MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Özet

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

Özet

Yaşamın bakteriyel etki alanı arasında küçük düzenleyici RNA'lar (sRNA'lar) yaygın olsa da, birçoğunun işlevleri özellikle mRNA hedeflerini belirlemenin zorluğu nedeniyle kötü karakterize edilmeye devam etmektedir. Burada, ms2-benzeşim saflaştırma RNA Dizileme (MAPS) teknolojisi ile birleştiğinde, belirli bir sRNA in vivo tüm RNA ortaklarını ortaya çıkarmayı amaçlayan değiştirilmiş bir protokol açıkladık. Genel olarak, MS2 aptamer, ilgi çekici sRNA'nın 5' ekstremitesine kaynaşmıştır. Bu yapı daha sonra in vivo olarak ifade edilir ve MS2-sRNA'nın hücresel ortaklarıyla etkileşime girmesini sağlar. Bakteri hasadından sonra hücreler mekanik olarak yutmuş. Ham ekstrakt, daha önce maltoz bağlayıcı proteine kaynaşmış MS2 proteini ile kaplanmış amiloz bazlı bir kromatografi sütununa yüklenir. Bu, MS2-sRNA'nın ve etkileşimli RNA'ların özel olarak yakalanmasını sağlar. Efüzyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA'lar yüksek verimli RNA dizilimi ve daha sonra biyoinformatik analiz ile tanımlanır. Aşağıdaki protokol Gram-pozitif insan patojeni Staphylococcus aureus'ta uygulanmıştır ve prensip olarak herhangi bir Gram-pozitif bakteriye transpoze edilebilir. Özetlemek gerekirse, MAPS teknolojisi, belirli bir sRNA'nın düzenleyici ağını derinlemesine keşfetmek için etkili bir yöntem oluşturur ve tüm targetome'unun bir anlık görüntüsünü sunar. Bununla birlikte, MAPS tarafından tanımlanan putatif hedeflerin hala tamamlayıcı deneysel yaklaşımlarla doğrulanmış olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.

Giriş

Çoğu bakteri genomunda yüzlerce, belki de binlerce küçük düzenleyici RNA (sRNA) tanımlanmıştır, ancak bunların büyük çoğunluğunun işlevleri tanımlanmamıştır. Genel olarak, sRNA'lar kısa kodlama dışı moleküllerdir, bakteriyel fizyolojide önemli roller oynarlar ve dalgalanan ortamlara adaptasyon^1,2,3. Gerçekten de, bu makromoleküller metabolik yolları, stres yanıtlarını ve aynı zamanda virülans ve antibiyotik direncini etkileyen çok sayıda karmaşık düzenleyici ağın merkezinde yer almaktadır. Mantıksal olarak, sentezleri belirli ortam uyaranları (örneğin, besin açlığı, oksidatif veya membran gerilmeleri) tarafından tetiklenir. Çoğu sRNA, kısa ve bitişik olmayan baz eşleştirme yoluyla transkripsiyon sonrası düzeyde birden fazla hedef mRNA düzenler. Genellikle çeviri başlatma bölgeleri için ribozomlarla rekabet ederek çeviri başlatmayı önlerler⁴. sRNA:mRNA dublekslerinin oluşumu da genellikle belirli RNa'ların işe alınmasıyla hedef mRNA'nın aktif olarak bozulmasına neden olur.

