde kristal büyümesine yol açar^6,7. Buhar difüzyonu kristal yetiştirmek için en sık kullanılan teknik olmasına rağmen⁴, kristalizasyon işlemi tam olarak kontrol edilemez⁸. Serbest arayüz difüzyon yönteminde, kristalizasyon çözeltisi konsantre bir protein çözeltisine yayılır ve sistemi çok yavaş bir şekilde aşırı doygunluğa yönlendirir. Bu yöntem, yavaş karıştırma hızı⁶, 9 , 10^,11,12olan bir toplu iş yöntemi olarak düşünülebilir. Parti yönteminde, protein hızla aşırı doymaya yol açan bir kristalizasyon çözeltisi ve buna karşılık birçok kristal ile tekdüze çekirdeklenme ile karıştırılır^3,7. Bu yöntem, şu anda Protein Veri Bankası'na yatırılan tüm yapıların yaklaşık üçte birini oluşturmuştır. Diyaliz yöntemi aynı zamanda yüksek kaliteli ve iyi dağınık protein kristalleri yetiştirmek için de kullanılır. Diyaliz yönteminde, çökelti molekülleri bir rezervuardan yarı geçirgen bir membrandan protein çözeltisi ile ayrı bir odaya yayılır. Denge kinetiği sıcaklık, membran gözenek büyüklüğü ve protein örneklerinin ve kristalizasyon ajanlarının hacmi ve konsantrasyonu gibi çeşitli faktörlere bağlıdır⁶.

Kristalizasyon faz diyagramları, bir proteinin farklı durumlarını farklı fiziksel veya kimyasal değişken^3'ünbir işlevi olarak tanımlamak için kullanılabilir. Şekil 1'degösterildiği gibi, her kristalizasyon tekniği, böyle bir diyagram⁶, 10^,13'ünçekirdeklenme ve metastable bölgelerine ulaşmak için farklı bir kinetik yörünge kullanılarak görselleştirilebilir. Bu, protein çözünürlüğü ve kristal ile çözelti arasındaki termodinamik dengenin gözlendiği protein konsantrasyonu hakkında bilgi sağlar, böylece çekirdeklenme ve büyüme için en uygun koşulları bulur^3,14. İki boyutlu faz diyagramında, protein konsantrasyonu bir değişkenin işlevi olarak çizilir ve diğer değişkenler sabit tutulur¹⁵. Böyle bir faz diyagramında, protein konsantrasyonu çözünürlük eğrisinin altında olduğunda, çözelti az doymamış bölgededir ve çekirdeklenme veya kristal büyümesi gerçekleşmez. Bu eğrinin üzerinde, protein konsantrasyonunun çözünürlük sınırı^3,14'tendaha yüksek olduğu aşırı doyma bölgesi vardır. Bu daha sonra üç bölgeye ayrılır: metastable bölge, spontan çekirdeklenme bölgesi ve yağış bölgesi. Metastable bölgede, aşırı doyma, çekirdeğin makul bir süre içinde gerçekleşmesi için yeterli değildir, ancak tohumlu kristallerin büyümesi gerçekleşebilir. Aşırı doymanın çok yüksek olduğu yağış bölgesinde toplama ve yağış tercih edilir^14,15.

Spontan çekirdeklenme için yeterli aşırı doyma sağlandığında, ilk çekirdek¹⁰görünecektir. Kristallerin büyümesi, çözünürlük sınırına ulaşılana kadar protein konsantrasyonunda bir azalmaya yol açar. Aşırı doyma, çözünürlük eğrisinin yakınında kaldığı sürece, kristallerin boyutunda önemli bir değişiklik olmayacaktır. Bununla birlikte, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklığındaki ve kimyasal bileşimindeki varyasyonların (örneğin, çökelti konsantrasyonu) protein çözünürlüğünü etkileyeceği ve daha fazla kristal büyümesinin başlatılmasına yol açabileceği gösterilmiştir^8,13,16.

Diyaliz kaliteli kristal büyümesi için avantajlı olduğundan, Şekil 2'degösterilen OptiCrys kristalizasyon tezgahı, kristalleşmeyi tam otomatik bir şekilde kontrol etmek için laboratuvarımızda tasarlanmış ve geliştirilmiştir^8. Bu amaçla LabVIEW ile Peltier elemanları ile temas halinde akan rezervuar diyaliz kurulumunun sıcaklığının elektronik kontrolör ve soğutucu aracılığıyla kontrol ve izlenmesini sağlayan bir yazılım yazılmıştır. Aynı yazılım ayrıca çok kanallı akışkan bir sistem kullanarak kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini (örneğin kristalizasyon ajanlarının değişimi) otomatik olarak düzenler. Ayrıca, kristalizasyon işlemini görselleştirmek ve kaydetmek için dijital kamera ve ters mikroskop kullanılır. Farklı amaçlar için kristal yetiştirmek için 15 μL ve 250 μL hacimli iki kristalizasyon odası mevcuttur. Kristalizasyon işlemi tersine çevrilebilir olduğundan, numune zarar görmediği sürece protein çözeltisinin sadece birkaç mikrolitresi ile farklı koşullar için tarama mümkündür⁸. Sonuç olarak, bu yöntemin kullanılması kullanılan protein malzemesi miktarını en aza indirir.

Önceki çalışmalardan⁸Kristal büyüme sürecinde, yerinde gözlemlerin düzenli zaman aralıklarında yapılması gerektiği açıktır. Bunlar, gözlem altındaki olaya (yağış, çekirdeklenme veya kristal büyümesi) bağlı olarak birkaç saniye ile birkaç gün arasında değişebilir.

OptiCrys ile kristal büyümesinin optimizasyonu, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon fazı diyagramlarına dayanmaktadır. Sıcaklığın doğrudan bir işlevi olarak çözünürlüğe sahip proteinler söz konusu olduğunda, tuzlama rejiminden yararlanmak mümkündür¹⁸. Bu, protein-çökağan faz diyagramları kullanılarak görselleştirilebilen çözeltinin iyonik gücünün artırılmasının proteinin çözünürlüğünü azalttığı yerdir. Aynı şekilde, ters çözünürlüğe sahip proteinler tuzlama rejiminden yararlanabilir¹⁸. Çekirdeklenme çekirdeklenme bölgesinde, metastable bölgesinin yakınında gerçekleşir ve kristal büyümesi daha sonra protein konsantrasyonu çözünürlük sınırına ulaşana kadar faz diyagramının metastable bölgesinde gerçekleşir. Şekil 3A'dagösterildiği gibi, yeni çekirdeklenmeyi önlemek için kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutmak için sabit kimyasal bileşim sıcaklığı azaltılabilir. Kristaller ikinci kristal/çözelti dengesi elde edilene kadar büyür ve bundan sonra kristallerin boyutunda daha fazla artış gözlenmez. Kristaller istenen boyuta ulaşana kadar sıcaklık birkaç kez azalır. Şekil 3B'de , sabit sıcaklıkta, çökelti konsantrasyonu arttırılması çözeltiyi metastable bölgesinde tutar. Bu işlem daha sonra büyük kristaller elde etmek için birkaç kez tekrarlanabilir. Sıcaklığı değiştirmek ve kristalizasyon çözüm koşullarını manipüle etmek, aşırı doyma seviyelerini kontrol ederek, OptiCrys 5^,8,14tarafındantam ve otomatik olarak kontrol edilen kristallerin çekirdeklenme ve büyümesini ayırmak için iki güçlü araçtır.

