Süspansiyonda Altın Nanopartiküllerin Boyutlandırılması için Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu

Özet

Bu protokol, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutunun belirlenmesi için UV-vis algılaması ile birlikte Asimetrik Akış Alanı Akış Fraksiyonu'nun kullanımını açıklar.

Özet

Parçacık boyutu, nanopartikül kavramı ile ilişkili tartışmasız en önemli fiziko-kimyasal parametredir. Nanopartiküllerin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, çeşitli uygulamalar için son derece önemlidir. Boyut aralığı, nanopartikül dozunun en "aktif" bileşenini tanımladığı için de önemlidir.

Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), süspansiyondaki parçacıkların yaklaşık 1–1000 nm boyut aralığında boyutlandırılması için güçlü bir tekniktir. Bir AF4 deneyinden boyut bilgisi elde etmenin birkaç yolu vardır. AF4'ü Çok Açılı Işık Saçılma veya Dinamik Işık Saçılma ilkelerine dayanan boyuta duyarlı dedektörlerle çevrimiçi olarak bağlamanın yanı sıra, iyi kurulmuş bir teorik yaklaşım (FFF teorisi) kullanarak veya iyi tanımlanmış parçacık boyutu standartlarının (harici boyut kalibrasyonu) tutma süreleriyle karşılaştırarak bir numunenin boyutunu tutma süresiyle ilişkilendirme imkanı da vardır.

Burada, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin AF4 tarafından boyutlandırılması için standart bir işletim prosedürünün (SÇP) geliştirilmesini ve şirket içinde doğrulanmasını ve 20-100 nm boyut aralığında altın nanopartikül standartlarına sahip harici boyut kalibrasyonu kullanılarak UV-vis tespiti ile birleştiğinde açıklanmaktadır. Bu prosedür, numune hazırlama, AF4 enstrüman kurulumu ve kalifikasyonu, AF4 yöntemi geliştirme ve bilinmeyen altın nanopartikül örneğinin fraksiyonasyonu ve elde edilen sonuçların yerleşik dış boyut kalibrasyonu ile korelasyonu dahil olmak üzere geliştirilen iş akışının ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Burada açıklanan SÇP, süspansiyondaki nanopartikül örneklerinin boyutlandırılması için AF4'ün mükemmel sağlamlığını ve güvenilirliğini vurgulayan bir detaylandırma karşılaştırma çalışması çerçevesinde başarıyla doğrulandı.

Giriş

Kolloidal altın şeklindeki altın nanopartiküller (AuNP), nanopartiküllerin ne olduğu konusunda bir anlayış olmadan çok önce ve nanopartikül terimi çağdaş, bilimsel kelime hazinesine girmeden çok önce insan kültürünün bir parçasıydı. Nano ölçekli görünümleri hakkında farklı bir bilgi olmadan, askıya alınan AuNP, V-VI yüzyıllar MÖ^1'deantik Çin, Arabistan ve Hindistan'da tıbbi ve diğer amaçlar için zaten kullanılmıştır ve ayrıca eski Romalılar, British Museum^2'dekiLycurgus Cup sergisinde çömleklerini ünlü bir şekilde lekelemek için yakut kırmızı renklerinden yararlanmışlardı. Batı dünyasında, Orta Çağ'dan Modern Çağ'a kadar yüzyıllar boyunca, askıya alınan AuNP ağırlıklı olarak cam ve emaye (Cassius Moru)³ için renklendirici ajanlar olarak ve ayrıca frengi⁴başta olmak üzere çeşitli hastalıkları (İçilebilir Altın) tedavi etmek için kullanılmıştır.

Bununla birlikte, tüm bu çalışmalar öncelikle askıya alınmış AuNP uygulamasına odaklanmıştı ve oluşumlarını, doğalarını ve özelliklerini araştırmak için ilk rasyonel yaklaşımı tanıtmak 1857'de Michael Faraday'a bağlıydı⁵. Faraday, bu AuNP'nin çok dakika boyutlarına sahip olması gerektiğinin zaten farkında olmasına rağmen, boyut dağılımları hakkında açık bilgilere^{erişilebilen 6,7}, sonunda boyut ve diğer AuNP özellikleri arasındaki korelasyonu sağlayan elektron mikroskopisinin geliştirilmesine kadar değildi.

Günümüzde, oldukça kolay ve basit sentezleri, dikkat çekici optik özellikleri (yüzey plazmon rezonansı), iyi kimyasal stabilitesi ve dolayısıyla küçük toksisiteleri ve mevcut boyutlar ve yüzey modifikasyonları açısından yüksek çok yönlülükleri sayesinde, AuNP nanoelektronik^8,teşhis^9,kanser tedavisi¹⁰veya ilaç teslimi¹¹gibi alanlarda yaygın uygulamalar bulmuştur. Açıkçası, bu uygulamalar için, uygulanan AuNP'nin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, optimum etkinlik^12'yi sağlamak için temel bir ön koşuldur ve bu önemli fiziko-kimyasal parametreyi belirlemek için sağlam ve güvenilir araçlara önemli bir talep vardır. Bugün, aunp'yi süspansiyonda boyutlandırabilen çok sayıda analitik teknik vardır. örneğin, UV-vis Spektroskopisi (UV-vis)¹³, Dinamik Işık Saçılımı (DLS)¹⁴ veya Tek Parçacık Endüktif Olarak Eşleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (spICP-MS)¹⁵ ile Alan Akış Fraksiyonasyonu (FFF) bu alanda önemli bir oyuncu^16,17^,18,19,20.

