Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Özet

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Özet

Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM), gen fonksiyonlarının değerlendirilmesinde, insan hastalıklarının modelinde ve terapötik yolları değerlendirmek için preklinik model olarak hizmet vermede etkili olmuştur. Bununla birlikte, zaman, emek ve maliyet yoğun doğaları, gen fonksiyonunun sistematik analizi için yararlarını sınırlar. Genom düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmekte ve belirli bir gen pertürbasyonunun doğrudan belirli fare organları içinde çok katlı ve hızlı bir şekilde hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Burada, cildin epitelinde ve farelerin ağız boşluğunda binlerce gen nakavt klonu oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı bir yöntemi (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) tanımlıyoruz ve tümör baskılayıcı genler için doğrudan in vivo CRISPR ekranı gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklayan bir protokol   sunuyoruz. Bu yaklaşım, doku homeostazı sırasında veya çeşitli hastalık ortamlarında genlerin biyolojik işlevini incelemek için diğer organlara veya CRISPR aktivasyonu veya CRISPR-inaktivasyonu gibi diğer CRISPR /Cas9 teknolojilerine uygulanabilir.

Giriş

Post-genomik çağda kanser araştırmaları için zorluklardan biri, nedensel gen mutasyonları için çok miktarda genom verisi çıkarmak ve gen ağında terapötik olarak hedeflenebilen düğümleri tanımlamaktır. Biyoinformatik analizler bu hedeflere son derece yardımcı olsa da, verimli in vitro ve in vivo modeller oluşturmak, biyolojik sistemlerin ve hastalık durumlarının karmaşıklığını çözmek ve ilaç gelişimini sağlamak için bir ön koşuldur. Konvansiyonel transgenik fare modelleri in vivo kanser genetiği çalışmaları için yoğun olarak kullanılmış olsa da, maliyet, zaman ve emek yoğun doğası, modern genomik tarafından çözülen yüzlerce putatif kanser geninin sistematik analizini büyük ölçüde yasaklamıştır. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, tek bir farenin derisinde ve ağız boşluğunda yüzlerce genin fonksiyon kaybı mutasyonlarını aynı anda teşvik etmek ve incelemek için daha önce kurulmuş bir ultrason güdümlü rahim enjeksiyon metodolojisi^1,2'yi CRISPR / Cas9 (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) gen düzenleme teknolojisi³ ile birleştirdik.

Burada açıklanan metodoloji, embriyonik gün E9.5'te canlı fare embriyolarının amniyotik boşluğuna tasarlanmış lentivirüslerin ultrason güdümlü enjeksiyonlarını kullanır. CRISPR/Cas9 bileşenlerini içeren lentiviral yük, daha sonra cildin ve ağız boşluğunun epiteline yol açan tek katmanlı yüzey ektodermini aktarır. Cilt bir dış epidermisin, ardından bodrum membran ve dermisin oluşur. Epidermis, bodrum zarı ile teması sürdüren, proliferatif ve kök hücre kapasitesine sahip, iç, bazal bir tabakadan oluşan tabakalı bir epiteldir. Bazal tabaka, dikenli, granül ve stratum korneum katmanları^2,4gibi yukarıdaki farklı katmanlara yol açar. Soy izleme çalışmaları, bu doğrudan in vivo CRISPR/Cas9 yönteminin, yetişkinlik boyunca devam eden bazal tabaka içindeki doku yerleşik kök hücreleri genetik olarak manipüle ettiğini göstermektedir. Lentivirüs, E9.5 yüzey ektodermini klonal yoğunlukta transdüze etmek için titratlanabildiğinden, bu yöntem binlerce ayrık gen nakavt klonunu barındıran mozaik fareler üretmek için kullanılabilir. Yeni nesil dizileme daha sonra crispr/cas9 aracılı gen ablasyonunun bu klonlar içindeki etkisini çok katlı bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir⁵.