Literatürde ve PDB'de sıcaklık kontrollü veya sıcaklık ve çökelti konsantrasyon kontrollü kristalleşme ile yetiştirilen protein kristallerinin yanı sıra elde edilen göreceli kırınım verileri örnekleri mevcuttur. Bunlar arasında insan γ-kristalin E, PA-IIL lectin, maya inorganik pirofosfataz, ürat oksidaz, insan karbonik anhidraz II, YchB kinaz ve laktat dehidrogenaz^5,14,17,18bulunmaktadır.

OptiCrys NatX-ray ile ticarileştirilmiş olsa da, bu cihaza veya sunduğu seri yaklaşıma erişimi olmayan birçok laboratuvar vardır. Bu tekniğin alternatifi, çeşitli hacimlerde ticari olarak kullanılabilen plastik mikrodiyaliz düğmelerini kullanmaktır. Bunları kullanarak, sıcaklık ve kimyasal bileşim manuel olarak ayarlanabilir ve değiştirilebilir. Mikrodiyaliz düğmelerinin muayenesi yerinde yapılamaz ve bunun yerine optik mikroskopla manuel olarak yapılmalıdır. Numuneyi titreşimsiz sıcaklık kontrollü bir inkübatörde tutarak sıcaklık kontrolü sağlanabilir. Kristalizasyon deneylerinin tekrarlanabilir olmasını sağlamak için sıcaklığı sabit tutmak önemlidir. Sıcaklıktaki önemli değişim kristallerin zarar görmesine veya tahrip olmasına da neden olabilir⁵.

Burada, nötron protein kristalografisi için uygun büyük, yüksek kaliteli kristallerin büyümesi için numune hazırlama ve kontrol yazılımının kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu adım adım prosedür, oluşturulan kristallerin boyutunu ve kalitesini kontrol etmek için bir başlangıç pozisyonu ve kinetik yol seçmek için kristalizasyon faz diyagramından yararlanmak için tasarlanmıştır. Ek olarak, büyük, yüksek kaliteli kristaller elde etmek için aynı mantığı kullanan mikrodiyaliz düğmeli kristallerin yetiştirilmeleri için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Protokol

1. Mikrodiyaliz düğmeli diyaliz yöntemi

1. Numune hazırlama
   1. Son konsantrasyonu 30 mg·mL^-1olan bir çözelti elde etmek için 1 mL CH 3 COONa tamponunda (100 mM sodyum asetat, pH 4)₃₀mg tavuk yumurtası-beyaz lysozyme'yi liyofilize toz olarak eriterek protein çözeltisi hazırlayın.
   2. Numuneyi 13.000 × g'da 277 K'da 10 dakika santrifüj edin. Bu işlem, kristalizasyon işlemine başlamadan önce tüm agregaların kaldırılmasına yardımcı olur.
   3. Numunenin emiciliğini 280 nm'de kontrol edin ve Bira-Lambert denklemini (A= φcl) kullanarak protein konsantrasyonu hesaplamayın.
      NOT: Bira-Lambert denklemine göre, elektronik absorbans (A), sabit bir optik patlengt (l, cm) verilen emici bir türün konsantrasyonu (c, mg·mL^-1)ile doğru orantılıdır. Bu doğrusal ilişkinin gradyanı azı yok olma katsayısıdır (ε, 280 nm'de lysozim için 2.64 mL·mg⁻¹·cm⁻¹)¹⁹' dur. Aromatik amino asitlerin (tirozin, triptofan ve fenilalanin) yan zincirleri ve sistein kalıntıları arasındaki disülsit bağları spektroskopik olarak izin verilen π - π* geçişlerinden kaynaklanan ~280 nm'de güçlü emiciliğe sahiptir. Proteinlerin çoğunluğu bu kalıntıları içerdiğinden, protein konsantrasyonu, yok olma katsayısı bilgisi göz önüne alındığında, emicilik 280 nm'de ölçülerek kolayca hesaplanabilir.
   4. Şekil 4'te gösterildiği gibi kristalizasyon çözümleri hazırlayın. Kristalizasyon çözümünü hazırlamadan önce tüm stok çözümlerini 0,22 μm Millipore filtrelerle filtreleyin.
2. Kristal büyümesi
   1. Uygun moleküler ağırlık kesme (6-8 kDa) ile bir selüloz diyaliz zarı kesin ve damıtılmış suya batırın.
      NOT: Diyaliz membran diskleri mikrodiyaliz düğmeleri için ticari olarak mevcuttur, ancak diyaliz tüpü kullanılıyorsa, iki membran katmanını tüpten ayırmak için kenarları kesmeyi unutmayın.
   2. 24 kuyulu bir tepsinin kuyularını Şekil 4'tegösterildiği gibi 2 mL kristalizasyon çözeltisi ile doldurun.
      NOT: Daha büyük hacimli düğmeler kullanılıyorsa (örneğin, 200 μL), verimli değişim sağlamak için 50 mL tüpleri en az 5 mL kristalizasyon çözeltisi ile doldurun.
   3. Şekil 5A'da gösterildiği gibi mikrodiyaliz düğmesinin haznesine 35 μL lysozyme çözeltisiekleyin/Pipetleyin.
      NOT: Kapatıldığında 30 μL diyaliz düğmesinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, toplam 35 μL protein örneği anlamına gelen 5 μL ek proteinden oluşan ekstra bir hacim (ölü hacim) eklenmelidir. Bu ek protein örneği, Şekil 5B'de gösterildiği gibi odanın üstünde hafif kubbeli bir şekil oluşturur ve bu da hava kabarcıklarının oluşumunu önler.
   4. Uygun boyutta bir aplikatör alın ve elastik O-halkayı ekstremitesine yerleştirin (Şekil 5C). Daha sonra daha önce hafifçe silinmiş /süzülmüş olan zarı bir parça lifsiz kağıt kullanarak diyaliz düğmesinin haznesinin üzerine yerleştirin. Kağıdı uygularken hazneye toz koymamaya dikkat edin. Elastik O-halkayı aplikatörden diyaliz düğmesinin oluğuna aktararak diyaliz zarını yerine yerleştirin (Şekil 5C).
      NOT: Ele almanın kritik anı, elastik O-halkayı aplikatörden diyaliz düğmesinin oluğuna aktararak odanın üstündeki diyaliz zarını sabitlemektir. Hava kabarcıklarının protein odasındaki örnekle çevrelenmesini önlemek için tüm hareketler mükemmel bir şekilde senkronize edilmelidir. Sertliğini bilmek için uygulamadan önce elastik O-halkayı germek, uygulaması sırasında zarın bir kısmını tutmak için cımbız kullanmak ve bir model protein ile ilk test deneylerini yapmak yararlıdır.
   5. Düğmeyi cımbız kullanarak kuyuya veya 50 mL tüpe aktarın (Şekil 5D).
   6. Kuyuyu bir kapakla örtün, kuyuyu kapatmak için gres üzerine hafifçe bastırın(Şekil 5E).
      NOT: Kuyuların üstünde gres yoksa, deneye başlamadan önce bunu eklediğinizden veya cam kapak kapağı yerine bir bant parçası kullandığınızdan emin olun. Mikrodiyaliz düğmeleri kullanılarak protein kristalizasyonu prensibi Şekil 5'tegösterilmiştir.
   7. Numuneyi 293 K'da, temoregüle edilmiş bir inkübatörde tutun. Kullanılan protein ve kristalizasyon koşullarına göre farklı sıcaklıklar gerekebilir.
      NOT: Şekil 4'te gösterilen aynı kristalizasyon koşulları ızgarası (çökelti konsantrasyonunun çeşitli olmasına izin verir) sıcaklığın bir işlevi olarak taranabilir. Böyle bir durumda, aynı kristalizasyon plakası çoğaltılmalı ve her kopya farklı bir sıcaklıkta düzenlenmiş bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Bu, birkaç titreşimsiz termoregüle inkübatörün mevcut olmasını gerektirir.
   8. Tepsiyi veya tüpleri kristaller için kontrol edin (Şekil 4) ve her tepside ne olduğunu ayırt etmek için genellikle günlük olarak düzenli olarak not alın. Yanlış olumlu sonuçlardan kaçınmak ve tozu kristallerden ayırt etmek için iyi notlar gereklidir.