İlk olarak 1966 yılında J. Calvin Giddings²¹tarafından kavramsallaştırılan FFF, ayırmanın sabit bir faz 22^,23olmadan ince, kurdele benzeri bir kanalda gerçekleştiği, elution tabanlı fraksiyonasyon teknikleri bir aileden oluşur. FFF'de ayırma, bir numunenin laminer kanal akışının yönüne dik hareket eden bir dış kuvvet alanıyla etkileşimi ile indüklenen, numunenin genellikle ilgili satır içi dedektörlere doğru aşağı doğru taşındığı yerdir. Bu ilgili FFF teknikleri arasında, ikinci bir akışın (çapraz akış) kuvvet alanı olarak işlev gördüğü Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), en yaygın kullanılan alt tip^{24 haline}gelmiştir. AF4'te, kanal tabanı (biriktirme duvarı), çapraz akışın membrandan geçmesine ve ekstra bir çıkış yoluyla kanaldan ayrılmasına izin verirken numuneyi koruyabilen yarı geçirgen bir ultrafiltrasyon membranı ile donatılmıştır. Bu sayede çapraz akış, numuneyi biriktirme duvarına doğru itebilir ve böylece difüzyon kaynaklı akısına (Brownian hareketi) karşı koyabilir. Alan ve difüzyon kaynaklı akıların ortaya çıkan dengesinde; daha yüksek difüzyon katsayıları sergileyen daha küçük numune bileşenleri kanal merkezine daha yakın hizalanırken, daha düşük difüzyon katsayıları sergileyen daha büyük numune bileşenleri biriktirme duvarına daha yakın bulunur. Kanalın içindeki parabolik akış profili nedeniyle, daha küçük numune bileşenleri bu nedenle kanal akışının daha hızlı laminasında taşınır ve daha büyük numune bileşenlerinden önce elüte edilir. FFF tutma parametresi ve Stokes-Einstein difüzyon katsayısı denklemleri kullanılarak, AF4'teki bir örneğin elüasyon süresi ve sırasıyla elüasyon hacmi doğrudan hidrodinamik boyutuna çevrilebilir²². Burada açıklanan elution davranışı normal elution modunu ifade eder ve genellikle AF4 için yaklaşık 1-500 nm (bazen parçacık özelliklerine ve fraksiyonasyon parametrelerine bağlı olarak 2000 nm'ye kadar) arasında bir parçacık boyutu aralığında geçerlidir, oysa sterik-hiperlayer elution genellikle bu boyut^{eşiğinin üzerinde gerçekleşir 25}.

FFF tarafından ayrıldıktan sonra boyut bilgilerini türetmenin üç yaygın yolu vardır. FFF modüler bir cihaz olduğundan, ek şekil bilgileri elde etmek için Çok Açılı Işık Saçılma (MALS)^{26 , 27}, Dinamik Işık Saçılma (DLS)28^,29ve hatta her ikisinin bir kombinasyonuna dayanan boyuta duyarlı ışık saçılma dedektörleri gibi birden fazla dedektörle aşağı akışta birleştirilebilir 30^,31. Bununla birlikte, bir örneğin FFF kanalındaki tutma davranışı genellikle iyi tanımlanmış fiziksel kuvvetler tarafından yönetildiği için, boyut, basit bir konsantrasyon dedektörünün (örneğin, bir UV-vis dedektörü)^{32 , 33.}

Üçüncü bir seçenek olarak,^burada,UV-vis algılaması ile birlikte AF4 kullanılarak süspansiyonda bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutlandırılması için 20-100 nm boyut aralığında iyi tanımlanmış AuNP standartları kullanılarak harici boyut kalibrasyonu 34^,35 uygulamasını rapor ediyoruz. Bu basit deneysel kurulum, daha sonra burada sunulan protokole dayanarak Avrupa Birliği Horizon 2020 projesi ACEnano çerçevesinde gerçekleştirilen uluslararası bir detay karşılaştırmasına (ILC) mümkün olduğunca çok laboratuvarın katılmasına izin vermek için bilerek seçildi.

Protokol

1. AF4 sistem kurulumu

1. AF4 kartuşunu monte edin ve af4 sisteminin tüm donanım bileşenlerini ve UV-vis dedektörünü(Malzeme Masası)üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek bağlayın.
2. Üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek kontrol, veri toplama, işleme ve değerlendirme için gerekli tüm yazılım paketlerini yükleyin.
3. AF4 sistemi ile UV-vis dedektörü arasında gerekli tüm sinyal bağlantılarının kurulduğundan emin olun.
4. Kurulu AF4-UV-vis bağlantılarının sıkı ve sızıntı olmadan olduğundan emin olun, kurulumu 15 dakika boyunca ultra saf su (UPW) ile yıkayın (uç akış hızı 1 mL⭐dk^-1, odak akış hızı 1 mL⭐dk^-1ve çapraz akış hızı 1,5 mL min^-1). Bunu yapmak için AF4 kontrol yazılımını açın ve açılış sayfasının sağ üst tarafındaki ilgili panellere akış hızlarını girin. Gerekirse ilgili konektörleri (bağlantı parçaları) sıkın ve sızıntı gözlenemeyene kadar prosedürü tekrarlayın.
   NOT: Tüm ölçümler sırasında dahili sistem basıncı izlenmeli ve 4 ila 12 bar içinde olmalıdır. Basıncın daha yüksek veya daha düşük olması durumunda, geri basınç tüpünün ayarlanması gerekir. Ayrıca, kanal basıncı eğilimi tam ölçüm süresi boyunca sabit olmalıdır.
   NOT: Bir kanal fırını varsa, tüm AF4 denemeleri boyunca karşılaştırılabilir ölçüm koşulları sağlamak için sıcaklığını 25 °C olarak ayarlayın.