Son zamanlarda bu yöntemi, insan Baş ve Boyun Skuamöz Hücreli Karsinom (HNSCC)^5'tetekrarlayan mutasyonlar gösteren 484 genin işlevini değerlendirmek için kullandık. HNSCC% 40-50 yüksek ölüm oranına sahip yıkıcı bir kanserdir ve dünya çapında en sık görülen^6. HNSCC, üst hava yolunun veya ağız boşluğunun mukozal astarlarında ortaya çıkar ve tütün ve alkol tüketimi veya insan papillomavirüs (HPV) enfeksiyonu ile ilişkilidir. Cutaneous Skuamöz Hücreli Karsinom (SCC) cilt tümörleridir ve insanlarda en sık görülen ikinci kanseri temsil eder⁷. Cutaneous SCC ve HNSCC histolojik ve moleküler olarak çok benzerdir, TP53, PIK3CA, NOTCH1 ve HRAS^8'dedeğişiklik sergileyen vakaların yüksek bir yüzdesi ile. Yüksek frekansta mutasyona uğramış sadece bir avuç gen olsa da, genellikle uzun kuyruk dağılımı olarak adlandırılan bir fenomen olan düşük frekansta mutasyona uğramış yüzlerce gen (< % 5) vardır. Uzun kuyruklu genlerin çoğunluğu biyolojik veya klinik doğrulamadan yoksun olduğu için, bu in vivo CRISPR tarama teknolojisini p53, Pik3ca veya Hras'ta hassaslaştırıcı mutasyonlarla tümöre eğilimli farelerde bu genlerin fonksiyon kaybını modellemek için kullandık ve tümör gelişimini tetiklemek için p53, Pik3ca veya Hras ile işbirliği yapan birkaç yeni tümör baskılayıcı gen tanımladık⁵.

Burada, çok katlı sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA kütüphaneleri oluşturmak ve fare yüzeyi ektoderminde CRISPR / Cas9 gen nakavt ekranları gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Not olarak, bu metodoloji CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) ve CRISPR inaktivasyonu (CRISPRi) gibi diğer gen manipülasyon teknolojilerini içerecek şekilde uyarlanabilir veya gen işlevlerini incelemek için faredeki diğer organ sistemlerini hedef alacak şekilde değiştirilebilir.

Protokol

Bu protokol Toronto Üniversitesi IACUC'a uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. Havuza sahip CRISPR kütüphanelerinin tasarımı ve klonlatimi