2. OptiCrys kullanarak kristal büyüme süreci

1. Numune hazırlama
   1. Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi bir protein çözeltisi ve diyaliz zarı hazırlayın.
   2. NaCl (4 M) ve CH₃COONa pH 4 (1 M) stok çözeltilerini hazırlayın ve 50 mL tüplere filtreleyin.
   3. Protein çözeltisini (30 mg·mL -1 ile^{15 μL}lysozyme) sıcaklık kontrollü akan rezervuar diyaliz kurulumunun diyaliz odasına ekleyin. Sıcaklık kontrollü akan rezervuar diyaliz kurulumunun ayrıntıları için Şekil 6'ya bakın. OptiCrys iki diyaliz odasına sahiptir, minimum hacim 15 μL ve maksimum hacim 250 μL'dir.
   4. Overchamber'ı diyaliz zarı ile örtün ve zarı elastik O-halka ile sabitleyin (Şekil 6B).
      NOT: Bu kurulum, her odanın doğrudan diyaliz zarı ile kapatıldığı mikrodiyaliz düğmelerinden farklıdır. Akış hücresinde, diyaliz zarı bunun yerine aşırı pahlara sabitlenir ve kristallerin çıkarılmadan montajına izin verir. Bu amaçla, overchamber rezervuardan sökülebilir.
   5. Overchamber'ı çevirin ve diyaliz odasının üzerine yerleştirin. İki parça arasında sıkışan tüm havayı çıkarmak ve haznedeki kabarcıklardan kaçınmak için yavaşça ve hafifçe bastırın (Şekil 6C). Hava kabarcıklarını ve numune kaybını önlemek için antrenman yaparken model protein ile pratik yapmak avantajlı olabilir.
   6. Rezervuarı, hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçınmak için tekrar dikkatli olarak, üstçamın üzerine hafifçe vidalayarak konumuna sabitlayın. Rezervuarın aşırı sıkılması, kristalizasyon odasında kabarcıklar da oluşturabilir(Şekil 6D).
   7. Kristalizasyon çözeltisini ekleyin ve rezervuar odasını hava geçirmez kapakla örtün. (Şekil 6G). Rezervuarın maksimum hacmi 1 mL'dir.
   8. Bu montajı aktarın ve pirinç desteğine yerleştirin. Bu destek, sıcaklığı kontrol etmek için kullanılan Peltier elemanlarıyla temas halindedir.
   9. Şekil 6'dagösterildiği gibi, hava geçirmez kapak diyaliz odasının üst aydınlatmasını sağlamak için optik bir pencere ile donatılmıştır. Işığın hazneden geçmesini sağlayan ışık kaynağını (Şekil 2) pencereye koyun.
   10. Rezervuar odası, sürekli bir akış hücresi olarak çalışmasına izin vermek için bir pompaya bağlanabilir. Stok çözeltilerini ve damıtılmış suyu içeren 50 mL boruların üstündeki boruyu Şekil 7'degösterildiği gibi döner vanaya bağlayın.
       NOT: Deney sırasında kristalizasyon çözeltilerinin otomatik olarak hazırlanması ve değiştirilmesi isndenmezse, 2.1.10 adımını atla. Böyle bir durumda, kristalizasyon çözeltisi hazırlanmalı ve rezervuar manuel olarak önceden doldurulmalıdır.
2. Yazılım
   1. Bilgisayarı açın ve Croissance cristalline [Kristal büyümesi]yazılımını başlatın. Bu kontrol yazılımı LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) ile yazılmıştır ve kullanıcı dostu bir grafik arayüz sunar. 4 farklı grafik arayüz içerir (Accueil [Hoş Geldiniz], Paramétrage [Ayar], Essai [Test], ve Bakım [Bakım]) (Şekil 8).
      NOT: Fransızca çeviriler parantez içindedir.
   2. Şekil 8'de gösterildiği gibi düğmeyi tıklatarak Bakım görünümünü seçin. Bu görünüm şu anda en sık kullanılan görünümdür ve kullanıcıların deneme sırasında parametrelerin çoğunu denetlemesine izin verir.
      NOT: Bakım görünümüne tıklanından sonra, sıcaklık veya ışık gibi parametreleri kontrol etmek için farklı bölümlere sahip yeni bir pencere görünecektir. Şekil 8'de bu görünümün 8 farklı bölümü oklar ve çerçevelerle gösterilir. Aşağıdaki adımlarda, her parametrenin yazılım kullanılarak nasıl denetlendiğini gösteririz.
   3. Régulateur de température [Sıcaklık kontrolörü] bölümü sıcaklığın kontrol ve izlenmesini sağlar. Açmak için Şekil 8'dekibir numaralı (1) düğmeye tıklayın.
      NOT: OptiCrys sıcaklık aralığı 233.0 – 353.0 ± 0.1 K'dir.
   4. Konsinye [setpoint] bölümünde sıcaklığı ayarlayın ve enter tuşuna basın (Şekil 8(2)). Bu düğmenin altında 2 iz (kırmızı ve sarı) olan bir grafik vardır. Kırmızı iz son (sıralı) sıcaklığı, sarı iz ise geçerli sıcaklığı gösterir. Şekil 8'de(2)gösterildiği gibi, sıcaklık 20 °C olarak ayarlanır.
      NOT: Kristal büyüme bölümünde açıklandığı gibi bir kristal yetiştirmek için birçok sıcaklığın seçilmesi gerekecektir. Sıcaklığı değiştirmek için, konsinye [setpoint] bölümüne her yeni sıcaklığı ekleyin ve klavyedeki Enter düğmesine basın.
   5. Şekil 8'deki Lumières [Işıklar] bölümünden parlaklığı artırarak ışığı açın. Işık parlaklığı 0 ile 100 arasında değişir, "0" ışığın kapalı olduğunu ve "100" de ışığın maksimum yoğunluk ve parlaklığa ayarlı olduğunu gösterir. Işığı artırarak, Mikroskop bölümünde, diyaliz odasının içini görebilirsiniz. Deney sırasında hücredeki parlaklık değişebilir; diyaliz odasının içinde net bir şekilde görselleştirmek için parametreleri ayarlayın. Büyütme, daha iyi görüntüleme için "yakınlaştırma" nın önündeki + ve – düğmeleri kullanılarak da artırılabilir veya azaltılabilir.
   6. Mikroskop bölümünün sağ tarafında, her kristalizasyon deneyi için ilgili bilgileri depolamak için birkaç bölüm vardır. Her kullanıcı kristalizasyon koşulları, protein adları ve kullanılan diyaliz zarının moleküler ağırlık kesimi hakkında bilgi depolamak için bir klasör oluşturabilir (Şekil 8(3)).
   7. Kullanıcı, denemeyi Nom Dossier [Klasör adı]üzerine yazarak bir ad tanımlayabilir. Dosya [Klasör düğmesi] (Şekil 8'deyeşil çerçeveyle gösterilir) tıklatıldığında yeni bir pencere açılır. Bu pencerede, deneme için tanımlanan tüm bilgileri içeren bir metin dosyası olacaktır. Ayrıca, zaman damgalı görüntüler ileride işlenmek üzere bu klasöre kaydedilir.