2. AF4-UV-vis sistem kalifikasyonu ve numune analizi için çözeltilerin ve süspansiyonların hazırlanması

1. Temizleme çözümü
   1. 1 L UPW'ye 8 g katı sodyum hidroksit (NaOH) ve 2 g sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin ve çözeltiyi tamamen çözünene kadar karıştırın.
2. Eluent
   1. Unu elde etmek için 2 L filtrelenmiş ve gazsız UPW'ye 500 μL filtrelenmiş yüzey aktif madde karışımı ekleyin (%0,025 (v/v), pH yaklaşık 9,4).
      NOT: Yüzey aktif madde karışımının bileşiklerinin ayrıntılı bir açıklaması Tablo 1'de (ayrıca Malzeme Tablosu) verilmiştir.
3. Toplu kurtarma belirleme için rastgele AuNP boyut standardı
   1. Vortex 2 dakika boyunca rastgele bir AuNP boyutu standardı (50 mg⭐L^-1)ve 12.5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile^1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonu homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap.
      DİkKAT: Kimyasallarla, özellikle NaOH peletleriyle çalışırken gerekli ihtiyati tedbirler ve uygun koruyucu ekipman gereklidir.
      NOT: AF4-UV-vis-deneyleri sırasında düşük partikül arka planları sağlamak için genellikle 0,1 μm membran filtresi (hidrofilik PVDF veya benzeri) kullanarak gerekli tüm çözeltilerin (temizleme çözeltisi hariç) gazdan arındırılması ve filtrelenmeniz önerilir. Bu, özel bir vakum filtrasyon ünitesi veya şırınna filtreleri kullanılarak kurulabilir.

3. AF4-UV-vis sistem yeterliliği

1. Sistemi 30 dakika boyunca temizleme çözümüyle yıkamak için 1.4 adımında açıklanan yazılım ayarlarını kullanın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk^-1, Odak akış hızı 1 mL⭐min^-1ve Çapraz akış hızı 1.5 mL⭐dk^-1).
2. İlgili yılan balığı şişesini değiştirin ve sistemi 20 dakika boyunca UPW ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk^-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk^-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL⭐dk^-1).
3. İlgili satır içi pompa filtrelerini değiştirin.
4. AF4 kartuşunu açın ve AF4 zarını değiştirin. AF4 kartuşunu yeniden bir araya alıp AF4-UV-vis sistemine yeniden bağlayın.
5. Temizlenen AF4-UV-vis sistemini, membranı dengelemek ve sistemi stabilize etmek için en az 30 dakika boyunca elüent ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk^-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk^-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL min-1). Olası sızıntıları tekrar denetleyin (bkz. adım 1.4).
6. Rasgele bir AuNP boyutu standardı kullanarak kütle kurtarma ve tutma süresinin değişimini belirleyerek AF4-UV-vis sistemini niteleyebilirsiniz.
   1. Ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışması gerçekleştirin.
      1. Dosya |'nı açarak yeni bir ölçüm dosyası oluşturma Yeni | AF4 kontrol yazılımında çalıştırın.
      2. Örnek ve ölçüm açıklamasının yanı sıra çalıştırma sekmesindeki ekleme hacmini ve örnek adını tanımlayın. Ölçüm koşulları Tablo 2'de görüntülenir.
      3. İkinci sekme FFF yöntemindeki ölçüm parametrelerini Tablo 2'ye göre ayarlayın.
      4. Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
   2. Ayırma kuvveti (Çapraz akış) uygulamasıyla kesirli bir çalışma gerçekleştirin.
      1. Tablo 3'tebelirtilen kesir koşullarını kullanarak önceki bölümde açıklandığı gibi kesir yöntemini tanımlayın.
      2. Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
      3. Ölçümü dört katına çıkar.
         NOT: İlk çalıştırma sistemi (yani AF4 zarını) şartlandırmayı amaçlamaktadır ve sistem yeterlilik sonuçlarının nihai değerlendirmesinin dışında kalacaktır.
         NOT: Dosya |'i açarak oluşturulan tüm çalıştırma dosyalarını kaydetmeniz önerilir AF4 kontrol yazılımına kaydedin.

7. 1. 
      
   2. 
      
      

1. 1. 
      
      
   6. 
      
   8. 
      
2. 3. 
      
      
3. 
   
   3. 
      
   6. 
      