Bir sRNA targetome'nin karakterizasyonu (yani, hedef RNA'larının tüm kümesi), müdahale ettiği metabolik yolların ve cevap verdiği potansiyel sinyalin tanımlanmasını sağlar. Sonuç olarak, belirli bir sRNA'nın işlevleri genellikle targetomundan çıkarılabilir. Bu amaçla, IntaRNA ve CopraRNA⁵,^6,7gibi siliko tahmin araçlarında birkaç tane geliştirilmiştir. Özellikle putatif sRNA ortaklarını belirlemek için sıra tamamlayıcılığına, eşleştirme enerjisine ve potansiyel etkileşim sitesinin erişilebilirliğine güvenirler. Bununla birlikte, tahmin algoritmaları, RNA refakatçileri^8'in alt optimal etkileşimleri veya her iki ortağın birlikte ifadesini tercih etme gibi temel eşleştirmeyi etkileyen tüm faktörleri entegre etmez. Doğal sınırlamaları nedeniyle, tahmin araçlarının yanlış pozitif oranı yüksek kalır. Çoğu deneysel büyük ölçekli yaklaşım, etiketli bir RNA bağlayıcı protein (RBP)^6,9ile etkileşime giren sRNA:mRNA çiftlerinin birlikte saflaştırılmasına dayanmaktadır. Örneğin, Ligation ve dizileme ile RNA Etkileşimi (RIL-seq) yöntemi, Escherichia coli^{10 , 11'deki}Hfq ve ProQ gibi RNA refakatçileriyle birlikte saflaştırılmış RNA dublekslerini^tanımladı. UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) adı verilen benzer bir teknoloji, E. coli12^,13'teki RNase E- ve Hfq ilişkili sRNA'lara uygulandı. Srna aracılı regülasyonda SRNA aracılı düzenlemede Hfq ve ProQ'nun iyi tanımlanmış rollerine rağmen 8^,14,15, sRNA tabanlı regülasyon S. aureus^{16 , 17,18}gibi çeşitli organizmalarda RNA refakatçisiz gibi görünmektedir. RNases ile ilişkili RNA dublekslerinin saflaştırılması Waters ve iş arkadaşları¹³tarafından gösterildiği gibi mümkün olsa bile, RNases hızlı bozulmalarını tetikledikçe bu zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, MS2 Benzeşim Saflaştırması RNA Dizilimi (MAPS) yaklaşımı¹⁹,²⁰ ile birleştiğinde^butür organizmalarda sağlam bir alternatif oluşturur.

Yukarıda belirtilen yöntemlerin aksine, MAPS tüm etkileşime giren RNA'ları yakalamak için yem olarak belirli bir sRNA kullanır ve bu nedenle bir RBP'nin katılımına dayanmaz. Tüm süreç Şekil 1'de tasvir edilir. Kısacası, sRNA 5' ile ms2 kat proteini tarafından özel olarak tanınan MS2 RNA aptamer ile etiketlenmiştir. Bu protein, amiloz reçinesi üzerinde hareketsiz hale getirmek için maltoz bağlayıcı protein (MBP) ile kaynaştırılır. Bu nedenle, MS2-sRNA ve RNA ortakları benzeşim kromatografi sütununda tutulur. Maltoz ile elüsyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA'lar yüksek verimli RNA dizilimi ve ardından biyoinformatik analiz kullanılarak tanımlanır (Şekil 2). MAPS teknolojisi sonuçta in vivo meydana gelen tüm potansiyel etkileşimlerin etkileşimli bir haritasını çizer.

MAPS teknolojisi başlangıçta patojenik olmayan Gram-negatif bakteri E. coli^21'deuygulanmıştır. Dikkat çekici bir şekilde MAPS, hem RyhB hem de RybB sRNA'ları ile özellikle etkileşime giren ve teşvik edici olmayan koşullarda mRNA hedeflerini düzenlemek için herhangi bir sRNA transkripsiyonal gürültüyü önleyen tRNA türevi bir parçanın tanımlanmasına yardımcı oldu. Bundan sonra MAPS, DsrA 22 , RprA 23 , CyaR ²³ve GcvB²⁴( Tablo1)gibi diğer E. coli sRNA'larına başarıyla uygulanmıştır. DAHA ÖNCE BILINEN HEDEFLerİ ONAYLADI MAPS, bu iyi bilinen sRNA'ların targetome'larını genişletti. Son zamanlarda, MAPS Salmonella Typhimurium'da gerçekleştirildi ve SraL sRNA'nın rho mRNA'ya bağlandığını, transkripsiyon sonlandırma faktörü²⁵için kodlama yaptığını ortaya koydu. Bu eşleştirme sayesinde SraL, rho mRNA'yı Rho'nun kendisi tarafından tetiklenen erken transkripsiyon sonlandırmasından korur. İlginçtir ki, bu teknoloji sRNA'larla sınırlı değildir ve tRNA türevi bir parça 26 ve mRNA^22'nin 5'çevrilmemiş bir bölgesinin kullanılmasıyla örneklenen her türlü hücresel RNA'ya uygulanabilir (Tablo 1).

MAPS yöntemi patojenik Gram-pozitif bakteri S. aureus^19'ada uyarlanmıştır. Özellikle, liziz protokolü, Gram negatif bakterilerden daha kalın bir hücre duvarı nedeniyle hücreleri verimli bir şekilde kırmak ve RNA bütünlüğünü korumak için yaygın olarak değiştirilmiştir. Bu uyarlanmış protokol zaten RsaA²⁷, RsaI²⁸ ve RsaC^{29'un interactom'ını}çözdü. Bu yaklaşım, bu SRNA'ların hücre yüzeyi özelliklerinin düzenleyici mekanizmaları, glikoz alımı ve oksidatif stres yanıtlarındaki önemli rolü hakkında fikir verdi.