   8. NB Görüntüleri bölümünden, deneme sırasında alınması gereken görüntü sayısını seçin. Bunlar arasında istenen zaman aralığıyla birlikte sağ paneldeki görüntülerin sayısını belirtin (örneğin, min, saat, gün). Şekil 8, bir dakika içinde sıfır görüntü kaydetmek için yazılım kurulumunu gösterir.
      NOT: Stok çözeltilerini karıştırmak ve kristalizasyon çözeltisini rezervuar odasına enjekte etmek için Pompe [Pompa] bölümünü kullanın. Sıvı karıştırma sisteminin prensibinin açıklaması için bölüm 2.1.10 ve Şekil 7'ye bakın.
   9. Etape 1'deki stok çözeltilerinin giriş konsantrasyonları [Adım 1]: çözelti stokları. Bir sonraki bölümde kristalizasyon deneyi için NaCl 4 M ve CH₃COONa 1 M pH 4 kullanılacaktır.
      NOT: Stok çözeltilerinin konsantrasyonları azı dişleri birimlerindedir.
   10. Her çözeltinin son konsantrasyonunun tanımlanması. Örneğin NaCl için 0,75 M ve CH 3 COONa pH₄için 0,1 M. Bunları Etape 2'deki son konsantrasyon bölümüne (Şekil 8) girin [Adım 2]: çözelti à préparer [hazırlamak için çözüm]. Şekil 8'dekırmızı bir çerçeveyle gösterilen Hesap [İşlem] düğmesine basın. Karıştırmada kullanılacak her stok çözeltisinin son hacmi, her konsantrasyon panelinin önündeki hacim panelinde görüntülenir.
   11. Lancer préparation [Fırlatma hazırlığı] düğmesine basın (Şekil 8). Şekil 7'degösterildiği gibi, döner vana her stok çözeltisini alır ve bir anahtarla karıştırma tüpüne enjekte eder.
   12. Kristalizasyon çözeltisi hazırlandıktan sonra Etape 3'teki Entrée solution [Solution Entry] düğmesine tıklayın [Adım 3]: Pompa bölümünün akısı (Şekil 8'dekisarı çerçeve). Anahtar, yeni kristalizasyon çözeltisini karıştırma tüpünden rezervuar odasına enjekte etmek için değişir. Takas işlemini durdurmak için Arrêt dağıtım [Dağıtım Durağı] düğmesine basın.
       NOT: Deney sırasında kristalizasyon işlemini gözlemleyin ve gözetim yazılımının ilgili grafik arayüzünde sıcaklık, kristalizasyon çözeltisi ve yakınlaştırma gibi parametreleri değiştirin. Yazılımı kullanarak, deneme sırasında hava geçirmez kapağı veya akış hücresini çıkarmaya gerek yoktur, bu nedenle tek değişken kullanıcının yazılım aracılığıyla değiştirdiği değişken olacaktır.
3. Büyük kristal büyümesi
   1. Diyaliz odasına 30 mg·mL -1 konsantrasyonda^{15 μL} lysozyme ekleyin (Şekil 6A).
      NOT: Protein örneğini bölüm 1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   2. Bölüm 2.1 ve Şekil 6'daaçıklandığı gibi sıcaklık kontrollü akan rezervuar diyaliz kurulumunu monte edin.
   3. Kristalizasyon çözeltisini hazırlayın. Numune hazırlamadan önce tüm stok çözeltilerini 0,22 μm filtrelerle filtrelemeyi unutmayın. Bu deney için kristalizasyon çözeltisi 0,75 M NaCl ve 0,1 M CH₃COONa pH 4 içerir. Bu, manuel olarak veya 2.2.10 ila 2.2.12 bölümlerinde açıklandığı gibi rezervuar odası ve pompalama sistemi kullanılarak eklenebilir.
   4. 2.2.3 ve 2.2.4 bölümlerinde açıklandığı ve Resim 8'de gösterildiği gibi sıcaklığı 295 K olarak ayarlayın. İlk koşullar altında, diyaliz odası ile rezervuar arasındaki dengeye yaklaşık 90 dakika sonra ulaşılacak ve ilk görünür çekirdek 22 saat sonra görünecektir.
   5. Kristallerin boyutunda daha fazla görünür değişiklik gözlenene kadar kristallerin büyümesine izin verin(Şekil 9, panel 1).
      NOT: Çekirdeklenme süresini belirlemek ve kristallerin boyutundaki varyasyonu ölçmek için, NB Görüntüleri bölümünde saatte sırasıyla 4 veya 3 görüntü olan her 15 veya 20 dakikada bir görüntü kaydedin. Protein denatürasyonunun yerinde gözlemlenmesi için, toplama ve çökeltme veya kristal çözünmesi veya çekirdeklenmesi, tipik olarak birkaç saniye ila birkaç on dakika arasında gereklidir. Bununla birlikte, kristal büyümesi için bu aralık birkaç dakika ila birkaç saat arasındadır.
   6. Üç gün sonra, kristal büyümesini yeniden başlatmak için sıcaklığı 291 K'ya düşürin. Sıcaklığı sabit tutun ve kristalin gelişmesine izin verin (Şekil 9, panel 2). Deneyin bu aşaması için, her 2 saatte bir görüntü kaydetmek ve kristallerin boyutunda herhangi bir değişiklik olup olmadığını kontrol etmek her 10 ila 12 saatte bir yeterli olacaktır. Kristallerin boyutunda bir değişiklik gözlenmezse deneye devam edilebilir.
      NOT: Kristalleşme çözeltislerindeki protein ve çökelti konsantrasyonlarına ve kullanılan protein hacimlerine bağlı olarak, her adım için dengeye ulaşmak için gereken süre değişebilir.
   7. Kristal büyümesini yeniden başlatmak için sıcaklığı 288 K'ye düşürin. Burada sunulan olguların deneysel durumunda dengeye ulaşmak için bir gün yeterlidir(Şekil 9, panel 3).
   8. Kristallerin boyutunu kontrol edin ve kristal büyümeye devam ettiği sürece sabit bir sıcaklık koruyun.
   9. 4 gün sonra, kristal büyümesini yeniden başlatmak için sıcaklığı 275 K'ye düşürin(Şekil 9, panel 4).
      – Sunulan vakanın deneysel koşullarında, yaklaşık 10 gün sonra bir boyutta 500 μm olan bir kristal elde edilecektir (Şekil 9).
4. Kristal boyutunu kontrol etme
   1. 2.3.1 ve 2.3.2 bölümlerinde açıklandığı gibi bir protein çözeltisi ve sıcaklık kontrollü akan rezervuar diyalizi hazırlayın.
   2. 0,9 M NaCl ve 0,1 M CH 3 COONa pH₄ile kristalizasyon çözümleri hazırlayın.
   3. Sıcaklığı 291 K olarak ayarlayın ve kristallerin büyümesine izin verin. İlk koşullar altında, ilk çekirdeklenme olayı yaklaşık bir saat sonra başlayacak ve diyaliz odasında üç saat boyunca çok sayıda kristal büyüyecektir(Şekil 10, adımlar: 1 ve 2). Büyüme sürecinde kristallerin boyutunu kontrol etmek için her 20 dakikada bir görüntü kaydedin.