1. Broad Institute sgRNA tasarımcısı (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) veya CHOPCHOP sunucusu (https://chopchop.cbu.uib.no) gibi kaynaktan ilgi çekici fare genlerini hedefleyen 4-5 sgRNA'yı seçin. Eşit büyüklükte hedeflemesiz kontroller gRNA kitaplığı oluşturmak için Sanjana ve ark.⁹ gibi eşit sayıda hedefleme dışı sgRNA seçin.
2. SgRNA kütüphanelerini oluştururken, hedeflenen organ sistemindeki her sgRNA için yeterli kapsama alanı olduğundan emin olun. Fare derisi için, E9.5'teki epidermis, çoğu kök hücre kapasitesi⁴olan ~ 150.000 hücre içeren tek bir katmandır. Lenti-viral transdüksiyon -20 enfektivite ile sonuçlanırsa, E9.5'te sadece 18.000-24.000 hücre transdüklenecektir. Deneyi buna göre ölçeklendirin.
3. Bu sgRNA kütüphanelerinin klonlandırılması ve amplifikasyonu için, BsmBI enzim kısıtlama sitelerinin yanı sıra sgRNA'nın 5' ve 3' ucuna astar bağlama DNA dizilerini ekleyin ve elde edilen tam uzunlukta oligoları havuzlu oligonükleotid çipi olarak sipariş edin (Şekil 1A).
   1. Bir yongada farklı kitaplıkları çoklamak için kitaplığa özgü astar dizileri ekleyin.
   2. Uygun astar çiftlerini kullanarak, her kütüphaneyi havuza alınan oligo yongasından ayrı olarak güçlendirin. Bir PCR tüpünde, 25 μL 2x polimeraz ana karışımı, 20 μL DNase / RNase içermeyen su, 5 ng oligo çip DNA'sı, 2,5 μL uygun ileri astar ve 2,5 μL uygun ters astar karıştırın. PCR makinesindeki her döngü için 12-15 döngü kullanın ve 98 °C denatürasyon, 63-67 °C tavlama, 72 °C uzatma parametreleri ile güçlendirin.
   3. PCR ürününü % 2,5 agarose jel üzerinde çalıştırın ve jel DNA temizleme kiti kullanarak ~100 bp PCR ürününü saflaştırın.
4. Omurga plazmidini hazırlayın.
   1. Üreticinin talimatlarına göre 55 °C'de 1 saat boyunca 50 μL reaksiyon karışımında 2 μL BsmBI ile pLKO-Cre doldurucu v3 plazmid içeren Cre-recombinaz'ın 5 μg'sını ve ardından 37 °C'de 45 dakika boyunca 1 μL alkalin fosfataz inkübasyonunu sindirin.
      NOT: pLKO-Cre doldurucu v3 plazmid içeren Cre-recombinaz, fare hücrelerindeki Lox-Stop-Lox kasetini çıkarmak için Cre-rekombinaz enzimi içeren ve ayrıca sgRNA ve tracrRNA ifadesini yönlendiren bir U6 promotörüne sahip olan lenti-viral bazlı bir plazmiddir. Cas9 ve Cas9 içermeyen bir sürüm Addgene #158030 ve #158031'da kullanılabilir.
   2. Sindirilen DNA'yı %1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve jel DNA temizleme kiti kullanarak 7 kb doğrusallaştırılmış vektör bandını arındırın. Not olarak, başarılı bir özet gösteren 2 kb'lık bir doldurma bandı da görünmelidir.
5. Bir sgRNA plazmid kütüphanesi oluşturmak için ligasyon reaksiyonunu ayarlayın.
   1. 1 μg saflaştırılmış vektör ve 30 ng saflaştırılmış PCR kesici ucu 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA ligaz, 10 μM ATP ve BsmBI'ye özgü 1x tampon ile karıştırın. Ligasyon karışımını gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Negatif kontrol olarak PCR kesici uç hariç yukarıdaki tüm malzemeleri içeren ek bir tüp kullanın.
   2. Ertesi gün sabahı, oligo temizleme kitini kullanarak ligasyon karışımını arındırın ve 7 μL RNase / DNase içermeyen suda elute edin.
6. Kütüphaneyi yetkin hücrelere elektroporatlayın.