2015 yılında E. coli'de geliştirilen ve uygulanan protokol son zamanlarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır³⁰. Burada, patojenik olmayan veya patojenik (güvenlik önlemleri) olsun, Gram-pozitif (daha kalın hücre duvarı) bakterilerdeki sRNA düzenleyici ağları incelemek için özellikle uygun olan değiştirilmiş MAPS protokolünü sunuyoruz.

Protokol

1. Tamponlar ve ortamlar

1. MAPS denemeleri için aşağıdaki arabellekleri ve ortamları hazırlayın:
   - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ ve 1 mM DTT)
   - Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltoz, %0,1 Triton, 1 mM MgCl₂ ve 1 mM DTT)
   - RNA yükleme tamponu (8 M ürede %0,025 ksilen siyanol ve %0,025 bromofenol mavisi)
   - Beyin Kalbi İnfüzyonu (BHI) ortamı (12,5 g baldır beyni, 10 g pepton, 5 g sığır kalbi, 5 g NaCl, 2,5 g Na₂HPO₄ ve 1 L için 2 glikoz)
   - Lysogeny Et Suyu (LB) ortamı (10 g pepton, 5 g maya özü ve 1 L için 10 g NaCl)
2. Kuzey blot tahlilleri için aşağıdaki arabellekleri hazırlayın:
   - Blokaj çözeltisi (1x maleik asit ve% 1 bloke reaktif)
   - Hibridizasyon çözeltisi (P formamid, 5x SSC, %7 SDS, %1 bloke çözeltisi ve %0,2 N-lauryl sarkozin, 50 mM sodyum fosfat). Çözünecek ajitasyon ile ısıtın.
   DİkKAT: Her ürünle ilgili güvenlik önlemlerine dikkat edin.
   - 1 M sodyum fosfat (58 mM sodyum fosfat dibasik ve 42 mM sodyum fosfat monobasik)
   - Salin, sodyum sitrat (SSC) tampon, 20x konsantre (3 M NaCl ve 300 mM trisyot sitrat)

2. Güvenlik sorunları

1. Seviye 2 muhafaza laboratuvarında uygulanabilir patojenik bakterileri içeren tüm adımları uygulayın.
   NOT: Lizizden sonra dışarıya sadece hücre özleri alınabilir (adım 5).
2. Laboratuvar önlüğü ve eldiven giy.
3. Bileklerin kapalı olduğundan emin olun.
4. Biyolojik güvenlik kabinini (Sınıf II) bir dezenfektan çözeltisi ile temizleyin.
5. Bakterilere maruz kalan katı atıkları uygun biyomedikal depo gözüne atın.
6. Kontamine sıvı içeren şişeleri bir dezenfektan çözeltisi ile tedavi edin. Sonra, bir lavaboya atın.
7. Ellerinizi ve bileklerinizi sabunla dikkatlice yıkayın ve seviye 2 muhafaza laboratuvarından ayrılmadan önce laboratuvar önlüğü çıkarın.

3. Plazmid yapımı

NOT: Klonlama amacıyla, öncelikle endojen sRNA'nın sınırlarını belirlemek çok önemlidir. pCN51-P3 ve pCN51-P3-MS2 plazmidleri Tomasini ve ark. P3 promotörü, sRNA'nın hücre yoğunluğuna bağlı bir şekilde yüksek şekilde ifadesini sağlar (yani, bakteriler büyümenin sabit aşamasına girdiğinde). Bu büyüme aşamasında birçok stafilokok sRNA'sı birikir.