      NOT: Kristalizasyon koşullarının optimizasyonu, üretilen kristallerin nihai özelliklerinin çoğunu kontrol etmede çok önemlidir. Kristalizasyon çözeltilerinin sıcaklığı ve kimyasal bileşimi, tek tip boyuttaki kristalleri eritmek ve yeniden büyütmek için değiştirilebilir. Ayrıca, böyle bir deneyde bir protein örneğinin tüketilmediği de belirtilmelidir, çünkü denatüre olmadığı sürece numuneyi yeniden çözmek için koşullar tersine çevrilebilir. Sıcaklığı değiştirerek ve sabit kimyasal bileşimi koruyarak kristalleri çözerken, deneye aşağıdaki gibi devam edin:
   4. Kristaller 291 K'da büyüdükten sonra, bunlar daha az, daha büyük kristalleri yeniden büyütmek için çözülebilir. Sıcaklığı kademeli olarak 20 dakikanın üzerine çıkararak 313 K'ye ulaştırın. Diyaliz odasındaki tüm kristallerin çözülmesi yaklaşık bir saat sürer(Şekil 10, adımlar: 3-5). Çözülme sürecini izlemek için her 5 ila 15 dakikada bir görüntü kaydedin.
      NOT: Birçok protein yüksek sıcaklıklara karşı hassastır. Herhangi bir hasar / denatürasyonu önlemek için proteinin stabil olduğu sıcaklık aralığında çalıştığınızdan emin olun. Protein çözünürlüğe ek olarak, sıcaklık tampon çözeltisini de etkiler. Örneğin, arabelleğin pH'ı, özellikle Tris arabelleği içinde sıcaklıkla değişebilir. Böyle bir durumda, pH'ı deneyin gerçekleştirildiği sıcaklığa göre ayarlamak çok önemlidir¹⁸. Protein çözünmesinin protein kristal büyümesine kıyasla (birkaç saatten birkaç güne) önemli ölçüde daha az zaman aldığı da belirtilmelidir. Genel olarak, kristallerin çözünmesi sırasında, sıcaklık yavaş yavaş ve yavaşça artar (kısa toplam çözülme süresine saygı göstererek), esas olarak kristal mozaiğin artmasını önlemek için kristallerin kısmi çözünmesi durumunda. Kristaller büyürken, sıcaklık hızla (bir dakikadan kısa bir sürede) ayarlanan sıcaklığa (uzun toplam büyüme süresine göre) düşebilir. Kristalizasyon odasının görüntüleri kaydederek düzenli olarak izlenmesi, proteinin zarar görmesini önlemek ve çalışılan her protein için kristallerin çözünmesi veya büyümesi için en uygun zamanı tanımlamaya yardımcı olmak için tavsiye edilir.
   5. Tüm kristaller çözündükten sonra, ikinci bir çekirdek olayı başlatmak için sıcaklığı 295 K olarak ayarlayın(Şekil 10, adımlar: 6,7). İkinci çekirdeklenme işlemini izlemek için her 5 dakikada bir görüntü kaydedin. Bu adımda, ilk çekirdek yaklaşık 18 dakika sonra ortaya çıkar.
      NOT: Bu sıcaklıkta, çözelti çekirdek bölgesinde, metastable bölgesinin yakınında olacaktır. Sonuç olarak, kristalizasyon odasında sadece birkaç çekirdek görünecektir.
   6. Daha büyük kristaller yetiştirmek için bölüm 2.3'te açıklanan optimizasyon iş akışını tekrarlayan denemeye devam edin. Şekil 10'da temsil edilen deneyin toplam süresi yalnızca birkaç gündür.
      NOT: Çekirdeklenme aşamasında kristaller farklı zamanlarda ortaya çıkarsa, kristalleşme odasında farklı boyutlarda kristaller elde edilir. Böyle bir durumda, sıcaklıktaki artış (doğrudan çözünürlüğe sahip proteinler durumunda) daha küçük kristallerin daha hızlı çözünmesine neden olacaktır. Kinetik olgunlaşma etkisine bağlı olarak, ekstra protein (çözülmeden elde edilir) daha sonra daha büyük kristallerin büyümesi için kullanılabilir.
      Kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini değiştirerek kristalleri sabit sıcaklıkta çözerken, deneye aşağıdaki gibi devam edin:
      Yeni koşullar altında eşit büyüklükteki kristal popülasyonunu yeniden büyütmek için deney sırasında kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini değiştirerek daha önce yetiştirilen kristalleri eritmek de mümkündür.
   7. Yukarıda açıklandığı gibi protein çözeltisini (2.3.1), sıcaklık kontrollü akan rezervuar diyaliz kurulumunu (2.1) ve kristalizasyon solüsyonunu (2.4.2) hazırlayın. Metastable bölgeden uzak çekirdeklenme bölgesinde ilk koşullar altında, kristalleşme odasında çok sayıda küçük kristal görünecek ve büyümeye başlayacaktır(Şekil 11, adımlar: 1,2).
   8. Üç saat sonra, kristalleşme odasında birçok orta büyüklükte kristal göründüğünde(Şekil 11, adım: 3), NaCl konsantrasyonunu (0,9 M) kademeli olarak sıfıra ulaşmak için azaltın. Bunun için sadece 0,1 M CH₃COONa pH 4'e sahip tampon çözeltisi içeren yeni bir kristalizasyon çözeltisi hazırlayın. Pompalama sistemini rezervuar odasındaki kristalizasyon çözeltisi ile değiştirmek için kullanın. Rezervuar odasına yeni bir çözelti hazırlanması ve enjeksiyonu için 2.2.10 ila 2.2.12 adımlarını izleyin. Bu yeni çözümle, çözeltiler değiştirildiğinde, rezervuar odasındaki nihai çözelti 0,1 M'den fazla CH₃COONa pH 4 ve NaCl içermeyene kadar odadaki NaCl konsantrasyonu azalır. Çözülme işlemini kaydetmek için her 10 dakikada bir görüntü yakalayın.
   9. Kristallerin tamamen çözülmesine izin verin(Şekil 11, adımlar: 4,5). Bu deney için çözülme süresi yaklaşık iki saattir. Daha önce de belirtildiği gibi, çözülme süresi kullanılan protein sistemine, kristalizasyon koşullarına ve diyaliz odası hacmine bağlıdır. Kristalizasyon odasının düzenli olarak gözlemlenmesi (mikroskop bölümüne bakın) ve deney sırasında görüntü ve notların kaydedilmesi esastır.
   10. Hazne içindeki tüm kristaller çözüldüğünde(Şekil 11, adım: 5), NaCl'i bir öncekinden daha düşük bir konsantrasyonda enjekte ederek yeni bir kristalizasyon çözeltisi hazırlamak için pompalama sistemini tekrar kullanın (0,1 M CH₃COONa pH 4'te 0,75 M NaCl).
   11. Yeni çözeltiyi rezervuar odasına enjekte edin(Şekil 11, adımlar: 6,7) ve bölüm 2.3'te açıklandığı gibi kristalizasyon büyüme optimizasyonu iş akışını tekrarlayın. Daha büyük kristallerden oluşan tekdüze bir popülasyon oluşturulacaktır. Şekil 11'de gösterilen sonuçlar birkaç gün sonra elde edilmiştir.