Sonuçlar

İlk olarak, AuNP boyut standartları AF4 ile kesirlendi ve 532 nm dalga boyunda (AuNP'nin yüzey plazmon rezonansı) AuNP'nin emiciliğini ölçen UV-vis ile tespit edildi. Elde edilen fraktogramların yer paylaşımı Şekil 1'desunulmuştur. Her AuNP'nin triplikat ölçümlerinden elde edilen ilgili UV-vis tepe maksimumunda tutma süreleri Tablo 5'telistelenmiştir. Tüm saklama sürelerinin göreli standart sapması, artan boyutla azalan ölçüm farkı ile % 1,1'in altındaydı. Genel olarak, mükemmel bir tekrarlanabilirlik elde edildi. Elution süresi ve hidrodinamik boyutun doğrusal bir ilişkisi ile sonuçlanan sabit bir ayırma kuvveti uygulandı. Dış boyut kalibrasyon hattı, belirtilen hidrodinamik yarıçapın, düzeltilen boş işleme süresine (net tutma süresi) karşı çizilmesiyle kurulmuştur. Doğrusal regresyon analizi, a = -3.373 nm ± 1.716 nm ve eğim b = 1.209 nm⭐dk^-1 ± 0.055 nm min^-1ile doğrusal kalibrasyon fonksiyonu ile sonuçlandı. Elution'ın doğrusal davranışı 0.9958'in kare korelasyon katsayısı R² ile doğrulandı. İlgili kalibrasyon fonksiyonu Şekil 2'degörsel olarak görüntülenir.

İkinci bölümde bilinmeyen AuNP örneğinin analizi ele alındı. Protokol bölümünde(bölüm 4.2)açıklanan prosedüre göre numunenin üç aliquots hazırlandı. Üç aliquot'un her biri, AuNP boyut standartları için de uygulanan aynı AF4 fraksiyonasyon yöntemi kullanılarak üç taraflı olarak araştırılmıştır. Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen dokuz AF4-UV-vis fraktogramının tümü Şekil 3'te sunulmuştur ve ilgili değerlendirmeleri Tablo 6'daözetlenmiştir. İlgili saklama sürelerinin göreli standart sapması önemli ölçüde düşüktü ve% 0.1 ile% 0.5 arasında değişiyordu. AuNP boyut standartlarının kesirlenmesinden elde edilen parçacık boyutu kalibrasyon fonksiyonu kullanılarak ve UV-vis tepe maksimumda bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen tutma süreleriyle ilişkilendirilerek, 29,4 nm ± 0,2 nm'lik genel ortalama bir hidrodinamik yarıçap hesaplanabilir. Ayrıca, AuNP örneğinin önemli bir aglomera veya çözünmesi veya parçacıkların membran yüzeyine önemli ölçüde adsorpsiyonu olmadığını gösteren% 83.1 ±% 1.2'lik makul bir kütle geri kazanımı elde edildi. Şekil 4, elde edilen parçacık boyutu dağılımını, uygulanan AF4 yönteminin mükemmel sağlamlığını vurgulayan ortalama dokuz UV-vis sinyal izinin tümüyle görüntüler.

Şekil 1: Normalleştirilmiş sinyal yoğunlukları ve uygulanan sabit çapraz akış hızı (siyah çizgi) ile dört ayrı AuNP boyut kalibrasyon standardının triplikat analizinden elde edilen AF4-UV-vis fraktogramlar. Boşluk zirvesi yaklaşık 5,9 dk'da gri renkle vurgulanır.

Şekil 2: DLS ölçümlerinin ilgili standart sapmalarından (Tablo 4) elde edilen hata çubukları ve elde edilen AF4 saklama sürelerindeki farklılıklar (Tablo 5) dahil olmak üzere, belirtilen hidrodinamik yarıçapı her bir AuNP boyut kalibrasyon standardının tutma süresine göre çizildikten sonra elde edilen harici boyut kalibrasyon fonksiyonu. Doğrusal regresyon analizinden y = a + bx, = -3.373 nm ± 1.716 nm ve b = 1.209 nm·dk^-1 ± 0.055 nm·dk^-1 şeklinde standart hatalar içeren doğrusal kalibrasyon fonksiyonu hesaplanmıştır. Doğrusal bir ilişkiyi gösteren R² = 0.9958 ile kare korelasyon katsayısı belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bilinmeyen AuNP'yi gösteren üç aliquot'un üç taraflı ölçümlerinin AF4-UV-vis fraktogramları. Ölçüm süresi boyunca uygulanan sabit çapraz akış hızı siyah bir çizgi olarak gösterilmiştir. Yaklaşık 5,9 dakikadaki boşluk zirvesi gri renkle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen ortalama partikül boyutu dağılımının (kırmızı) ve uygulanan doğrusal kalibrasyon işlevinin (noktalı çizgi) yer paylaşımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen		CAS-Hayır	Ağırlık (%)
Su		7732-18-5	88.8
9-Oktandesnoik asit (Z)-, bileşik ile 2,2',2''-nitrilotris[etanol](1:1)		2717-15-9	3.8
Sodyum karbonat		497-19-8	2.7
Alkoller, C12-14-sekonder, etoksilatlı		84133-50-6	1.8
Tetrasosyum EDTA		64-02-8	1.4
Polietilen glikol		25322-68-3	0.9
Sodyum oleat		143-19-1	0.5
Sodyum bikarbonat		144-55-8	0.1

Tablo 1: Eluent hazırlamak için kullanılan yüzey aktif madde karışımının bileşenlerinin listesi (ayrıca bkz. Malzeme Tablosu).