1. Yüksek kaliteli bir DNA polimeraz ve bir PCR makinesi kullanarak sRNA dizisini PCR ile güçlendirin. Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin ve daha fazla bilgi için Garibyan ve Avashia (2013)^31'i okuyun.
2. Belirli astarları tasarlamak için aşağıdaki şablonları kullanın:
   
   ve ileri ve ters astarlar için sırasıyla 5'-CGCGGATCC(N)-3'.
   NOT: Bu oligonükleotidler, MS2 sırasını (kalın olarak) ilgi çekici sRNA'nın 5' ucuna birleştirmeyi sağlar. Pst I ve BamHI kısıtlama siteleri (altı çizili) amfiloni pCN51-P3 plazmid^27'yeklonlamak için MS2-sRNA yapının 5' ve 3' ekstremitelerinde eklenir. (N) gene özgü diziye (15-20 nükleotit) karşılık gelir.
3. Üreticinin önerilerine göre uygun tamponda 2 U Pst I ve 1 U BamHI ile MS2-sRNA PCR ürününün 1 μg pCN51-P3 plazmidini ve 1 μg'sını sindirin.
4. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın ve PCR saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı arındırın (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Sindirilen pCN51-P3 plazmid (300 ng) ve MS2-sRNA amplicon'u (vektör için molar oran:insert = 1:3) 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın. Ligasyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için Revie ve ark. (1988)^32'ye bakın. Her tüpe 1 μL Ligase Tamponu ve 10 U T4 Ligase ekleyin. Ultra saf su ile hacmi 10 μL'ye ayarlayın.
6. En az 2 saat boyunca 22 °C'de kuluçkaya yatırın.
7. Donmuş DH5α kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine 50 μL ligasyon karışımı ekleyin. Plazmid dönüşümü ve kimyasal olarak yetkin hücreler hakkında daha fazla bilgi edinmek^için Seidman ve ark.
8. Buzda 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
9. Isı bloğu veya su banyosu kullanarak dönüşüm tüpünün ısı şoku (42 °C'de 45 sn).
10. 900 μL LB orta ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
11. Ampisilin (100 μg/μL) ile desteklenmiş bir LB agar plakasındaki bakteriyel süspansiyonun plakası 100 μL.
    NOT: pCN51-P3 vektörü, yalnızca pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini taşıyan E. coli klonlarını seçmeyi sağlayan bir ampisilin direnç genini kodlar.
12. Bir plazmid DNA miniprep kiti kullanarak ampisilin (100 μg/μL) varlığında yetişen bir gecede bakteri kültüründen (5 mL) pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
13. Sanger'ın^34'ü sıralayarak aşağıdaki astar olan 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3' ile yapıyı doğrulayın.
14. pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini DC10B kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. 3.7 ile 3.11 arasında olan adımları yineleyin.
15. pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini çıkarın (bkz. adım 3.12) ve 1-5 μg plazmid DNA'yı bir elektroporasyon aparatı kullanarak HG001 ΔsRNA elektro-uyumlu S. aureus hücrelerine dönüştürün. Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin. Grosser ve Richardson (2016)^35'i okuyarak elektro-rekabetçi S. aureushazırlama yöntemleri hakkında daha fazla bilgiedinin.
    DİkKAT: Bu adım patojenik bakterilerin işlenmesini içerir (bkz. adım 2).
16. 900 μL BHI orta ekleyin ve 3 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
17. Santrifüj 1 dakika 16.000 x g. Üstnatant atın.
18. Peletin 100 μL BHI'de yeniden süzülür ve eritromisin (10 μg/μL) ile desteklenmiş BHI agar plakalarındaki bakteri süspansiyonu plakalayın.
    NOT: pCN51-P3 vektörü ayrıca, yalnızca pCN51-P3-MS2-sRNA plazmidini taşıyan S. aureus klonlarını seçmeyi sağlayan bir eritromisinin direnç genini kodlar.

4. Bakteri hasadı

DİkKAT: Bu adım patojenik bakterilerin işlenmesini içerir (bkz. adım 2).

1. PCN51-P3-MS2-sRNA veya pCN51-P3-MS2²⁷ plazmidlerini taşıyan bir suş kolonisini, mükerrer olarak eritromisinin (10 μg/μL) takviyeli 3 mL BHI ortamında büyütün.
2. Her bir gece kültürünü 50 mL (≈1/100) taze BHI ortamında seyreltin ve 0,05'lik bir OD_600nm'ye ulaşmak için eritromisinin (10 μg/μL) takviyesini yaptırın. 250 mL sterilize şişe kullanın (5:1 şişe-orta oranı).
   NOT: Orta ve büyüme koşulları çalışılan sRNA'nın ifade modeline göre ayarlanmalıdır.
3. 37 °C'de kültürleri 6 saat boyunca 180 rpm'de sallayarak büyütün.
4. Her kültürü 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
5. 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.900 x g'da santrifüj. Üstnatant atın.
6. Peletleri buzda tutun ve doğrudan mekanik hücre lizisi (adım 5) yapın veya peletleri -80 °C'de dondurup saklayın.