Sonuçlar

Bölüm 2.3 ve 2.4'te, cihazın kullanımını ve büyük kristalleri büyütmek için deneysel bir tasarımı gösteren optimize edilmiş kristal büyümesinin üç örneği sunulmuştur. Bu gösteri için, kristal büyüme deneyleri bu yöntemi kullanarak diğer birçok protein sistemiyle başarıyla gerçekleştirilmesine rağmen, lysozyme'ı bir model protein olarak kullandık (yukarıya bakın). Burada sunulan protokolü kullanarak ve ustalayarak diğer protein adayları için uyarlanabilir.

Bölüm 2.3'te, yerleşik rasyonel kristalleşme stratejilerinin nötron proteini kristalografisi için yeterli saçılma hacimlerine sahip kristallerin yetiştirilmesinde faydalı olabileceğini gösterdik. Burada, önerilen rasyonel optimizasyon stratejilerinin, aşağı akış yapısı belirleme yaklaşımları için gereken belirli bir boyutta tekdüze bir kristal popülasyonunun üretilmesine de izin verdiğini gösteriyoruz.

Bu iki deney, kristal çekirdeklenme ve büyümeyi kontrol etmede faz diyagramlarının önemini vurgulamak için tasarlanmıştır. Burada, kristalizasyon çözeltilerinin sıcaklığının ve kimyasal bileşiminin gerçek zamanlı olarak kristalizasyon sürecinin izlenmesi ile birlikte kontrol edilmesi, nitel faz diyagramını incelemek için kullanılır. Bu yöntem kullanılarak, çekirdeklenme ve kristal büyümesi rasyonel olarak geri döndürülebilir bir şekilde optimize edilebilir. Böyle bir seri yaklaşımın kullanılması, protein miktarını ve kristallerin boyutunu ve kalitesini kontrol etmek için gereken süreyi de azaltır.

Diyaliz yönteminde, bir protein çözeltisi kristalleşme çözeltisinden yarı geçirgen bir membran⁶ (Şekil 5)ile ayrılır. Bu diyaliz zarı, katkı maddeleri, tampon ve iyonlar gibi küçük moleküllerin zardan geçmesine izin verir, ancak proteinler^6,20gibi makromoleküllerden geçmez. Bu özellik, kristalizasyon çözeltisinin deney sırasında değiştirilmesini sağlar⁶. Çözümün değişimi manuel olarak, örneğin mikrodiyaliz düğmelerinde veya bu amaç için geliştirilen bir cihaz kullanılarak otomatik bir şekilde yapılabilir, OptiCrys⁸.

İlk deney setinde, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme kristalizasyonu için mikrodiyaliz düğmeleri kullanılmıştır. Mikrodiyaliz düğmeleri farklı tuz konsantrasyonlarına sahip kristalizasyon çözeltilerine daldırıldı. Bu basit kristalizasyon ızgarası deneyinde, sıcaklık sabit tutulurken tek değişken çökelti konsantrasyonudur (293 K). Şekil 4'tegösterildiği gibi, tuz konsantrasyonundaki hafif farklılıklar, gözlenen kristallerin boyutunda ve sayılarında bir değişikliğe neden olur ve kristalleşme faz diyagramının araştırılmasına izin verir. Şekil 4, panel 1'de, kristalizasyon çözeltisi 0.7 M NaCl içerir ve düğmelerde sınırlı sayıda daha büyük kristal ortaya çıkmıştır. Tuz konsantrasyonunu 0,7'den 1,2 M'ye yükselterek, aşırı doyma artar ve çekirdeklenme bölgesindeki çözelti metastable bölgeden uzaklaşır(Şekil 4, paneller 1 ila 6). Sonuç olarak, kristallerin sayısı artar ve boyutları azalır.

Sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyonunu sağlayan tam otomatik bir cihazla yapılan ilk deneyde, OptiCrys (Şekil 9), kristal büyüme deneyi büyük kristal büyümesi oluşturmak için özel olarak tasarlanmıştır. Deney, 0.75 M NaCl ve 0.1 M Na asetat tampon pH 4 içeren bir kristalizasyon çözeltisi ile 295 K başlangıç sıcaklığında başlatıldı. Bu deneysel koşullar altında kristalizasyon çözeltisi faz diyagramının metastable bölgesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesine ulaşmıştır (Şekil 9, ok 1). Sonuç olarak, deneyin ilk aşamasında sadece birkaç çekirdek üretildi. Seçilen kristalleri daha da büyütmek için (Şekil 9'dagösterilmiştir), kristal büyüme optimizasyonu iş akışı, kristal çözelti dengesine ulaşılır ulaşılmaz sıcaklık değiştirilerek metastable bölgeye doğru yönlendirilmiştir.

Kristal ve çözelti arasındaki dengeye her ulaşıldığı zaman, kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutmak için sıcaklık önce 291 K'ya, sonra 288 K'ye ve son olarak 275 K'ya düşürüldü. Bu deneyin sonucu, hem makromoleküler röntgen hem de nötron kristalografisi için uygun tek bir büyük kristaldir.

Çoğu protein için, kristalizasyon deneyleri sırasında protein konsantrasyonunu doğru bir şekilde ölçebilen (veya kristalizasyon işlemini gerçek zamanlı olarak gözlemleyebilen / tespit edebilen) deneysel cihazların eksikliği nedeniyle hassas nicel faz diyagramı (veya sadece nitel bir diyagram) henüz elde edilmiştir¹⁸. Sonuç olarak, deneyi, kristalleşmenin faz diyagramının en uygun alanında, metastable bölgenin yakınında başlayacak şekilde tasarlanması genellikle mümkün değildir.

Bu nedenle, büyük hacimli bir kristalin büyümesine adanmış deney yapılmadan önce bir kristalizasyon optimizasyonu çalışması yapılmalıdır. Bu çalışmada, bir yandan sıcaklık değişimleri (sabit kimyasal bileşimde) ve diğer yandan kimyasal bileşimdeki (sabit sıcaklıkta) varyasyonlar kullanılarak, metastable bölgeyi tanımlamak ve büyük bir kristal büyüme deneyine başlamak için en uygun koşulları tanımlamak gerekir.

Bu amaçla, OptiCrys ile yapılan sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyon deneylerinin çekirdeklenme, kristal büyümesi, çözülme ve yeniden büyüme için tersine çevrilebilirliğini göstermek için özel olarak hazırlanmış iki deney daha sunulmaktadır. Kristal büyüme optimizasyonu iş akışı, sıcaklık veya çökelti konsantrasyonu varyasyonu kullanılarak daha az, daha büyük lysozyme kristallerinden oluşan tekdüze bir popülasyonun yetiştirilmesi için kontrol edildi.

OptiCrys ile yapılan ikinci deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimi deney boyunca sabit tutuldu (0,1 M CH₃COONa pH 4'te 0,9 M NaCl) değişken sıcaklıkta. İlk sıcaklık 291 K olarak belirlendi. Bu deneyin sonuçları Şekil 10'da özetlenmiştir. Yüksek aşırı doyma nedeniyle, kristalleşme odasında çok sayıda küçük kristal ortaya çıktı(Şekil 10, paneller 1 ve 2). Doğrudan protein çözünürlüğü kavramına uygun olarak, sıcaklığı kademeli olarak 313 K'ye çıkararak, kristallerin tümü çözülmüştür(Şekil 10, paneller 3, 4 ve 5). Son olarak, sıcaklığın 295 K'ye düşürülmesiyle, metastable bölgenin yakınında ikinci çekirdeklenme başlatıldı ve daha az sayıda çekirdeğin kontrollü bir şekilde oluşmasına izin verildi. Daha fazla kristal büyümesi, daha büyük kristal popülasyonunun düzgün bir şekilde üretilmesine neden oldu(Şekil 10, panel 7).

Şekil 11'degösterildiği gibi, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşiminin 291 K sabit sıcaklıkta varyasyonu, aynı şekilde daha büyük kristallerin tekdüze bir popülasyonunu elde etmek için kullanılabilir. Önceki deneye benzer şekilde, ilk durum 0.1 M CH 3 COONa pH 4'te_0.9M NaCl idi. NaCl konsantrasyonu daha sonra kristalleri çözmek için kademeli olarak 0,9 M'den sıfıra düşürüldü(Şekil 11, paneller 4 ve 5). Bu noktada, NaCl tamamen 0.1 M CH 3 COONa pH₄tampon çözeltisi ile değiştirildi. Tuz konsantrasyonunun azaltılması, çözeltiyi faz diyagramının az doymamış bölgesinde tutar ve bu da kristallerin çözünmesine yol açar. Daha sonra, rezervuar odasına 0,1 M CH₃COONa pH 4'te 0,75 M NaCl'de daha düşük iyonik mukavemetli yeni bir kristalizasyon çözeltisi enjekte edildi. Bu çökağacı konsantrasyonda, ilk çekirdek 90 dakika sonra ortaya çıktı (Şekil 11, panel 6). Üretilen kristallerin sayısı daha düşüktü ve kristaller öncekinden daha büyük bir hacme(Şekil 11, panel 7) ulaşıyordu.

