Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61774

⸱

16 Ocak 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Özet

Çeşitli enfeksiyöz, metabolik, otoimmün, neoplastik ve diğer hastalıklar için terapötik müdahaleler olarak antikorlar için yüksek talep rekombinant antikor üretimi için verimli yöntemler geliştirilmesinde artan bir ihtiyaç oluşturur. 2019 itibariyle 70'ten fazla FDA onaylı monoklonal antikor vardı ve üstel büyüme potansiyeli var. Onların sözüne rağmen, yaygın kullanım için sınırlayıcı faktörler üretim maliyetleri ve karmaşıklığı vardır. Potansiyel olarak, bitkiler düşük maliyetli, güvenli ve kolayca ölçeklenebilir protein üretim stratejileri sunar. Nicotiana benthamiana gibi bitkiler sadece doğru katlayabilir ve karmaşık memeli proteinleri monte ama aynı zamanda memeli hücre kültürleri tarafından sunulan benzer kritik post-çevirisel değişiklikler ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, yerli GFP ve insan monoklonal antikorlar erimiş yeşil floresan protein (GFP) bir asit kararlı varyantı kullanarak, n. benthamiana bitkilerden tüm geçici antikor ekspresyonu ve arıtma süreci görselleştirmek başardık. Deneyin amacına bağlı olarak, yerli GFP füzyonbitkilerde ifade aşamasında daha kolay görselleştirme sağlayabilir, asit kararlı GFP füzyon aşağı işleme sırasında görselleştirme sağlarken. Bu ölçeklenebilir ve basit prosedür sadece birkaç küçük bitkiler kullanarak birkaç gün içinde son derece saf antikor veya antikor füzyon proteinleri miligram miktarlarda üretmek için tek bir araştırmacı tarafından yapılabilir. Böyle bir teknik antikor saflaştırma süreci ve potansiyel olarak diğer birçok proteinlerin her türlü görselleştirme için genişletilebilir, bitki ve diğer ifade sistemlerinde hem de. Ayrıca, bu teknikler sanal talimatlardan yararlanabilir ve moleküler biyoloji teknikleri konusunda en az deneyime sahip lisans öğrencileri tarafından bir öğretim laboratuvarında yürütülebilir ve gerçek dünya uygulamaları ile proje tabanlı keşif için bir temel sağlar.

Giriş

Endüstri raporları, Amerika Birleşik Devletleri'nde en çok hasılat yapan yirmi ilaçtan 13'ünün biyolojik (protein bazlı ilaçlar) olduğunu ve bunların dokuzunun antikor olduğunu göstermektedir. 2019 yılı itibariyle, çeşitli klinik gelişimevrelerinde570'in üzerinde antikor (Ab) terapötik1,2,3idi. Mevcut küresel Ab satışları 100 milyar USD aşan ve monoklonal Ab (mAb) terapötik pazar 20251,4tarafından 300 milyar USD kadar üretmek bekleniyor. Bu kadar yüksek talep ve beklenen gelir artışları ile, araştırmacılar daha yüksek kalite ve daha düşük maliyetler ile, her zamankinden daha büyük bir ölçekte Ab terapötik üretmek için yollar geliştirmek için çalışıyoruz. Bitki tabanlı ifade sistemleri Ab terapötik uygun fiyatlı ve büyük ölçekli üretim için geleneksel memeli hücre hatları üzerinde çeşitli avantajları var5,6. Bitkilerde protein terapötik üretimi ("moleküler pharming") pahalı biyoreaktörler veya hücre kültürü tesisleri geleneksel memeli hücre kültürü teknikleri7,8gibi gerektirmez. Bitkiler insan patojenlerine byüklenici olamaz, potansiyel kontaminasyonu en aza indirir9. Hem geçici hem de transgenik bitki bazlı protein ekspresyonu memeli veya bakteri üretim sistemlerine daha düşük maliyetli alternatifler olarak kullanılabilir10. Mahsul üretimi için transgenik bitkiler tercih edilebilse de, bu yöntemi kullanarak rekombinant protein üretimi haftalar ile aylar arasında sürebilir. Şırınga veya vakum agroinfiltrasyon yoluyla viral vektörler kullanarak geçici ifade gelişmeler, sırasıyla, gün11, 12,13,14istenilen proteinin küçük ve büyük ölçekli üretim için izin verir. Ebola, Dang ve Zika'ya karşı mAbs üretimi ve çok sayıda diğer rekombinant proteinler, hızlı ve verimli N. benthamiana bitkiler15geçici ifade kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmış 15,16,17,18,19. Bu koşullar geçici bitki tabanlı ifade birden fazla Ab terapötik ve bu protokol20gösterilen yöntemler geliştirmek için cazip bir seçenek olun.