5. Mekanik hücre lizisi

DİkKAT: Aşağıdaki adımlar buz üzerinde yapılmalı ve tamponlar 4 °C'de olmalıdır. Eldiven kullanın ve örnekleri RNases'ten korumak için tüm önlemleri alın.

1. 5 mL Tampon A'da peletleri (adım 4,6) yeniden dirsintir.
2. Yeniden depolanan hücreleri 3,5 g silika boncuk (0,1 mm) ile 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
3. Tüpleri mekanik hücre liziz cihazına yerleştirin(bkz. Malzeme Tablosu). 40 sn'lik bir döngüyü 4,0 m/s'de çalıştırın.
   NOT: Hücreleri kırmak için bir döngü yeterli değilse, numuneleri buzda tutarken cihazın 5 dakika soğumasını bekleyin. Ardından, 40 sn'lik bir döngüyü 4.0 m/ s'de tekrarlayın. Hücre lizizinin verimliliği, üst tabak BHI-agar plakasına kaplanarak test edilebilir.
4. 15 dakika boyunca 15.700 x g'da santrifüj. Üst saltantayı kurtarın ve buzda tutun.

6. Sütun hazırlama

DİkKAT: Amiloz reçinesinin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Gerekirse, sütunu bir uç kapakla kapatın. Benzeşim saflaştırmasına başlamadan önce tüm çözümleri hazırlayın.

1. Sütun rafı içine kromatografi sütunu koyun (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Sütun ucunu çıkarın ve kolonu ultra saf suyla yıkayın.
3. 300 μL amiloz reçinesi ekleyin.
4. Sütunu 10 mL Tampon A ile yıkayın.
5. 1.200 pmol MBP-MS2 proteinini 6 mL Tampon A'da seyreltin ve sütuna yükleyin.
6. Sütunu 10 mL Tampon A ile yıkayın.

7. MS2 benzeşim saflaştırması (Şekil 1)

1. Hücre lisatını sütuna yükleyin.
   NOT: Toplam RNA 'yı (adım 8) çıkarmak ve Kuzey lekesi (adım 9) ve transkriptomik (adım 10) analizini yapmak için hücre lisatının 1 mL'lik kısmını (Ham özü, CE) tutun.
2. Akış fraksiyonunu (FT) temiz bir toplama tüpünde toplayın.
3. Sütunu 10 mL Tampon A ile 3 kez yıkayın.
4. Sütunu 1 mL Tampon E ile yağlayın ve elution fraksiyonunu (E) 2 mL mikrotüpte toplayın.
5. Toplanan tüm fraksiyonları RNA ekstraksiyonu (adım 8) kadar buzda tutun veya daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de dondurun.

8. Toplanan fraksiyonların RNA ekstraksiyonu (CE, FT, W ve E)

1. RNA ekstraksiyonu için her kesirden 1 mL (FT ve W dahil) kullanın.
2. 1 hacim fenol ekleyin. Kuvvetlice karıştırın.
   DİkKAT: Fenol uçucu ve aşındırıcıdır, dikkat edin ve duman kaputunun altında güvenli bir şekilde çalışın.
3. 20 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj.
4. Üst fazı temiz bir 2 mL mikrotüple aktarın.
5. 1 hacim kloroform/izoamil alkol (24:1) ekleyin ve 8,3 ila 8,4 adımlarını tekrarlayın.
   DİkKAT: Duman kaputunun altında güvenle çalışın.
6. 2,5 hacim soğuk etanol% 100 ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (NaOAc) pH 5,2 ekleyin.
7. -20 °C'de gece çökelt.
   NOT: Yağış, etanol/kuru buz banyosunda 20 dakika veya -80 °C'de 2 saat boyunca da yapılabilir.
8. 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmemeye dikkat ederken bir pipetle etanol'u yavaşça çıkarın.
   DİkKAT: RNA peleti her zaman görünmez ve bazen etanol varlığında gevşektir.
9. 500 μL% 80 soğuk etanol ekleyin.
10. 4 °C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj.
11. Etanol yavaşça pipetleme ile atın. Peletin vakum konsantratör kullanarak kurulayın, çalışma modunda 5 dk.
12. Peletin uygun hacimde (15-50 μL) ultra saf suda yeniden sulansın. Peletin daha sonra kullanılmak üzere -20 °C'de dondurulması.
13. Spektrofotometre/florometre kullanarak RNA miktarını (260 nm) ve kaliteyi (260/280 ve 260/230 dalga boyu oranları) değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin.
    NOT: 3-4 μg genellikle elüsyon fraksiyonunda (E) elde edilir. Bu esas olarak test edilen koşullara bağlıdır.