Şekil 1: Şematik faz diyagramı. Üç kristalizasyon tekniği için kinetik yörüngeler tuzlama rejiminde temsil edilir. Her yöntem, çekirdeklenme ve metastable bölgelere ulaşmak için faz diyagramında farklı bir kinetik yol ile görselleştirilerek çekirdeklenme ve kristalleşmeyi farklı bir şekilde elde eder. Çözünürlük eğrisi, az doyma ve aşırı doyma bölgelerini ayırır. Aşırı doyma üç bölgeye ayrılır: metastable, çekirdeklenme ve yağış. Çekirdeklenme bölgesinde, spontan çekirdeklenme gerçekleşirken metastable bölgede kristal büyümesi gerçekleşir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ⁸Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kristalizasyon tezgahının şematik gösterimi (OptiCrys). LED ışık kaynağı, sıcaklık kontrollü diyaliz akış hücresinin üstünde bulunur. Ters bir mikroskop ve dijital kamera kırmızı okla görüntünün sağ üst kısmında gösterilir. Kırmızı daire, soğutucu borunun yerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sıcaklık (A) ve çökelti konsantrasyonunun (B) bir fonksiyonu olarak şematik iki boyutlu protein kristalizasyon faz diyagramı. (A) Doğrudan çözünürlükte bir protein olması durumunda, sıcaklığın azaltılması kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutar. İstenilen hacme sahip kristaller elde edilene kadar kristal büyüme sürecini kontrol etmek için sıcaklık değişimi birkaç kez tekrarlanabilir. (B) Çökelti çözeltisinin konsantrasyonunu değiştirmek, kristalleşme çözeltisini kristalleşmeyi kristallerin yetiştirilmesi için metastable bölgede tutmak için de kullanılabilir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ⁸Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Diyaliz yöntemi kullanılarak elde edilen lysozyme kristalleri. Bu deney 0,1 M sodyum asetat tampon pH 4'te 293 K sabit sıcaklıkta gerçekleştirildi. NaCl konsantrasyonunu 0,7 M'den 1,2 M'ye çıkarmak çekirdeklenme oranını arttırır ve daha fazla sayıda kristalle sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Diyaliz yöntemi ile protein kristalleşme sürecine genel bakış. (A) Proteini diyaliz düğmesinin haznesine ekleyerek, (B) odanın üst kısmında bir kubbe şekli oluşturulur. (C) Diyaliz zarını yerinde sabitlemek için O halkasını diyaliz düğmesinin oluğuna aktarmak için bir aplikatör kullanılır. (D) Diyaliz düğmesi rezervuar çözeltisinde daldırma için hazırdır. (E) Kristalizasyon çözeltisi yarı geçirgen membrandan geçer ve kristaller odanın içinde oluşmaya başlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sıcaklık kontrollü akan diyaliz kurulumunun şematik görünümü. (A) Protein örneği diyaliz odasına eklenir. (B) Diyaliz zarı bir aplikatör kullanılarak bir O-halkası ile büyük bir kenara sabitlenir. (C) Fazlalık döndürülür ve diyaliz odasının üstüne sabitlenir. Beyaz oklar, vidaların yerle bir olan yere yerleştirildiği yeri gösterir. (D) Rezervuar haznesi saat yönünde (E) çevrilir ve fazlalık üzerine sabitlenir. (F) Rezervuar haznesi, pompalama sistemine konektörlü hava geçirmez bir kapakla kaplanır ve (G) akış hücresi pirinç desteğine yerleştirilir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ⁸Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Kristalizasyon çözeltisinin akışkan sistem (A) tarafından rezervuara hazırlanması ve enjeksiyonu. Tuz ve su içeren tüpler basınç/vakum kontrol ünitesine (B) ve döner vanaya (C) bağlanır. Basınç/vakum kontrolörü, basıncı kullanarak sıvıların borulardan döner vanaya sabit bir akışını oluşturur. Akış ölçerden (D) geçen her sıvı ve anahtar karıştırma tüpüne (F) enjekte edilir. Tüm sıvılar karıştırma tüpüne eklendikten sonra, bazı değişikliklerle anahtar, karıştırma tüpünden nihai çözeltiyi rezervuara (G) enjekte eder. Sıvı, artan sırada (1'den 6'ya) işaretlenmiş diyagramdaki oklar yönünde sistemden akar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Denetim yazılımının bakım görünümü. Bu görünüm sıcaklık, ışık, kristalizasyon çözümü ve yakınlaştırma gibi farklı parametreleri kontrol etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Sıcaklığın bir işlevi olarak faz diyagramı (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Sıcaklığın sistematik olarak 295 K'den 275 K'ya değiştirilmesiyle tek bir büyük lysozyme kristali elde edilir. Her adımda, çözünürlük eğrisi ulaştıktan sonra kristal büyümesi durdurulur. Çözeltiyi metastable bölgesinde tutarak sıcaklığı azaltmak kristal büyümesini yeniden başlatır. Görüntüler farklı büyütme seviyelerine sahiptir. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ^8,18Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Sıcaklık kontrolü kullanılarak sabit kimyasal bileşimde kristal büyümesinin optimizasyonu (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Nükleasyon işlemine 291 K'de, metastable bölgeden uzakta çekirdeklenme işlemine başlamak, çok sayıda kristal oluşumuna neden olur. Sıcaklığın 313 K'ye çıkarılması, diyaliz odasında görünür bir çekirdek görülmeyene kadar kristalleri çözer. Son olarak, sıcaklığın 295 K'ye düşmesi, çekirdeklenme işlemini ikinci kez yeniden başlatır ve sınırlı sayıda daha büyük kristallere yol haline eder. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ^8,18Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Çökelti konsantrasyonundaki varyasyonlar kullanılarak kristal büyümesinin sabit sıcaklıkta optimizasyonu (seçilen görüntüler artan sırada izlenecektir). Çökelti konsantrasyonunu 0,9 M'den 0 M'ye düşürür, ilk çekirdeklenme olayı sırasında elde edilen kristalleri çözrür. Kristalleşme işlemi, aynı çökelticinin enjeksiyonu ile yeniden başlatılır, ancak daha düşük iyonik mukavemetle, 0.75 M, bu da birkaç büyük kristal oluşumuna yol açar. Bu Şekil Junius ve ark.'dan uyarlanmıştır. ^8,18Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Farklı fiziksel, kimyasal ve biyolojik değişkenler protein çözünürlüğü etkileyerek protein kristalizasyonunu etkiler²¹. Bu değişkenler arasında, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklık ve kimyasal bileşimi, nötron kırınım çalışmaları için biyomacrooleküllerin büyük yüksek kaliteli kristallerini iyileştirmek ve büyütmek için diyaliz tekniği ile birlikte kullanılmaktadır. Faz diyagramları bilgisi kullanılarak kristalizasyon daha öngörülebilir hale getirilir. Farklı kristalleşme koşullarının seri bir yaklaşımla taranması da mümkün olsa da, sunulan rasyonel yaklaşımların kullanılmasının temel amacı kristal çekirdeklenme ve büyümenin kinetiğini ayırmak ve kontrol etmektir.