Birinci nesil mAb'ler murine türevidir, bu da insan deneylerinde kullanıldığında spesifik olmayan immünjenite ile sonuçlanır21. Zamanla, şeymerik, insancıl, ve sonunda, tamamen insan Abs Ab terapötik tarafından indüklenen immünjenite yi tirmek için üretildi. Ne yazık ki, bu Abs bazıları hala glikozilasyon farklılıkları nedeniyle konak immünojenite neden21. Tesis mühendisliğindeki gelişmeler Ab glikanlarının modifikasyonuna olanak sağlamıştır, bu da ab'nin stabilitesi ve fonksiyonu glikozilasyon durumundan önemli ölçüde etkilenebileceğinden gereklidir22. Gelişmeler insanca mAbs üst düzey ifade bitki sistemlerinde üretim izin verdi, insan glikaniçeren ve sonuçta bir kitle üretilen insan ilaç istenilen biyolojik özellikleri19,21.

Rekombinant Abs ek olarak, Ab füzyon molekülleri (Ab füzyon) son yıllarda çeşitli amaçlar için araştırılmıştır. Ab füzyonları genellikle bir molekül veya proteine kaynaşmış bir Ab veya Ab parçasından oluşur ve bağışıklık efektörü hücrelerinden yanıt almak için tasarlanmıştır23. Bu moleküller kanser ve otoimmün hastalıklar24,25,26,27gibi çeşitli patolojiler tedavi etmek için potansiyel terapötik müdahaleler olarak oluşturulmuştur. Rekombinant bağışıklık kompleksleri (RİCs) aşı adayları28olarak istihdam edilmiştir Ab füzyon başka bir sınıftır. RiCs ab füzyon Fc bölgeleri tanımak için bağışıklık sisteminin yeteneğini yararlanmak ve diğer aşı platformları ile kombine edildiğinde immünojenite geliştirmek için bulunmuştur29,30,31.

Yeşil Floresan Protein (GFP) denizanası Aequorea Victoria elde edilen bir biyolüminesans protein, hangi ultraviyole ışık tarafından heyecanlı yeşil ışık yayan32,33. Yıllar içinde, gen ekspresyonu görsel bir belirteç olarak GFP kullanımı Escherichia coli ifade den çok sayıda protein ekspresyonu sistemleri, N. benthamiana bitkiler34dahil olmak üzere genişletilmiş,35,36,37,38. GFP gibi görünür işaretlerin bilimsel kavramların öğretive öğreniminde çok sayıda etkisi vardır. Çok sayıda giriş seviyesi öğrencisi, öğretilen fikrin çıplak gözle görülemediğinde, moleküler biyoloji ve ilgili alanlar gibi bilimsel kavramları kavramanın zorluklarınıanlatırlar 39. GFP gibi görsel belirteçler, böylece bilimsel süreçlerle ilgili bilgilerin işlenmesine katkıda bulunabilir ve öğrencilerin çok sayıda bilimsel kavramı öğrenmede rapor etme deki zorlukları nazına yardımcı olabilir.