   1. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cuvettes (1,0 mm) içinde 25 μL çözülmüş elektro-rekabet hücrelerine 2 μL eluted sgRNA kütüphanesi veya negatif kontrol ligasyon karışımı ekleyin. Üreticinin protokolüne uygun elektroporat (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volt). Cuvette 10 sn içinde 975 μL geri kazanım ortamı (veya SOC ortamı) ekleyin.
   2. Elektroporlu hücreleri bir kültür tüpüne aktarın ve 300 rpm'de bakteri sallayan bir inkübatörde 37 °C'de bir saat kuluçkaya yatırın.
7. SgRNA başına dönüşüm verimliliğini ve kütüphane kapsamını tahmin edin.
   1. SgRNA kütüphanesi veya negatif kontrol ligasyonu ile elektroporlanmış hücreleri içeren dönüşüm reaksiyonunun 10 μL'lik kısmını 990 μL Geri Kazanım Ortamına aktararak 100 kat seyreltme hazırlayın ve iyice karıştırın.
   2. Seyreltilmiş dönüşümün plakası 10 μL önceden ısıtılmış 10 cm LB + ampisilin (100 μg/L) agar plakası üzerine. Bu, transformantların 10.000 kat seyreltilmesine neden olur ve dönüşüm verimliliğini hesaplamak için bu plakayı kullanır. Plakaların 14-16 saat boyunca 30 °C'de inkübasyonunu gerçekleştirin.
8. Toplam 10 önceden ısıtılmış 15 cm LB + ampisilin agar plakasının her plakasına 100 μL geri kazanılan hücre yayarak dönüşüm reaksiyonunun geri kalanını plakalayın. Plakaları 30 °C'de 14-16 saat kuluçkaya yatırın. Not olarak, 30 °C'deki büyüme, viral plazmid içindeki iki uzun terminal tekrarı arasındaki rekombinasyonu en aza indirir.
9. Klonlama başarısını değerlendirmek için dönüşüm verimliliğini hesaplayın. SgRNA kütüphanesinden veya negatif kontrol ligasyonundan dönüştürücüler içeren seyreltme plakasındaki kolonilerin sayısını sayın (10 cm plakalar, adım 1.8.2). Negatif kontrol karışımı herhangi bir veya sadece çok az koloniye sahip olmamalıdır. Toplam koloni sayısını elde etmek için koloni sayısını 10.000 ile çarpın.
   NOT: Sayılan toplam koloni sayısı, sgRNA başına en az 200x koloni olması gereken bir kütüphane kapsamını temsil eder.
   1. 2000 sgRNA'lı bir kütüphanenin en az 400.000 koloniye sahip olmasını sağlayın. Yeterli koloni olmaması durumunda, tekrarlayın ve daha fazla elektroporasyon kurun.
10. Kalite kontrolü: Seyreltme plakasından 20 koloni seçin ve her koloniyi 3 mL LB ortam + ampisilin içeren ayrı bir kültür tüpüne ekleyin. 20 tüpün hepsini 30 °C'de bir gecede 250 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Üreticinin talimatlarına göre mini hazırlık kiti kullanarak plazmid DNA'sını saflaştırın ve Sanger, her numunenin U6 astarını (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3') kullanarak farklı bir sgRNA dizisine sahip olduğunu doğrulamak için tüm 20 plazmid DNA örneğini sıralayın.
11. Kolonileri her 15 cm plakadan hasat edin.
    1. 7 mL LB orta ekleyin, ardından kolonileri lb Agar plakasından bir hücre serpici ile kazıyın. Hücreleri 2 L steril konik şişeye aktarmak için 10 mL pipet kullanın. 2 L şişedeki tüm plakalar ve havuz bakterileri için tekrarlayın. Matarayı 30 °C'de 2-3 saat sallanarak kuluçkaya yatırın. Kültürü santrifüjle ve peletin toplayın.
    2. Plazmid DNA'larını maksi-plazmid saflaştırma kiti kullanarak arındır.
12. Ek kalite kontrolü: 1 ng maxi-prep sgRNA kütüphanesi plazmid DNA kullanın ve üreticinin talimatlarına göre Yeni Nesil dizileme astarları kullanarak bir PCR reaksiyon çalıştırın. Kütüphanedeki tüm sgRNA'ların temsili derin sıralama platformu ile doğrulanabilir.