AF4-UV-vis parametreleri	Birim	Değer
Aralayıcı kalınlığı	Μm	350
Dedektör akış hızı	mL min-1	0.5
Çapraz akış hızı	mL min-1	0 (8 dakika sabit)
Odak akış hızı	mL min-1	0
Gecikme süresi / stabilizasyon süresi	Dk	0
Enjeksiyon akış hızı	mL min-1	0.5
Geçiş zamanı	Dk	0
Enjeksiyon süresi	Dk	0.1
Elution adımı	Dk	8
Durulama adım süresi	Dk	0.1
Adım akış hızını durula	mL min-1	0.1
Enjeksiyon hacmi	μL	10
Numune konsantrasyonu	mg L-1	12.5
Membran tipi		Rejenere selüloz
Membran moleküler ağırlık kesme	Kartal	10
Eluent		%0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı
UV-vis dalga boyu	Nm	532
UV-vis hassasiyeti	-	0.001

Tablo 2: Bir ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışmasını gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.

AF4-UV-vis parametreleri	Birim	Değer
Aralayıcı kalınlığı	Μm	350
Dedektör akış hızı	mL min-1	0.5
Çapraz akış hızı	mL min-1	1 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal)
Odak akış hızı	mL min-1	1.3
Gecikme süresi / stabilizasyon süresi	Dk	2
Enjeksiyon akış hızı	mL min-1	0.2
Geçiş zamanı	Dk	0.2
Enjeksiyon süresi	Dk	5
Elution adımı	Dk	70 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal)
Durulama adımı	Dk	9
Adım akış hızını durula	mL min-1	0.5
Enjeksiyon hacmi	μL	50
Numune konsantrasyonu	mg L-1	12.5
Membran tipi		Rejenere selüloz
Membran moleküler ağırlık kesme	Kartal	10
Eluent		%0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı
UV-vis dalga boyu	Nm	532
UV-vis hassasiyeti	-	0.001

Tablo 3: Kesirleme çalışmasını ayırma kuvveti olarak çapraz akış uygulamasıyla gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.

Kalibrasyon standardı	Kapatma aracısı	Ortalama Boyut (TEM) (nm)	CV (ortalama boyut TEM) (%)	Zeta potansiyeli (mV)	SD (zeta potansiyeli) (mV)	Hidrodinamik Yarıçap (DLS) (nm)	SD (hidrodinamik yarıçap) (nm)	Pdı	SD (PDI)
AuNP 20 nm	Sitrat	20.1	≤ 8	-48.9	1.5	10.95	0.12	0.082	0.009
AuNP 40 nm	Sitrat	40.8	≤ 8	-30.4	1.0	20.30	0.13	0.127	0.006
AuNP 80 nm	Sitrat	79.2	≤ 8	-51.5	1.3	38.85	0.23	0.138	0.013
AuNP 100 nm	Sitrat	102.2	≤ 8	-50.9	0.9	52.30	0.37	0.078	0.009

Tablo 4: Kapaklama maddesi, TEM ortalama boyutu, yerel süspansiyonda belirlenen Zeta potansiyeli ve sıvıda belirlenen DLS hidrodinamik yarıçapı ve polidispersite indeksi (PDI) dahil olmak üzere uygulanan AuNP kalibrasyon standartlarının fiziko-kimyasal parametrelerinin özeti.

Kalibrasyon standardı	Çalıştırmak	En yüksek maksimumda saklama süresi (min)	En yüksek (min) net saklama süresi	Ortalama net saklama süresi (min)	SD (%) (net saklama süresi)	SD (min) (net saklama süresi)
AuNP 20 nm	1	17.368	11.468	11.56	1.02	0.12
	2	17.409	11.509
	3	17.589	11.689
AuNP 40 nm	1	25.316	19.416	19.49	0.68	0.13
	2	25.32	19.42
	3	25.548	19.648
AuNP 80 nm	1	42.095	36.195	36.29	0.23	0.08
	2	42.219	36.319
	3	42.257	36.357
AuNP 100 nm	1	50.975	45.075	45.06	0.07	0.03
	2	50.924	45.024
	3	50.986	45.086

Tablo 5: AuNP kalibrasyon standartlarının, Tablo 3'teaçıklanan yöntem kullanılarak ilgili AF4-UV-vis fraktogramlardan elde edilen ilgili UV-Vis zirvesindeki tutma süreleri maksimum.

Aliquote	Çalıştırmak	Saklama süresi en yüksek (min)	En yüksek maksimumda ortalama saklama süresi (min)	En yüksek (min) net saklama süresi	SD (%) saklama süresi	Hidrodinamik yarıçap (nm)	Kurtarma (%)
1	1	32.689	32.70	26.789	0.07	29.03	85.34
	2	32.687		26.787
	3	32.719		26.819
2	1	32.989	33.08	27.089	0.37	29.49	81.73
	2	33.073		27.173
	3	33.187		27.287
3	1	33.053	33.14	27.153	0.49	29.56	82.14
	2	33.071		27.171
	3	33.291		27.391

Tablo 6: İlgili UV-Vis tepe maksimumundaki tutma sürelerinin özeti, dış boyut kalibrasyonundan hesaplanan hidrodinamik yarıçap (Şekil 2) ve AF4-UV-vis analizinden elde edilen bilinmeyen AuNP örneğinin geri kazanım oranı.