9. Ms2 benzeşim saflaştırmasının Kuzey blot^{36 ile analizi}

1. 10 μL ultra saf suda 5 μg RNA CE, FT, W fraksiyonları ve 500 ng E fraksiyonunu seyreltin ve 10 μL RNA yükleme tamponu ile karıştırın.
2. 90 °C'de 3 dk kuluçkaya yaslanın.
3. Numuneleri 20 mM guanidiyum tiyosiyanat ile desteklenmiş% 1 agarose jel kuyusuna yükleyin ve jeli 4 °C'de TBE 1x tamponda 100-150 V'da çalıştırın. Daha fazla bilgi için Koontz (2013)^37'ye bakın.
4. RNA'ları bir nitroselüloz membran üzerinde vakum transferi ile 1 saat veya bir gecede kapillarite transferi için aktarın.
   NOT: Kapillarite yöntemi büyük RNA'lar için daha etkilidir.
5. Membrandaki UV çapraz bağlantı RNA'ları (254 nm'de 120 mJ) ultraviyole çapraz bağlantı kullanarak.
6. Membranı, RNA tarafı yukarı bakacak şekilde bir melezleme şişesi içine yerleştirin.
7. Önceden ısıtılmış 10-20 mL hibridizasyon çözümü ekleyin. 68 °C'de 30 dk kuluçkaya yatır.
8. Çözeltiyi atın ve sRNA'ya özgü probun 1 μL'si ile desteklenmiş 10-20 mL taze hibridizasyon çözeltisi ekleyin. 68 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
   NOT: DIG etiketli RNA probu, DIG RNA etiketleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergelerine uyularak sentezlenmiştir. Alternatif olarak, radyolabelled prob kullanılabilir.
9. Membranı 10-20 mL yıkama çözeltisi 1 (2x SSC ve% 0.1 SDS) ile 20 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
10. Membranı 68 °C'de 15 dakika boyunca 10-20 mL yıkama çözeltisi 2 (0,2x SSC ve% 0,1 SDS) ile yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
11. 20 °C'de en az 30 dakika boyunca 10-20 mL blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yaslanın.
12. Çözeltiyi atın ve alkali fosfataz için konjuge edilmiş poliklonal anti-digoksigenin antikoru (1/1000) ile desteklenmiş blokaj çözeltisinin 10-20 mL'lik kısmını ekleyin. 20 °C'de 30 dk kuluçkaya yaslanın.
13. Membranı 10-20 mL yıkama çözeltisi 3 (1x maleik asit ve% 0.3 Ara 20) ile 20 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
14. Membranı algılama çözeltisinin 10-20 mL'si (0,1 M Tris HCl ve 0,1 M NaCl pH 9,5) ile 20 °C'de 5 dk ile kuluçkaya yaslanın.
15. Membranı plastik bir filme koyun ve substratla ıslatın (bkz. Malzeme Tablosu). Karanlıkta 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
16. Zarı plastik bir filme kapatın. Zarı otoradyografi kasetine koy.
17. Membranı özel karanlık odada bir otoradyografi filmine maruz bırak.
    NOT: Sergi süresi, birkaç saniyeden dakikaya kadar sinyal gücüne bağlıdır.
18. Açığa çıkan filmi otomatik olarak gelişen bir cihazda ortaya çıkarmak.

10. Numunelerin RNA dizilimi için hazırlanması

NOT: Bu adım yalnızca E ve CE kesirlerinden çıkarılan RNA'larla ilgilidir.