2. In vivo transdüksiyon için uygun yüksek titer lentivirüs üretimi

NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımları Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabininde bir BSL2+ tesisinde gerçekleştirin. 293FT ve özellikle 293NT ambalaj hücreleri daha yüksek virüs üretimine izin verir. Transfeksiyonlar için düşük pasajlı (

1. Viral ambalaj hücreleri hazırlayın.
   1. 1. Günde, 6 poli-L-lizin üzerindeki plaka HEK293T hücreleri büyüme ortamlarında % 35 izdiahta 15 cm plaka kapladı (DMEM + % 10 FBS +% 1 Penisilin-Streptomisin antibiyotik çözeltisi (w / v)). Hücreleri gece boyunca 37 °C, %5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
   2. Kaplamalı hücreler % 70-80 birleştiğinde ve eşit olarak yayıldıktan sonra, büyüme ortamını 25 mL serum ve antibiyotik içermeyen DMEM ortamı ile değiştirin.
   3. HEK293T ve 293NT hücreleri doku kültürü plastiğinden kolayca ayrılabildiğinden, beslenirken şişelerin kenarlarına yavaşça ortam ekleyin
2. Transfeksiyon karışımını hazırlayın.
   1. 6 mL'ye psPAX2 lentiviral ambalaj plazmidleri, 43 μg VSV-G ekspresyaklı zarf plazmid pMD2.G, 65 μg sgRNA kütüphanesi plazmid ve 6 mL'ye 240 μL 1 mg/mL polietilenimin (PEI) ekleyin.
      NOT: Bu adımdaki pH kritik olduğundan ve DMEM açıldıktan sonra zaman içinde daha temel hale geldiğinden, transeksiyon için her zaman açılmamış veya çok yakın zamanda açılmış bir DMEM şişesi kullanın.
   2. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır. Bu transfeksiyon karışımı, 870 cm² yüzey alanına sahip 6 x 15 cm plakalar üzerine kaplanan hücreler için yeterlidir. Transfeksiyon karışımını deneyin gereksinimlerine göre ölçeklendirin.
3. Viral ambalaj hücrelerinin transfeksiyon.
   1. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 15 cm plakanın her birini, transfeksiyon karışımının 1 mL'lik kısmını plaka boyunca damla yönünde ekleyerek transfectectect. 37 °C'de kuluçkaya yatır, 8 saat boyunca_{%5 CO 2.}
   2. İnkübasyondan sonra, transfection karışımını içeren serumsuz ortamı çıkarın ve 15 cm plakalara ve kültüre 37 °C'de 48 saat, % 5 CO₂için 30 mL düzenli kültür ortamı ekleyin.
4. 48 saat sonra, viral süpernatantı toplayın ve 0,45 μm PVDF filtreden filtreleyin. 1 mL viral süpernatant tutun ve kalite kontrolü ve viral titering için -80 °C'de saklayın.
5. SW28 rotor başlığı kullanarak yüksek hızlı santrifüjde sakkaroz gradyan santrifüjleme ile viral süpernatantı konsantre edin.
   1. Prime ultracentrifuge tüpleri % 70 etanol ile yıkayarak, ardından PBS ile 3 durulama. Viral süpernatantın yaklaşık 30 mL'lik kısmını 6-ultracentrifuge tüpünün her birine eşit olarak dağıtın.
   2. Her tüpün dibine hafifçe pipet% 20 sakkaroz çözeltisinin 4 mL'si (100 mL PBS'de 20 g sakkaroz). Altı ultrasantrifüj tüpünü altı SW28 salıncak kovasına yerleştirin ve viral süpernatant ekleyerek veya çıkararak her bir karşıt kova çiftini hassas bir şekilde dengeleyin.
   3. Santrifüj viral süpernatant 4 °C'de en az 2 saat ve 4 saate kadar 80.000 x g ve 4 °C. Santrifüjleme yapıldıktan sonra, süpernatantı dikkatlice atın.
   4. Ultracentrifuge tüplerini steril yumuşak kağıt havluya en az 2 dakika baş aşağı yerleştirerek kalan süpernatantı boşaltın ve herhangi bir artık ortamdan kurtulmak için yumuşak bir kağıt havlu kullanarak tüpün içindeki herhangi bir süpernatant damlacığını silin. Tüpün dibinde küçük grimsi beyaz bir pelet görülebilir.
   5. Her tüpe 20-25 μL soğuk, taze PBS ekleyin. Parafin filmi ile tüpleri kapatın ve tüpleri buz üzerinde dik olarak kapatın ve yörüngesel platform çalkalayıcıda ~2 saat boyunca hafifçe sallayın.
   6. 20 μL pipet kullanarak, kabarcıklar oluşturmamaya dikkat ederek ilk tüpün peletini dikkatlice yerinden sökün ve yeniden indirin. Ortamı bir sonraki tüpe aktarın ve tüm virüs topakları yerinden çıkana ve yaklaşık 120-150 μL hacimde tek bir tüpte birleştirilene kadar işlemi tekrarlayın. Bu yüksek titrek viral süspansiyonu hafifçe sallayarak buz üzerinde başka bir ~2 saat kuluçkaya yatırın.
   7. Viral süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 4 °C'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'da soğutulmuş ve önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde döndürün. Aliquot açık viral süpernatant dikkatlice ayrı 0.2 mL tüplerde 10 μL aliquots olarak ve -80 ° C'de saklayın. Embriyonik enjeksiyonlar sırasında iğneyi tıkayacağından, peleni tüpün altındaki atın.
6. Havuzlu CRISPR lentivirus kütüphanesinin titrasyonu
   NOT: Elde edilen viral süspansiyon yaklaşık 2.000 kat konsantrasyon ve ortaya çıkan virüs çözeltisi vermeli ve viral titreye sahip olmalıdır^{10 7-10 9}Aşağıda açıklanan 100'den fazla E9.5 ameliyatı için yeterince iyidir.
   1. Tohum R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) veya R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato birincil keratinositleri veya başka bir Cre-reporter hücre hattını 2 x 6 kuyu plakasına koyun.
   2. Hücre ~@ izdiah ederliğe ulaştığında, hücreler transdüksiyona hazırdır. O zaman, viral titerin daha sonra hesaplanmasını sağlamak için bir kuyudaki hücre sayısını belirleyin. Cre-reporter hücrelerinin medyasını 10 μg/mL polibren (=hexadimethrine bromür) ile desteklenmiş büyüme ortamına değiştirin.
   3. 1 μL konsantre virüsü 2 mL büyüme ortamı ile seyreltin. 0, 10, 50, 200 μL seyreltilmiş viral süspansiyon ve 2.4 adımından 50.200 μL konsantre olmayan virüs ekleyin ve plakaları karıştırın ve 37 °C, % 5 CO_2'degece boyunca kuluçkaya yatırın.
   4. Ertesi gün virüs içeren büyüme medyasını çıkarın, PBS ile hücreleri yıkayın ve normal büyüme ortamıyla değiştirin. Bu noktadaki üstünlük hala viral atık olarak kabul edilir ve kurumsal BSL2 yönetmeliklerine uygun olarak bertaraf edilmelidir.
   5. Transdüksiyondan yaklaşık 36-48 saat sonra, Lox-STOP-Lox kasetinin Cre aracılı rekombinasyonunu ve tdTomato'nun FACS tarafından ekspresyonunu değerlendirin. Viral titreyi hesapla. Aşağıdaki formülü kullanarak koloni oluşturma birimlerini (cfu)/mL hesaplayın:
      