Tartışma

Bilinmeyen bir AuNP'nin hidrodinamik boyutu, AF4 tarafından 20 nm ila 100 nm arasında iyi tanımlanmış AuNP boyut standartları kullanılarak bir UV-vis dedektörü ile birlikte doğru bir şekilde değerlendirildi. Geliştirilen AF4 yöntemi, ölçülen tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki kurmak için sabit bir çapraz akış profili kullanılarak optimize edildi ve böylece doğrusal regresyon analizinden basit bir boyut belirlemesi sağladı. Özellikle odak noktası, fraksiyonasyon sırasında önemli bir numune kaybı olmadığını gösteren yeterince yüksek geri kazanım oranları elde etmek ve uygulanan yılan balığı ve membran da dahil olmak üzere geliştirilen AF4 yönteminin tüm fraksiyone edilmiş AuNP örnekleriyle iyi eşleşmesiydi.

Yöntem geliştirme, AF4'teki tartışmasız en kritik adımdır ve belirli bir elüasyon süresi penceresinde fraksiyonasyonu iyileştirmek için kanal boyutları, akış parametrelerinin yanı sıra atık su, membran, ara parça yüksekliği ve hatta örnek özellikleri de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin dikkate alınması gerekir. Bu paragrafın amacı, burada tartışılan bilinmeyen AuNP örneğinin boyutunu başarıyla belirlemek için en iyi duruma getirilmiş kritik adımlarda okuyucuya rehberlik etmektir. Genellikle bir AF4 yönteminin nasıl geliştirileceği hakkında daha ayrıntılı bir açıklama için, okuyucu 'ISO/ TS21362:2018 - Nanoteknolojiler - Asimetrik akış ve santrifüj alan akışı fraksiyonasyonu kullanılarak nano nesnelerin analizi'^25'inAF4 bölümüne atıfta bulunulmaktadır. Tablo 3'te verilen uygulanan fraksiyonasyon koşullarına daha yakından bakmak , ilk kritik adım AF4 kanalındaki AuNP örneğinin tanıtılması ve gevşemesidir. Bu adım, etkileşimi örneği membran yüzeyine yakın bulmaya ve temelde fraksiyonun başlangıç noktasını tanımlayan AF4 kanalının enjeksiyon portuna yakın dar bir bantta konsantre etmeye zorlayan enjeksiyon akışı, odak akışı ve çapraz akış tarafından yönetilir. Bu adım sırasında, farklı boyutlardaki örnek bileşenlerin AF4 kanalının farklı yüksekliklerinde bulunması ve böylece başarılı bir boyut fraksiyonasyonu için temel oluşturması nedeniyle numunenin yeterli bir şekilde gevşetilmesi zorunludur. Tamamlanmamış numune gevşemesi genellikle boyanmamış (yani rahat olmayan) örnek bileşenlerden kaynaklanan artan bir boşluk tepe alanı ile görülebilir. Bu etki enjeksiyon süresi ve/veya uygulanan çapraz akış hızı artırılarak azaltılabilir. Bununla birlikte, her iki parametre de özellikle AF4 membranına aglomerasyon ve adsorpsiyona eğilimli numuneler için dikkatli optimizasyona ihtiyaç duyar ve farklı parametre ayarları^36,37için elde edilen ilgili kurtarma oranları ile izlenebilir. 5 dakikalık uygulanan enjeksiyon süresi ve 1,0 mL⭐dk^-1 çapraz akış hızı, tüm AuNP örnekleri için geri kazanım oranlarını >%80 ve neredeyse optimum gevşeme koşullarını gösteren ihmal edilebilir bir boşluk tepe alanını ortaya çıkardı. AuNP örneğinin yeterli gevşemesinin ardından odak akışı durduruldu ve AF4 kanal uzunluğu boyunca ikinci kritik adımı temsil eden ilgili UV-vis dedektörüne numune taşınması başlatıldı. Makul analiz sürelerinde yeterince yüksek fraksiyonasyon gücü sağlamak için, 30-50 dakika boyunca (ilgili fraksiyone AuNP boyut standardına bağlı olarak) 1,0 mL/dk^-1 sabit çapraz akış hızı ve ardından 0,5 mL.dk -1 dedektör akış hızında¹⁰ dk doğrusal çapraz akış bozunması uygulanmıştır. Tüm AuNP boyut standartlarının ayrımı boyunca sabit bir çapraz akış profili kullanmak, FFF-teorisi^22'yitakiben tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki ortaya çıkardı, böylece bilinmeyen AuNP örneğinin basit doğrusal regresyon analizi ile boyut belirlemesini sağladı. Bununla birlikte, sabit bir çapraz akış dışındaki profiller de nanopartiküllerin boyutlandırılması için sömürülmüştür ve sonuçta tutma süresi ile parçacık boyutu^38,39arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye yol açmaktadır. Ek olarak, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak boyut belirleme AuNP ile sınırlı değildir, ancak diğer boyutlarda ve element bileşiminde (örneğin, gümüş³⁸, 40 veya silika nanopartiküller^41,42)nanopartiküllere de uygulanabilir. Ek olarak, seyreltilmiş numunelerle çalışırken, ICP-MS, AF4 ile birleşebilen ve süspansiyondaki çok çeşitli nanopartiküllerin boyutlandırılması için bu analitik yaklaşımın çok yönlülüğüne katkıda bulunan son derece hassas bir elementel dedektördür.