GFP genellikle in vivogen ve ekspresyonu belirtmek için bir belirteç olarak kullanılmasına rağmen, asidik koşullar kullanıyorsanız downstream süreçlerinde görselleştirmek zordur. GFP düşük pH40yapısını ve ortaya çıkan floresan korumak değil çünkü bu durum öncelikle. Geçici asidik ortamlar genellikle protein G, protein A ve protein L kromatografisi gibi çeşitli arıtma süreçlerinde gereklidir, genellikle Ab arıtma için kullanılan41,42,43,44. GFP mutantları asidik koşullar altında floresan korumak için kullanılmıştır45,46.

Burada n. benthamiana bitkilerinde rekombinant IgG füzyon proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit bir yöntem açıklıyoruz. İnsanlaştırılmış bir IgG ağır zincirinin N-terminusuna kaynaşmış geleneksel GFP ürettik ve gfp-igg füzyonu yarattık. Aynı anda, insanlaşmış bir IgG ağır zincirinin N-terminus'una asit-kararlı GFP (asGFP) için bitki kodonu optimize edilmiş bir dizinin füzyonu geliştirdik ve bir asGFP-IgG füzyonu oluşturduk. GFP-IgG üretmenin avantajları arasında ifade sırasında hedef proteinin varlığını görselleştirme yeteneği yer alırken, asGFP-IgG sadece ifade ve ekstraksiyon adımlarında değil, aynı zamanda proteinin saflaştırma adımlarında rekombinant proteinin varlığını da görmenizi sağlar. Bu protokol, N. benthamiana'da üretilen ve düşük pH gerektiren kromatografi teknikleri kullanılarak saflaştırılan bir dizi GFP füzyon proteininin üretimi, saflaştırılması ve görselleştirilmesi için uyarlanabilir. Süreç aynı zamanda yaprak malzeme çeşitli miktarlarda uyarlanmış olabilir. GFP veya asGFP ile etiketlenmiş Abs ve füzyon proteinleri tedaviler için kullanılmak üzere tasarlanmasa da, bu yöntemler deneyler sırasında kontrol olarak yararlı olabilir ve aynı zamanda moleküler ve hücresel biyoloji ve biyoteknoloji için hem bizzat hem de sanal olarak bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. N. benthamiana bitkileri yetiştirmek

  1. Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve daha önce haşlanmış dökün, hala sıcak (~ 40-45 °C), tam genişleme için turba pelet üzerinde su. Peletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde 2-3 N. benthamiana tohumları yerleştirin.
  2. Tepsinin altını kaplayacak şekilde yaklaşık 0,5 su dökün. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketleyin. Fideleri her gün uygun miktarda gübre ile sulamaya devam edin. Gübre (suda çözünen çok amaçlı bitki gıda) konsantrasyonu genellikle 2.5-2.8 g/L'dir.
  3. Büyüme odasına yerleştirildiğinde tepsiyi bir humidome üst ile kaplayın. Tohumlu turba peletlerini 16 saat fotoperiod ve %60 bağıl nem oranıyla 23-25 °C'de büyüme odasında tutun.
  4. Bir hafta sonra, sadece bir fide ile her pelet bırakarak ekstra bitkiler kaldırın.
  5. Bitkiler 2-3 haftalık olduğunda, her bir turba peletnem kontrol toprak içeren ayrı bir pota aktarın. Bu gösteride Miracle-Gro nem kontrol çömlekçilik toprağı kullanılmıştır.
  6. Günlük 1 g/L gübre ile su. Toprağı asla tamamen kuru bırakmayın. Bitkiler 5-6 haftalıkolduklarında sızmaya hazırdırlar.