      NOT: Konsantre viral süspansiyon ile unconcentrated viral supernatant arasındaki karşılaştırma, (1) viral üretimin ve (2) viral konsantrasyonun başarısını tahmin etmeyi sağlayacaktır. Alternatif olarak, viral titer qRT-PCR yöntemi kullanılarak tahmin edilebilir¹⁰. Büyük ölçekli lentivirüs üretimi ve konsantrasyonu, kartuş konsantrasyonu ile iki adımlı bir konsantrasyon kullanılarak da gerçekleştirilebilir ve ardından daha önce açıklandığı gibi ultrasantrifüjleme².

3. Ultra sağlam kılavuzlu cerrahi ve enjeksiyon

NOT: Bu teknoloji⁴,^11'denuyarlanmıştır. Yüzey epitelinin transdüksiyonuna yönelik mikroenjeksiyon, yüzey ektoderminin tek bir tabakadan oluştuğu embriyonik gün E9.5'te ve E10'dan başlayarak periderm oluşumundan önce yapılmalıdır, bu da bu bazal tabakanın transdüksiyonuna engel olacaktır. Tercihen Cuma günü fareler kurun, böylece E9.5 embriyoları ile mümkün olan ilk gün ertesi Pazartesi günüdür. Optimum CRISPR/Cas9 verimliliği için Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP farelerini (Jackson Laboratory #024857) kullanın¹².