Yaygın uygulamasına rağmen, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak dış boyut kalibrasyonu, bilinmeyen numunelerin doğru boyutlandırılması için kullanırken dikkate alınması gereken bazı özelliklere sahiptir. Her şeyden önce, büyük ölçüde ilgili boyut standartlarının ve gerçek numunenin fraksiyonasyonu sırasında karşılaştırılabilir koşulların uygulanmasına dayanır. Burada sunulan durumda, hem AuNP boyut standartlarının hem de bilinmeyen AuNP örneğinin aynı AF4 yönteminin yanı sıra aynı eluent ve aynı membranın bu yaklaşımı oldukça esnek olmayan hale getirmesi zorunludur. Ayrıca, örneğin hafif saçılma (MALS ve DLS) gibi boyuta duyarlı dedektörler olmadan, boyut standartlarını kullanan ilgili bir AF4 yönteminin yeterince iyi çalışıp çalışmadığını belirlemek zordur. Bu, özellikle çok geniş boyutlu dağılımlar sergileyen bilinmeyen örnekler için geçerlidir, burada tüm örnek bileşenlerin normal elution desenini izleyip izlemediği belirsizliğini korur: daha küçük parçacıklardan daha büyük parçacıklara fraksiyonasyon veya daha büyük örnek bileşenlerin sterik-hiperlayer modunda zaten elute olup olmadığı ve böylece potansiyel olarak daha küçük örnek bileşenleri^43,44ile birlikte elde edilip edilmediği. Buna ek olarak, FFF-teorisi AF4'ü sadece hidrodinamik boyuttaki farklılıklara dayanarak ayırdığını ve parçacıkların çevreleriyle herhangi bir etkileşimde bulunmadan nokta kütleleri olarak kabul edildiğini vurgulasa da²², gerçeklik parçacık-parçacık ve parçacık-mem ile farklı bir hikaye anlatır beyin etkileşimleri (elektrostatik çekim/itme veya van-der-Waals cazibesi gibi) önemli bir rol oynayabilir ve harici boyut kalibrasyonu^45,46aracılığıyla boyut belirlemelerine ölçülebilir bir önyargı getirebilir. Bu nedenle, ilgi çekici parçacığın bileşimine ve yüzey özelliklerine (Zeta potansiyeli) ideal olarak uyan boyut standartlarının kullanılması önerilir^40,42 veya, bunlar mevcut değilse, en azından iyi karakterize edilmiş partikül boyutu standartlarını (örneğin, polistiren lateks parçacıklar) kullanın ve özellikle analizin^{yapılacağı}ilgili ortamdaki yüzey Zeta potansiyeli açısından ilgi parçacıkları ile karşılaştırılılabilirliklerini dikkatlice değerlendirin.

AF4'ün çok yönlülüğü genellikle en büyük gücü olarak kabul edilir, çünkü bu alandaki diğer yaygın boyutlandırma tekniklerinin çoğunun ötesine geçen bir uygulama aralığı sunar^22,48,49. Aynı zamanda, ilişkili muhtemel karmaşıklığı nedeniyle, özellikle DLS, Nanopartikül İzleme Analizi veya tek parçacıklı ICP-MS gibi hızlı ve görünürde kullanımı kolay boyutlandırma tekniklerine karşı en önemli dezavantajı olarak da kabul edilebilir. Bununla birlikte, AF4'ü bu popüler boyutlandırma teknikleri ile perspektife koyarken, tüm tekniklerin artıları ve eksileri olduğu açıktır, ancak hepsi nanopartiküllerin fiziko-kimyasal doğasının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur ve bu nedenle rekabetçi değil tamamlayıcı olarak kabul edilmelidir.