2. Sızma için Agrobacterium tumefaciens hazırlanması

NOT: GFP-IgG füzyon yapıları bu yazıda açıklandığı gibi elde edilebilir31. AsGFP geni elde edilmiş ve bu çalışmadan bitki optimize45. Bunsen brülöryanında aşağıdaki adımlar yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için temel aseptik teknikler uygulanmalıdır.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 her yapı için fasulye sarı cüce virüs barındıran EHA105 (asGFP-IgG, GFP-IgG, ışık zinciri) LB agar bir gliserol stok (10 g /L Tryptone, 10 g /L NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g/L agar, 50 μg/mLaac kanami)
  2. 30 °C'lik ayakta kuvözde bir gün büyüyün. Standart koloni ekranı PCR protokolü ile doğrulanması için tek bir koloniyi yalıtın.
  3. Her yapı için doğrulanmış koloni kullanın. Konik tüpü 10 mL LB media (10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g maya özü, 50 g/mL) ile doldurun. Daha sonra 10 μL 100 g/mL kanamisin ekleyin. E. coli kontaminasyonunu önlemek için 10 μL 2,5 g/mL rifampisin ekleyin. Bir gecede 30°C ve 120-150 rpm'de kuluçkaya yatırın.
  4. Ertesi gün, Agrobacterium kültürü OD600 = 0.6-0.9'a yetiştirilirse, sızma için kullanılabilir. Aşırı büyümüşse (OD600 > 1), 1-2 mL antibiyotikle taze LB'ye aktarılmalı ve gerekli OD600'eyetiştirilmelidir. İlk kültürün konsantrasyonuna bağlı olarak, OD600 = 0.6-0.9'a büyümesi iki gün sürebilir.
  5. Bir kez uygun OD600, bir santrifüj kültürleri yerleştirin ve 20 dakika için 4.500 x g santrifüj ile bakteri pelet, oda sıcaklığında (RT).
  6. Her iki örnekten de dekant supernatant, ve sonra son OD almak için 1x infiltrasyon tampon (10 mM 2-(N-morfolino) etanesülfonik asit, 10 mM magnezyum sülfat, koh ile pH 5.5 ayarlanmış her pelet resuspend600 = 0.4. Bu, ilk kültür yoğunluğuna bağlı olarak yaklaşık 15-45 mL infiltrasyon tamponu almalıdır. Her IgG füzyon yapısının eşit hacimli kısmını, her tüpteki yapı başına son OD600 = 0,2'yi elde etmek için ışık zinciri yapısıyla birleştirin.

3. İğnesiz şırınga agroinfiltrasyon

  1. Adım 1 bir düzleştirilmiş ataş ve 5-6 haftalık N. benthamiana bitkiler alın. Ataş'ın keskin kenarını kullanarak, adaxial yüzeyde yaprağın ilk epidermal tabakasında küçük bir delik açın. Sonuna kadar delmekten kaçının.
    NOT: Alt yapraklar infiltrasyon için daha kolay, bitkinin üst yaprakları ise daha zordur. Genellikle, rekombinant proteinlerin ekspresyonu bir bitkinin ortasında bulunan yaprakları en yüksek, ve bu yaprakları da daha az nekrotik olsun.
  2. Adım 2'den hazırlanan Agrobacterium çözeltisi ile 1 mL şırınga, bir iğne bağlı olmadan doldurun. Şırınganın ucuyla önceki adımda yapılan deliği kapatın ve yaprağın arkasından yumuşak karşı basınç uygularken bakterileri yaprağa enjekte etmeye yavaşça bastırın. Çözelti şırıngaya çok fazla basınç uygulamadan enjekte edilirken yaprağın koyulaşmasına dikkat edin.
  3. Yaprak alanının çoğuna en fazla 3-4 kez sızmaya çalışın – aşırı yaprak hasarı protein verimini engelleyebilir. Sızmış bitki yaprağı çoğunlukla alt görünümden karanlık görünür.
    NOT: Bu bakteriyel çözelti yapı başına en az 3-4 bitki için yeterli olmalıdır. Otoklav atmadan önce kalan bakteriyel çözelti.