1. İstenilen ameliyat tarihinden 10 gün önce zamanlanmış gebelikler için uygun erkek ve dişi fareleri ayarlayın.
   1. Potansiyel olarak hamile fareleri tanımlamak için sonraki günlerde fareleri takın. Ultrason kullanarak planlanan ameliyattan bir gün önce (yani E8.5) gebeliği onaylayın.
2. Modifiye Petri kabını hazırlayın.
   1. Çift taraflı yapışkan bandı kullanarak, silikon zarı dairesel açıklığı kaplayan Petri kabının altına yapıştırın. Keskin makas kullanarak silikon zarda 2 x 10 mm oval bir açıklık kesin.
3. Mikroenjeksiyon sisteminin hazırlanması
   1. Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipette çekerek kalın duvarlı bir cam kılcal damardan enjeksiyon iğneleri hazırlayın: Basınç = 200; Isı = 769; Çekme = 0; Hız = 140; Saat = 100.
   2. İğne ucunu çapının ~30 μm olduğu seviyede kesmek için ince makas kullanmak. İğneyi, 20 dakika boyunca düzenli ıslatma ile ince dereceli aşındırıcı bir plaka üzerinde 20 ° 'ye kadar iğne bileyici kullanarak eğimlendirin.
   3. 26 G1/2 iğneli 10 mL şırınga kullanarak p etanol iterek mikroenjeksiyon iğnesini sterilize edin. 10 mL şırınga ve mineral yağ yüklü 26 G1/2 iğne kullanarak mikroenjeksiyon iğnesini doldurun. Mikroenjeksiyon iğnesinde kabarcık olmadığından emin olun.
   4. Mikroenjektör iğnesini üretici talimatlarına göre mikromanipülatöre monte edin.
4. İğneyi viral sgRNA kütüphanesi ile yükleyin.
   1. Düz bir yüzeye sabitlenmiş bir parafilme pipet 10 μL viral süspansiyon.
   2. Mikromanipülatör kullanarak mineral yağı dışarı atın. İğnede az miktarda yağ bulunması, lentivirüslerin pistona temas etmesini önleyecektir. Herhangi bir hava kabarcığı olmadan yavaş aspirasyon ile yaklaşık 4-5 μL viral süspansiyon yükleyin.
5. İzofluran indüksiyon odasını kullanarak hamile fareyi uyuşturmak. Oksijen regülatörü 1 L/dk ve izofluran buharlaştırıcı %2 olarak ayarlayın. Hayvanın uyuşturulup uyuşturulmamasını belirlemek için, izofluran indüksiyon odasında ~3-5 dakika sonra ayak parmağı kıstırma ile kontrol edin.
6. Uyuşturulmuş hayvan ventral tarafını ısıtılmış ameliyat aşamasına (40 °C) yerleştirin ve ameliyat tamamlanana kadar sürekli izofluran ve oksijen temini için burun konisi anestezi tüpü ile pençeleri yerinde tutmak için ameliyat bantları uygulayın.
7. E8.5'te yapılmadıysa E9.5 gebeliği onaylayın.
   1. Karın bölgesine az miktarda (~ 1/2 tsp) epilasyon kremi uygulayın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak 3 x 3 cm'lik bir alana yayın.
   2. 2-3 dakika sonra, kremayı gazlı bez veya doku ile hafifçe çıkarın ve PBS ve% 70 etanol kullanarak bölgeyi temizleyin.
   3. Ultrason probu ve jel kullanarak, embriyonik gün E9.5 için hamile fare kontrol edin. Not olarak, bu, gerçek ameliyat gününde zaman kazanmak için önceki gün E8.5'te de yapılabilir.
   4. Ultrason jelini çıkarın ve BPS kullanarak bölgeyi temizleyin ve ardından dezenfekte etmek için% 70 etanol.
8. Fare barajına 0,02 cc Buprenorfin analjezik deri altından enjekte edin.
9. Rahmi cerrahi olarak maruz bırakmak
   1. Steril dikgenler ve makas kullanarak, farenin derisine dikey ~2 cm'lik bir kesi yapın.
   2. Künt tokmalar kullanmak kesi etrafındaki cildi peritondan ayırır.
   3. Steril tonlar ve makas kullanarak peritonları kesin.
   4. Künt tokmaklar kullanarak, sol ve sağ rahim boynuzu yavaşça çekin ve embriyoları sayın.
   5. Rahim boynuzlarının çoğunu yeniden yerleştirin, ancak 3 embriyo içeren bir rahim boynuzu distal ucunun açıkta bırakın.
   6. Künt tokparlamalar kullanarak, modifiye Petri kabının silikon zarındaki açıklıktan 3 embriyo ile uterusu hafifçe itin ve çekin.
   7. Petri kabını modelleme kili küpleri kullanarak stabilize edin.
10. Silikon bir kalıp kullanarak Petri kabının içindeki üç embriyo ile uterusu stabilize edin. Silikon fişi keskin bir bıçak kullanarak embriyoların yan tarafında düzleştirin.
11. Petri kabını steril PBS ile doldurun. Petri kabının altındaki silikon zarı hamile barajın göbeğiyle yıkayın, böylece herhangi bir sızıntıyı önleyin.
12. Ultrason başlığını üst embriyonun üzerinde Petri kabına ~ 0,5 cm hareket ettirin ve amniyotik boşluğun ultrason görünümünde açıkça görülebilmesi için aşamayı ayarlayın.
13. Enjektör iğnesini modifiye Petri kabına dikkatlice hizalayın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu üst embriyonun ~ 5 mm'sine yerleştirin. Sonra iğneyi ileri geri değiştirin ve ucunun ultrason görüntüsünde en parlak göründüğü düzleme doğru hareket edin.
14. Mikromanipülatör kullanarak iğneyi rahim duvarından amniyotik boşluğa itin.
15. SgRNA kütüphanesi içeren lentivirüs enjekte edin.
    1. Enjektörü 62 nL'ye ve yavaş enjeksiyon hızına önceden programla. Mikroenjektör, belirli hacimleri yavaş veya hızlı bir hızda enjekte etmek için programlanabilir.
    2. Embriyo başına toplam 496 nL için Enjekte düğmesine 8 kez basın. Ses seviyesini gerekli ihtiyaçlara ve viral titreye göre ayarlayın. 1 x 10⁸ pfu/mL ve 496 nL enjeksiyon hacmi viral titre yaklaşık% 30 enfektiviteye neden olacaktır.
    3. Diğer iki embriyo için aynı prosedürü tekrarlayın.
    4. Ultrason başlığını kaldırın ve silikon fişi çıkarın.
    5. Steril bir pamuk takası kullanarak 3 embriyoyu yavaşça fare karnına itin.
    6. Sonraki 3 embriyoyu yavaşça çekin ve istenen sayıda embriyo enjekte edilene kadar enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın.
       NOT: Hamile barajların embriyolarını bu süreden sonra iptal etme olasılığı çok daha fazla olduğundan 30 dakika anesteziyi aşmayın. Deneyimli bir cerrah 30 dakikalık ameliyat içinde 12 embriyoya kadar enjekte edebilir.
16. Ultrason başlığını kaldırın, mikromanipülatörü iğneyle çıkarın, PBS'yi aspire edin ve petri kabını çıkarın. Steril mendiller kullanarak, karın boşluğunda biriken PBS'leri emin.
17. Emilebilir dikişler kullanarak periton kesisini kapatın. Karın derisindeki kesiği kapatmak için iki zımba kullanın.
    