Tüm kristalizasyon çalışmalarına benzer şekilde, yüksek kaliteli saf ve homojen protein örnekleri ve tozsuz kristalizasyon çözümleri deneyin başarı oranını arttırır. Çözümlerin filtrasyonu ve santrifüjlenmesi, açıklanan protokollerde önemli adımlardır. Moleküler ağırlık (uygun diyaliz zarını seçmek için), izoelektrik nokta ve protein çözünürlüğü gibi çalışılan proteinlerin fizikokimyasal özelliklerini bilmek, optimal bir kristal büyüme deneyinin tasarımı için çok önemlidir. Ayrıca, numune kaybını önlemek ve başarı olasılığını artırmak için farklı sıcaklıklarda veya farklı kimyasallarla protein stabilitesi için dikkate alınmalıdır. OptiCrys'in sıcaklık aralığı (233.0–353.0 ± 0.1 K) göz önüne alındığında, çok çeşitli proteinler kullanılarak kristalize edilebilir. Ancak, termofilik kaynaklardan elde edilen proteinler gibi öncelikle termo-stabil olan proteinlerin, bu cihaz tarafından sunulan sıcaklık kontrollü büyük hacimli kristal büyüme deneylerinde en çok fayda sağlayacağını vurgulamak gerekir.

Düşük hacimli bir diyaliz odası (OptiCrys kullanırken) veya mikrodiyaliz düğmeleri kullanarak ve çeşitli sıcaklıkları ve kristalizasyon koşullarını (örneğin, çökelti konsantrasyonu veya pH ızgaraları) tararken, metastable bölgenin sınırının (çekirdeklenme ve metastable bölgeler arasındaki kinetik denge) yeri hakkında bilgi edinmek mümkündür. Bu, özellikle kristalizasyonda yeni protein adayları için başarılı bir kristal büyüme deneyi tasarlarken paha biçilemez. Bu bilgi olmadan deneyler, kristal çekirdeğini kolayca kontrol etmek için metastable bölgenin sınırından çok uzak, yüksek doymamışlık ile faz diyagramının bir alanından başlayabilir. Protein çökeltisinin çözünmesine çalışılsa da, örneğin doğrudan çözünürlük durumunda sıcaklığı artırarak, termositesi azaltılmış proteinler için, numuneyi daha uzun süre yüksek sıcaklıkta tutmak protein çökeltmesini geri döndürülemez hale getirebilir. Bu nedenle, en iyi strateji, çekirdeklenmenin kontrol edilebildiği ve protein yağışının önlenebileceği metasabiliyet sınırına yakın bulunan daha düşük aşırı doymalı bir başlangıç koşulu kullanmaktan oluşur. Bu doğrultuda kristalizasyon önscreeningi diyaliz odasında protein çökeltme şansını azaltır ve deneyin başarı oranını artırır.

Bir deney tasarladıktan sonra, diyaliz odaları (OptiCrys) veya mikrodiyaliz düğmeleri hazırlamak bir başka önemli adımdır. Diyaliz haznesinde/butonunda hava kabarcığı oluşumunun önlenmesi özellikle küçük hacimler kullanıldığında başarılı kristalleşme şansını artırır. Diyaliz odasında hava kabarcıklarının varlığı da kristalleşme sürecinin kinetiğini değiştirebilir ve deneyin tekrarlanabilirliğini azaltabilir (çünkü protein/ çözelti temas yüzeyi değiştirilmiştir). Sadece protein değil, kristalizasyon çözeltisi de deneyin başarısını etkileyebilir. Her deneyden sonra pompalama sistemi için yeni 50 mL tüpler kullanmak ve her deneyden sonra boru yıkamak, kontaminasyon olasılığını azaltır ve aparatta tuz kristallerinin oluşturulmasını önler.

OptiCrys mevcut olmadığında mikrodiyaliz düğmelerinin kullanımı bir alternatiftir. Yukarıda belirtilen kristalizasyonu optimize etme ve kristal büyümesini izleme stratejileri manuel olarak gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak bu, sıcaklık düzenlemesi açıklanan metodolojide kritik bir adım olduğunda sorunlu olabilen bir termoregülasyonlu inkübatörün dışında olmayı gerektirir. Bu, kristalizasyon çözeltilerinin kimyasal bileşimini değiştirmeyi veya kristal büyümesini görüntüleme ile izlemeyi kolaylaştırmaz, bu nedenle kristal büyüme süreci gerçek zamanlı olarak kontrol edilemez.

Faz diyagramının bilgisi, kristalizasyon tezgahı OptiCrys'i otomatik bir şekilde sistematik olarak büyük, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanmanın temelidir. Kristalizasyon sırasında sıcaklık, çökelti konsantrasyonu ve pH gibi fizikokimyasal parametrelerin kontrolü, protein çözeltisi dengesini faz diyagramında iyi tanımlanmış bir kinetik yörüngede hareket ettirir. Bu, kütle taşımacılığını ayarlamak ve kristalizasyon odasında kristallerin boyutunu ve kalitesini etkileyen kontrollü bir gradyan oluşturmak için bir diyaliz zarının kullanılmasıyla tamamlanır. Bu nedenle, hem termodinamik verileri hem de kinetik yörüngeleri kullanmak, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kristalleşme sürecini kontrol etmek için gereklidir. OptiCrys sayesinde, çok boyutlu bir alandaki sistematik faz diyagramları, öncekinden önemli ölçüde daha az malzeme kullanılarak seri bir yaklaşımla incelenebilir. Bu metodolojiyi göstermek için, burada bir model protein, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme ile bir vaka çalışması sunuyoruz. Burada sunulan protokolü kullanarak ve ustalayarak gerçek protein^sistemlerineuyarlayabilir 5^,14,17,18.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
200 ve mikro; l Diyaliz Düğmesi	Hampton Research	HR3-330	Diyaliz düğmesi
24 kuyulu plakalar	Jena Bioscience	CPL-132	Kristalizasyon plakası
2-Anahtar	FLUIGENT	2SW001	Anahtar
30 & mu; l Diyaliz Butonu	Hampton Research	HR3-324	Diyaliz butonu
50 mL Corning Santrifüj tüpleri	Sigma-Aldrich	CLS430828-500EA	Santrifüj tüpleri
Asetik asit	Sigma-Aldrich	S2889	Kimyasal
Tavuk Yumurtası Beyazı Lizozim	Sigma-Aldrich	L6876	Liyofilize protein tozu
Diyaliz Membran Diskleri 6-8 kDa MWCO	Spektrumu	132478	Diyaliz membranı
Diyaliz Membran Tüpü 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132650T	Diyaliz
membranı Mikrosantrifüj	Eppendorf	Minispin	Tezgah üstü santrifüj
Akış Ünitesi	FLUIGENT FLU-XL		Akış ölçer
Akış Panosu	FLUIGENT	FLB	Akış Panosu Mikroakışkan
Akış Kontrol Sistemi EZ	FLUIGENT	EZ-01000002	Basınç/vakum kontrolörü
MilliporeSigma 0.22 & mikro; m şırınga Filtreleri	Millipore	GSWP04700	0.22 & mu; m gözenek boyutu filtresi
M-Switch	FLUIGENT	MSW002	Döner valf
Opticrys	NatX-ray	PRT008	Kristalizasyon tezgahı
Silikonlu daire kapak slaytları	Hampton Research	HR3-231	Cam slaytlar
Sodyum Klorür > %99	Sigma-Aldrich	746398
Kimyasal Santral	FLUIGENT	SWB002	Santral
Termoregüle inkübatör	Memmert	IPP30	Termoregüle inkübatör