4. Büyümek ve sızmış N. benthamiana gözlemlemek

  1. Sızmış bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve her gün su almaya devam edin.
  2. İnmiş bölgelerde kloroz ve nekroz için yaprakları gözlemleyin. Uzun ve kısa dalga UV lambası altında GFP floresan (GFP varsa) için bitkileri gözlemleyin.
  3. Gün 4-5 yapraklarında her iki GFP yapıları en yüksek floresan gösterir. Hasat tüm yaprakları 4-5 dpi (gün sonrası infiltrasyon) ve toplam yaprak malzeme tartmak.
  4. Kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de akış aşağı işleme veya depolamak için hemen kullanın.

5. Protein ekstraksiyonu

  1. Kullanmadan önce arabellek ve blender bardaklarını buzda veya 4 °C'de saklayın.
  2. 1 g bitki malzemesi başına 2-3 mL buz gibi ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, hcl ile pH 8) hazırlayın. Ekstraksiyondan hemen önce ekstraksiyon tamponuna stoktan 2 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 50 mM sodyum askorbat ekleyin.
  3. Adım 4'ten bitki dokusunu önceden soğutulmuş blender kabına yerleştirin. Blender kabına ölçülen miktarda soğutulmuş ekstraksiyon tamponu ekleyin (adım 5.2'de belirtildiği gibi). Blender kabını blender'ın üzerine yerleştirin. Parafilm önceden kesilmiş bir levha alın ve blender fincan üstüne streç. Gerektiğinde karışım döngüleri arasında iyice karıştırarak, 20 sn aralıklarla homojenliğe karıştırın.
  4. Harmanlanmış malzemeyi bir kabına aktarın. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve protein çözünürlüğünü artırmak ve katıların yağış sağlamak için 30 dakika boyunca 4 °C'de karıştırın.
  5. Buz üzerinde temiz bir beher üzerinde Miracloth 2 kat yerleştirin ve büyük yaprak enkaz kaldırmak için üzerinden özü dökün. Tüm özü dökülür sonra, artık yaprak ekstresi sıkmak için Miracloth katlayın. Ekstre görünür partiküller olmadan koyu yeşil görünmelidir.
  6. Bu numunenin 50 μL'sini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve daha sonraki analizler için "toplam ekstresi" etiketini etiketlendirin. Özü santrifüj tüplerine aktarın. 20 dk, 4 °C için 16.000 x g bitki ekstresinin geri kalanını santrifüj ve konik bir tüp için supernatant aktarın.
  7. Çözünür ekstresini 50 mL şırınga ve şırınga cam elyaf filtresi (0,75 m) kullanarak filtreleyin.
  8. Santrifüjden sonra bir numunenin 50 μL'sini toplayın, daha sonra analiz için "çözünür ekstresi" etiketini etiketedin.

6. Protein G kolon kromatografisi prosedürü

NOT: Burada açıklanan protokol Pierce Protein G agarose resin kullanılarak yerçekimi akımı kromatografisi içindir. Farklı bir reçin kullanıyorsanız, ayarlamalar için üreticinin talimatlarına bakın. Resenin kurumasına asla izin vermeyin ve tüm sıvının dışarı akmasını önleyin. Gerektiğinde çıkışı yeniden özetleyin.