19. 
    

1. 
   
2. 
   
4. 
   

Sonuçlar

Şekil 1A, birkaç özel CRISPR kütüphanesini tek bir 12k veya 92k oligo yongasında uygun maliyetli bir şekilde çoklandırmak için oligonükleotidlerin tasarımını göstermektedir. SgRNA'lar (mavi renk kodlu) seçildikten sonra, oligonükleotidler kısıtlama siteleri (turuncu renkli BsmBI) ve kütüphaneye özgü PCR astar çiftleri (yeşil renk kodlu) ile tasarlanmıştır. Tek bir oligo yongasında çoklama için astar çiftlerinin benzersiz kombinasyonu kullanılarak çeşitli kütüphaneler tasarlanabilir. PCR, bel...

Tartışma

CRISPR/Cas9 genom düzenleme, gen fonksiyonlarını ve hücresel süreçleri araştırmak için in vitro ve in vivo çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo çalışmaların çoğunda crispr/cas9 gen düzenlenmiş hücreler bir hayvan modeline (allograft veya ksinograft) aşılanmış kullanır. Bu, kanser genetiği ve hücresel fonksiyonları incelemek için güçlü bir araç olsa da, hala doğal doku mikroçevrasyonundan yoksundur ve yara ve / veya bağışıklık tepkileri ortaya çıkabilir.

Bu zorlukların üstesinde...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.45 mikron filtre	Sigma	S2HVU02RE
12k veya 92k oligo çip	Customarray Inc. (Genscript)
15 cm hücre kültürü plakaları	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Sistemleri Biyolojik Bilimler	LV900A-1
Alkalin fosfataz	NEB	M0290L
Amplisilin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Kromik bağırsak sütürü	Covidien
Derin dizileme (Next-Seq veya Hi-Seq)	Illumina
DNA temizleme kiti	Zymo Research	D4008
DNAesy Kan ve Doku DNA ekstraksiyon kiti	Qiagen	69506
Endura elektroyetkin hücreler	Lucigen	60242-1
Cam Kılcal	Damarlar Drummond	3-000-203-G/X
HEK293T hücreleri	ATCC	CRL-3216
Yüksek Hızlı Santrifüj	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Teknolojileri	800-011-LG
Mikropipet çektirme Sutter	Aleti	P97
Mineral yağ	Sigma	M5904
Mini hazırlık plazmid Kiti	Frogga Bio	PDH300
Fare oksijen anestezi sistemi	Görsel Sonics
Nanoject II mikromanipülatör	Drummond
NEBuffer 3.1 ( BsmBI için Tampon	NEB	R0580L
İğne kalemtıraş	Sutter Instrument	BV-10
Oligo temizleme kiti	Zymo araştırma	D4060
SAYFA saflaştırılmış illumina sıralama astarı	IDT DNA
PEI (polietilenimin)	Sigma	408727-100ML
Permoplast modelleme kili
Merkezi açıklıklı Petridish	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polimeraz 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Florometrik Kantifikasyon	Invitrogen	Q33327
Yarım Daire Biçimli Silikon tapa	Corning
Silikon membran	Görsel Sonics
T4 DNA ligaz	NEB	M0202L
Ultra-santrifüj tüpleri	Beckman Coulter	344058
Vevo2000 ultrason sistemi	Görsel Sonics