1. Her numuneye 10 μL 10x DNase tamponu ve DNase I (1 U/μg işlenmiş RNA) ekleyin. 100 μL'lik son hacim için su ekleyin.
2. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
3. RNA'ları daha önce açıklandığı gibi ayıklayın ve arındıryın (adım 8.2 ila 8.11).
4. RNA peletini 20 μL ultra saf suda yeniden hissedi.
   NOT: Kalan DNA'nın varlığı PCR ve spesifik astarlar (örneğin, 16S geni) kullanılarak kontrol edilebilir.
5. Mikroakışkan bazlı elektroforez analiz sistemi kullanarak RNA miktarını ve kalitesini değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: 1 μg genellikle DNase tedavisinden sonra elüasyon fraksiyonunda (E) elde edilir.
6. Ribozomal RNA'ları bakteriyel bir rRNA tükenme kiti ile çıkarın.
   NOT: Büyük ve bol miktarda RNA (yani rRNA'lar) benzeşim sütunuyla özel olarak etkileşime girme eğilimindedir. Bu adımı gerçekleştirmek için 500 ng çıkarılmış RNA gereklidir.
7. Yine mikroakışkan bazlı elektroforez analiz sistemi kullanarak RNA miktarını ve kalitesini değerlendirin.
8. CDNA kütüphane hazırlık kiti kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek 10-20 ng ribodepleted RNA ile cDNA kütüphaneleri hazırlayın.
9. Elde edilen kitaplıkları bir sıralama aleti kullanarak sıralayın (örneğin, tek uçlu, 150 bp; bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Örnek başına 5-10 milyon okuma genellikle yeterlidir.

11. RNAseq veri analizi (Şekil 2)

1. FastQ sıralama dosyalarını sıralama platformundan indirin.
2. Roscoff biyolojik istasyonunun(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)Galaxy örneğine erişim ve giriş yapın.
   NOT: Bahsedilen her algoritma arama çubuğu kullanılarak kolayca bulunabilir. Her araç için bir kullanım kılavuzu sağlanır.
   DİkKAT: Gerekli araçların sürümü genel Galaxy server³⁸.
3. Veri Al simgesine tıklayın ve ardından Bilgisayarınızdan Dosya Yükle 'yetıklayın. Her MS2 denetiminin ve MS2-sRNA örneklerinin FastQ sıralama dosyasını karşıya yükleyin. Ayrıca FASTA referans genom dosyasını ve GFF ek açıklama dosyasını yükleyin.
4. FastQC Okuma Kalitesi raporlarını çalıştırın (Galaxy Sürüm 0.69).
   NOT: Bu araç ham dizilerin kalite değerlendirmesini sağlar (örneğin, kalite puanı, adaptör dizilerinin varlığı).
5. Adaptör dizilerini ve düşük kaliteli okumaları önemli ölçüde kaldırmak için Trimmomatic esnek okuma kırpma aracını (Galaxy Sürüm 0.36.6) çalıştırın. Kitaplık hazırlama için kullanılan bağdaştırıcı sıralarını belirtin (örneğin, TruSeq 3, tek uçlu). Aşağıdaki Trimmomatic işlemlerini ekleyin: SLIDINGWINDOW (Baz sayısı=4; Ortalama kalite=20) ve MINLEN (En az okuma uzunluğu=20).
6. FastQC Okuma Kalitesi raporlarını (Galaxy Sürüm 0.69) tekrar çalıştırın.
7. Bowtie2'yi çalıştırın - harita referans genoma karşı okur (Galaxy Sürüm 2.3.2.2). Varsayılan ayarlarla (çok hassas yerel) okumaları eşlemek için geçmişteki Genom Başvurusu FASTA dosyasını kullanın.
   NOT: Bowtie2 aracı tarafından oluşturulan BAM dosyası Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) kullanılarak görselleştirilebilir. İlişkili BAI dosyası da gerekli olacaktır.
8. İsteğe bağlı olarak, BAM veri kümesi (Galaxy Sürüm 2.0) için istatistikleri derleyen Flagstat'ı çalıştırın.
9. GFF ek açıklama dosyasındaki okuma çakışan özellikleri hizalayan htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) çalıştırın. Kesişim (boş olmayan) modunu kullanın.
10. Htseq-count çözümlemesinden tüm ham sayım dosyalarını tek bir Zip dosyasına arşivle.
11. Verileri karşılaştırmak için SARTools DESeq2'yi çalıştırın (Galaxy Sürüm 1.6.3.0). Ham sayım dosyalarını içeren Zip dosyasını ve denemeyi açıklayan sekmeyle ayrılmış bir dosya olan tasarım dosyasını sağlayın. Tasarım dosyasını oluşturmak için sağlanan yönergeleri dikkatle izleyin.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar, RsaC targetome'nin S. aureus29 'daki çalışmasından^{kaynaklanmaktadır.} RsaC alışılmadık bir 1.116 nt uzunluğunda sRNA'dır. 5' ucu birkaç yinelenen bölge içerirken, 3' ucu (544 nt) yapısal olarak bağımsızdır ve mRNA hedefleriyle tahmin edilen tüm etkileşim alanlarını içerir. Bu sRNA'nın ekspresyişi manganez (Mn) az olduğunda indüklenmiştir, bu da sıklıkla konak immün yanıtı bağlamında karşılaşılan bir durumdur. MAPS teknolojisini kullanarak, RsaC ile doğrudan etkileşime gir...