  1. 20 mL numune tutan bir polipropilen sütun ayarlayın.
  2. Hedef immünglobulin tipine ve rezorine olan yakınlığına bağlı olarak gerekli bulamaç miktarını tahmin edin. Genel olarak, 1,5 mL yatak hacmi ile toplam bulamaç 3 mL Ab birkaç miligram saflaştırma için yeterlidir.
  3. Dikkatlice kapaklı sütuniçine resuspended bulamaç gerekli miktarda dökün. Sütun çıkışını sütunun altındakinden açın ve arabellek gidene kadar boşalmasını bekleyin.
  4. Hemen üzerine yıkama tampon 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 HCl ile) dökün. Drenaj ve bu yıkama adım 2x tekrarlayın.
  5. Filtrelenmiş numuneyi 5. Ab'nin rezorne bağlanmaması ihtimaline karşı akışın geri kalanını kaydedin.
    NOT: Yeni bir sütuna yeniden akış uygulamak genellikle iyi bir verim ile sonuçlanmaz; bu nedenle yeni yaprak malzeme ile başlamak için tavsiye edilir.
  6. Spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için reçiyiyi 10 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. İstenirse, arabellek sütundan geçerken aliquot 50 μL yıkama, hedef Ab'nin bir yıkama tamponuyla dolu olmadığını doğrulamak için sütundan geçer.
  7. PH 8'de 125 μL steril 1 M Tris-HCl ile beş tüp kurun ve etiketlendi. Bu olası yapısal değişiklikleri önlemek için asidik elüs tampon Abs nötralize etmektir. Alternatif olarak, daha az seyreltilmiş numune almak için 30 μL 2 M Tris taban ekleyin.
    DİkKAT: Elüsyon sırasında görselleştirme için UV ışığı kullanılabilir. Bunun elüsiyon süresi boyunca yapılması gerekmez. UV kullanılıyorsa, gözlere ve cilde zarar vermemek için uygun PPE kullandığınızdan emin olun. Uv ışığının elüsyon adımı sırasında kullanılması gerekmez.
  8. Abs'i kolona 5 mL elüsyon tamponu (100 mM glisin, pH 2.5 HCl) uygulayarak ve bir önceki adımdan belirlenen her tüpiçin 1 mL fraksiyon toplayarak elüsyonu saplayın.
  9. 20 mL yıkama tamponu uygulayarak kolonu hemen yeniler, ardından 10 mL yıkama tamponu uygulayın. Resenin asidik bir ortamda uzun süre bırakılmadığından emin olun. Elutions floresan görünmelidir, genellikle en yüksek floresan ikinci elüsiyon görülür ama ekstraksiyon için ekstraksiyon değişebilir.
  10. Depolama için reçini PBS'de %20 etanolün 10 mL'si ile yıkayın ve yarıya kadar boşaltın. Üst, sonra sütunun alt recap ve 4 °C dik tutun.
    NOT: Genellikle protein G recineleri önemli verimlilik kaybı olmadan 10 kata kadar yeniden kullanılabilir. Belirli ayrıntılar için üreticinin yönergelerine bakın.
  11. Elüsyon tamponu boş olarak kullanarak, 280 nm'de emiciliği ölçerek bir spektrofotometre kullanarak Ab konsantrasyonu belirleyin. Eluatları -80 °C'de ve her fraksiyonun 50 μL'lik kısmını daha fazla analiz için ayrı bir tüpe saklayın.