Burada sunulan standart çalışma prosedürü (SÇP), BILINMEYEN bir AuNP örneğinin süspansiyonda boyutlandırılması için harici boyut kalibrasyonu ile AF4-UV-vis'in mükemmel uygulanabilirliğini vurgular ve sonunda Horizon 2020 projesi ACEnano (bu ILC'nin sonucu gelecekteki bir yayına konu olacaktır) çerçevesinde yürütülen uluslararası bir detaylandırma karşılaştırması (ILC) içinde bilinmeyen bir AuNP örneğinin AF4 analizi için önerilen bir kılavuz olarak uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokol, AF4'ün nanopartikül karakterizasyonu alanındaki umut verici potansiyelinin altını çizen AF4 metodolojileri^{25,50,51,52'yi} doğrulamak ve standartlaştırmak için teşvik edici ve devam eden uluslararası çabalara katkıda bulunur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.1 ve mikro; m Membran Filtreler (hidrofilik PVDF)	Postnova Analytics GmbH	Z-FIL-TEF-002	Sulu çözeltiler
0.22 ve mikro; m PVDF Şırınga Filtresi (d = 33 mm)	Merck Millipore	Durapore Millex	NovaChem100
Ayarlanabilir Hacimli Pipetlerin (1000 ve mikro; L)	Eppendorf AG	Research Plus	Seyreltilmiş AuNP süspansiyonları hazırlamak için kullanılır
AF4 kartuşu	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF - AF4 AF4 Analitik Kanal	el yazmasında AF4 sistemi olarak tanımlanan AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun
)	Postnova Analytics GmbH	Z-AF4-MEM-612-10KD	El yazması Analytical Balance'da AF4 sistemi olarak tanımlanan AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni
(0,1 mg hassasiyet)	Sartorius	ENTRIS124I-1S	Temizleme solüsyonunun hazırlanması için SDS ve NaOH peletlerini tartmak için kullanılır
Autosampler	Postnova Analytics GmbH	PN5300	AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun el yazması Kanal Fırınında
	AF4 sistemi olarak tanımlanan bileşeniPostnova Analytics GmbH	PN4020	AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni,
Crossflow	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF Kontrol Modülü	yazmasında AF4 sistemi olarak tanımlanan AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni, tek
kullanımlık Pipet Uçları (1000 & L)	Eppendorf AG	ep T.I.P.S	Seyreltilmiş AuNP süspansiyonları hazırlamak için kullanılır
Şişeler (örn. 2 litre hacim)	neoLab	1-0199	Eluent depolama için kullanılır
Focus Pump	Postnova Analytics GmbH	PN1131	El yazması Cam Şişelerde AF4 sistemi olarak tanımlanan AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni
(örn. 1,5 mL hacim)	Postnova Analytics GmbH	VIA-002	Numune saklama için kullanılır
Altın Nanopartikül Boyut Standartları (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)	Postnova Analytics GmbH	NovaCal Gold	50 mg L-1, boyut kalibrasyon fonksiyonunu oluşturmak için kullanılır
Manyetik Karıştırıcı	IKA	VIBRAX-VXR	SDS ve NaOH peletlerinin çözünmesini hızlandırmak için
kullanılırDell	Technologies	/	AF4 çalışmalarını kontrol etmek, toplanan verileri kaydetmek ve değerlendirmek için ünite, gerekli donanım ve yazılım gereksinimleri için okuyucu Postnova AF2000 kılavuzuna yönlendirilir
Kişisel koruyucu donanım (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük vb.)	/	/	İlgili laboratuvara uygun olarak' Mühendislik nanomalzemeleri de dahil olmak üzere kimyasallarla çalışmak için güvenlik kuralları
Cam Şişeler için Vidalı Üst (örn. 1,5 mL hacim)	Postnova Analytics GmbH	Z-VIA-09150868	Numune saklama için kullanılır
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), ≥ 99 %, Kurutma Sınıfı	Carl Roth GmbH & Co KG	2326.1	temizleme solüsyonunun hazırlanmasında kullanılır
; 98 %, p.a	Carl Roth GmbH & Co KG	6771.1	Temizleme solüsyonunun hazırlanması için kullanılır
Kontrol ve Veri Toplama için Yazılım Paketi	Postnova Analytics GmbH	NovaFFF AF2000 Yazılımı	Af4 çalıştırmalarını ve veri toplamayı gerçekleştirmek için yazılım, gerekli donanım ve yazılım gereksinimleri için okuyucu Postnova AF2000 kılavuzuna yönlendirilir
Veri Değerlendirme için Yazılım Paketi	Postnova Analytics GmbH	NovaAnalysis Yazılımı	AF4 veri değerlendirmesi için yazılım, gerekli donanım ve yazılım gereksinimleri için okuyucu Postnova NovaAnalysis kılavuzuna yönlendirilir
Nihai Veri İşleme için Yazılım Paketi	OriginLab Corporation	Origin 2019	Nihai veri işleme için kullanılır
Solvent Gaz Giderici	Postnova Analytics GmbH	PN7520	AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni, makalede
AF4 sistemi olarak tanımlanmıştırSolvent Seçici	Postnova Analytics GmbH	PN7310	AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun Solvent
Solvent Organizer	Postnova Analytics GmbH	PN7140	Bileşeninde AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni,
Yüzey Aktif Madde Karışımı	Postnova Analytics GmbH	NovaChem100	el yazmasında AF4 sistemi olarak tanımlanmıştırEluent hazırlama için kullanılan farklı yüzey aktif maddelerin ve tuzların karışımı
Uç Pompası	Postnova Analytics GmbH	PN1130	AF2000 MF - MultiFlow FFF kurulumunun bileşeni, el yazması Bilinmeyen AuNP örneğinde AF4 sistemi olarak tanımlanmıştır
	BBI Çözümleri	EM. GC60	60 nm AuNP numunesi, boyut kalibrasyon fonksiyonu ile boyut belirleme için kullanılır
UV-vis Dedektörü	Postnova Analytics GmbH	PN3211	UV-vis dedektörü AF4 sistemi ile aşağı akış bağlantısı için
Vakum Filtrasyon Ünitesi	Postnova Analytics GmbH	Eluent Filtrasyon Sistemi	Optimum AF4 fraksiyonlama koşullarını sağlamak için düşük partikül arka planlarını ve kullanılan eluentlerdeki çözünmüş havanın uzaklaştırılmasını sağlamak için kullanılır
Vortex	IKA	Vortex Genie 2	Seyreltilmiş AuNP süspansiyonlarının homojenizasyonu için kullanılır
Su Arıtma Sistemi	Merck Millipore Milli-Q	Integral 5	Ultra saf su (UPW, 18.2 M & Omega; cm direnç) temizleme çözeltisinin, eluentlerin hazırlanması ve AuNP süspansiyonlarının seyreltilmesi için