Tartışma

Gram-pozitif bakteriler için değiştirilmiş bir protokol
MAPS'in ilk protokolü, E. coli^{20 , 30}model organizmasında sRNA interactom'u incelemek için geliştirilmiştir. Burada, fırsatçı insan patojeni S. aureus'ta sRNA'ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu için uygun olan ve patojenik olsun olmasın diğer Gram-pozitif bakterilere kesinlikle aktarılabilir olan değiştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpü	Sarstedt	72.690.001
15 mL santrifüj tüpleri	Falcon	352070
2 mL mikrosantrifüj tüpü	Starstedt	72.691
2100 Biyoanalizör Cihazı	Agilent	G2939BA	RNA miktarı ve kalitesi
250 mL kültür şişesi	Dominique Dutscher	2515074	Bakteriyel kültürler
50 mL santrifüj tüpleri	Falcon	352051	Kültür santrifüjleme
Mutlak etanol	VWR Kimyasalları	20821.321	RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Allegra X-12R Santrifüj	Beckman Coulter		Bakteriyel peletleme
Ampicilin (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Büyüme ortamı
Amiloz reçinesi	Yeni İngiltere BioLabs	E8021S	MS2-afinite saflaştırma
Anti-dioksigenin AP Fab parçası	Sigma Aldrich	11093274910	Kuzey leke tahlilleri
Otoradyografi kaseti	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Kuzey leke tahlilleri
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Plazmid yapımı
BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) Et suyu	Sigma-Aldrich	53286	Büyüme ortamı
Bloke edici reaktif	Sigma Aldrich	11096176001	Kuzey leke tahlilleri
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Kuzey blot tahlilleri (substrat)
Santrifüj 5415 R	Eppendorf		RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Kloroform	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA ekstraksiyonu ve saflaştırma
DIG-RNA etiketleme karışımı	Sigma-Aldrich	11277073910	Kuzey leke tahlilleri
DNaz I	Roche	4716728001	DNaz tedavisi
Eritromisin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Büyüme ortamı
FastPrep cihazı	MP Biyomedikal	116004500	Mekanik lizis
Guanidyum Tiyosiyanat	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Kuzey leke tahlilleri
Hibridizasyon Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Kuzey blot tahlilleri
Hibridizasyon tüpleri	Techne	FHB16	Kuzey leke tahlilleri
İzoamil alkol	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
LB (Lizojeni Et Suyu)	Sigma-Aldrich	L3022	Büyüme ortamı
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mekanik lizis
MicroPulser Elektroporatör	BioRad	1652100	Plazmid yapısı
Milli-Q su cihazı	Millipore	Z00QSV0WW	Ultrasaf su
NanoDrop spektrofotometre	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA miktarı ve kalitesi
Nitroselüloz membran	Dominique Dutsher	10600002	Kuzey blot tahlilleri
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Temizleme ve dekontaminasyon
Fenol	Carl Roth	38.2	RNA ekstraksiyonu ve saflaştırma
Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz	New England Biolabs	M0530	Plazmid yapısı
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP üretimi
Poly-Prep kromatografi kolonu	BioRad	7311550	MS2-afinite saflaştırma
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Plazmid yapısı
Qubit 3 Florometre	İnvitrojen	15387293	RNA miktarı
RNAPro Çözümü	MP Biyomedikal	6055050	Mekanik lizis
ScriptSeq Komple Kit	Illumina	BB1224	cDNA kütüphanelerinin hazırlanması
Spektrofotometre Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bakteri kültürleri
SpeedVac Savant vakum cihazı	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern blot tahlilleri
T4 DNA ligaz	ThermoFisher Scientific	EL0014	Plazmid yapısı
TBE (Tris-Borat-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Kuzey leke testleri
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Plazmid yapısı
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Kuzey leke tahlilleri
X-ışını film işlemcisi	hu.q	HQ-350XT	Kuzey leke tahlilleri
X-ışını filmleri Süper RX-N	FujiFilm	4741019318	Kuzey leke tahlilleri