7. GFP-Ig füzyon algılama için SDS-PAGE

  1. SDS-PAGE'i kurmadan önce tüm örnekleri hazırlayın.
    1. 4 μL numune tamponu ekleyin (örnek tamponu 6kat azaltArak: 3,0 mL gliserol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi); (6x non-reducing örnek tampon: 3.0 mL gliserol, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi) için 20 μL her örnek (toplam ekstresi, çözünür ekstresi, akış, yıkama, tüm elution fraksiyonları) analiz için. Tüp kapaklarının güvenli bir şekilde sabitlendirilmesini sağlayın.
    2. Sadece bir kaynar su banyosunda 5 dakika için örnekleri azaltarak tedavi ve sonra buz üzerinde 5 dakika için örnekleri koyun. ~5 s için mikrosantrifüj de spin örnekleri ve jel kuyuları içine toplama sırasına göre her örnek 20 μL yükleyin. Ayrı bir kuyuda 3 μL çift renkli protein merdiveni yükleyin.
  2. SDS-PAGE jelini sabit 100 V'de istenilen protein bandı ayrımına çalıştırın; yaklaşık 1,5 saat sürer. Protein ayrımının bir göstergesi olarak merdiveni izleyin.
  3. GFP floresansını gözlemlemek için jeli UV'nin altında görselleştirin.
  4. İstenirse, her örnekte toplam proteindeğerlendirmek için Coomassie leke ile jel leke. Alternatif olarak, belirli Abs kullanarak hedef protein değerlendirmek için batı leke yapmak.
    NOT: Hem Coomassie boyama ve batı leke standart protokolleri 47 ,48aşağıdaki yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma, rekombinant proteinler üretmek ve aşağı akım süreçleri boyunca görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yöntem göstermektedir. N. benthamiana kullanılarak ve sağlanan protokolü izleyerek, burada açıklanan rekombinant protein üretimi bir haftadan kısa bir sürede sağlanabilir. Bitki ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırmanın genel iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 1B nekroz(Şekil 1B-1) vey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, sütun arıtma amaçlı asidik ortamlara geçici maruz kalma gerektirenler de dahil olmak üzere, N. benthamiana tesislerinde üretilen herhangi bir rekombinant Ab veya rekombinant proteinin görsel doğrulaması için kullanılabilir42,43,44. Ayrıca, farklı ifade sistemlerinde diğer proteinler için ASGFP füzyon deneysel görselleştirme ve eğitim için yararlı bir araç olabilir. Buradaki protokol, istenilen miktarda reko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz video düzenleme için Maria Pia DiPalma teşekkür ederiz. Ayrıca Arizona State Üniversitesi Eğitim Sosyal Yardım ve Öğrenci Hizmetleri Ofisi onların cömert yayın ücreti yardım için teşekkür ederiz. Bu protokol için yapılan araştırmalar Arizona Eyalet Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5 mL şırıngaherhangi birN / A
50 mL şırıngaherhangi birN / A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Blender bardaklıherhangi birN / A
Bromofenol mavisiBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BİYOMEDİKAL219482101
EDTA ( Ethylenedinitrilo)tetraasetik asitSIGMA-ALDRICHE-6760
Etanolherhangi birN/A
GliserolG-BiosciencesBTNM-0037
GlisinSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Hidroklorik asit)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Isıtma bloğuherhangi bir saygın tedarikçiN/A
Jiffy-7 727 w/hole turba peletleriHummert International14237000
KanamisinAltın Biyoteknoloji A.Ş. K-120-100
KCl (Potasyum Klorür)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (Potasyum Fosfat)JTBAKER3248-05
KOH (Potasyum Hidroksit)VWRBDH0262
Magnezyum sülfat heptahidratSIGMA-ALDRICHM2773
MES (2- (N-Morfolino) etansülfonik asit)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Nem kontrolü saksı karışımıMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Sodyum Fosfat)JTBAKER3827-01
NaCl (Sodyum Klorür)Santa Cruz Biyoteknolojisc-203274C
Nicotiana benthamiana tohumları herhangi birsaygın tedarikçiN/A
PMSF (Fenilmetilsülfonil Florür)G-Biosciences786-787
Polipropilen Sütunherhangi birN/A
Precision Plus Protein Çift Renk StandartlarıBio-Rad1610394
Protein G reçinesiThermo Fisher Scientific20399
RifampicinGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (Sodyum Dodesil Sülfat)G-BiosciencesDG093
Sodyum AskorbatSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spektrofotometreherhangi bir saygın tedarikçiN/A
Titan3 0.75 ve mikro; m cam elyaf filtreThermoScientific40725-GM
Kubbeli turba peletleri içintepsi herhangi birN/A
TRIS TabanıJTBAKER4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TriptonSIGMA-ALDRICH17221
UV lambasıherhangi birYok
Suda Çözünür Çok Amaçlı Bitki BesinMucizesi-Gro2000992
Maya özüSIGMA-ALDRICH9182

Kaynaklar

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Geçici EkspresyonGFP FüzyonuProtein SaflaştırmaKolon KromatografisiAgrobacterium İnfiltrasyonuYaprak Dokusu EkstraksiyonuSantrifügasyon SüreciAntikor Kantifikasyonu
Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.