Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

Bağırsak mahzenleri ama villi değil, Matrigel veya BME-R1 matrisinde kültürlendiğinde organoidler oluşturur. Bu organoidler, bağırsak epitel in vivosunda bulunan çeşitli farklılaşmış soyların, ataların ve kök hücrelerin varlığı nedeniyle genellikle "mini bağırsak" olarak adlandırılan kendi kendini organize eden yapılardır. Kriptolardan organoid oluşturma potansiyeli kök hücrelerin varlığına atfedilir¹. Öte yandan bağırsak villi sadece farklılaştırılmış hücrelerden oluşur ve bu nedenle organoid oluşturamaz. Bununla birlikte, mutasyonlar² veya villus epitelinin tahsis edilmesine izin veren durumlar villi^2,3'te kök hücrelere yol açabilir. Villi epitelde saplanma ile sonuçlanan bu kader değişikliği, villus epitelinde de-novo saplanma göstergesi olarak organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için 3D matriste ayırıcı villus epitelinin kaplanmasıyla doğrulanabilir. Bu nedenle, bu prosedürün kritik yönü, mahzen kirlenmesinin olmamasını sağlamaktır.

Smad4^KO:β-catenin^GOF koşullu mutasyonu, villide çoğalma ve kök hücre belirteçlerinin ekspresyumu ile işaretlenen bağırsak epitelinde farklılaşmaya neden olur, ve sonunda ektopik kriptolar olarak adlandırılan villide şifreli benzeri yapıların oluşumu Bu adanmış villi kök hücrelerin varlığı, ektopik mahzenlerdeki kök hücre belirteçlerinin ekspresyözü (in vivo) ve mutant villinin organoidleri oluşturma yeteneği ile belirlendi. en kaplama Matrigel³. Aşağıda belirtilen prosedür, Smad4 KO:β-catenin^GOF mutant farelerinde ayırıcı bağırsakepitelinin sapını doğrulamak için kullanılan metodolojiyi detaylandırır. Villi izole etmek için bu metodolojinin önemli bir özelliği, EDTA şelasyon yönteminin aksine bağırsak lümeninin kazınmasıydı⁴. EDTA şelasyon yönteminin aksine, kazıyarak villi izolasyonu alttaki mezenkimin çoğunu korur ve kazıma basıncını bağlı mahzenler olmadan villi vermek için ayarlamaya izin verir. Kazıma basıncı operatöre özneldir, bu nedenle, şifreli bağlı olmadan villi vermek için en uygun basınç operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Bu prosedürün kritik yönü, Villi'nin BME-R1 matrisinde hem kaplamadan önce hem de sonra mikroskobik incelemesi ile kripto kontaminasyonunun olmamasını sağlamaktır.

Bağırsak villisi, bme-R1 matrisinde kaplamadan önce, varsa gevşek hücrelerden veya mahzenlerden kurtulmak için bağırsak lümenini cam slaytlarla kazınır ve 70 μm filtreye yerleştirilir ve PBS ile yıkanır. Yöntem, kripto kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki kriterlere vurgular: a) villinin en uzun olduğu duodenumun proksimal yarısının villi hasadını sınırlamak, b) villi-verimli sıyrıkların sayısını en aza indirmek, c) Villi içeren filtrenin altı kuyulu bir tabakta bir dizi PBS aracılığıyla yıkanması ve d) BME-R1 matrisinde kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile kripto kontaminasyonunun olmamasını onaylamak. EDTA şelasyonu yerine kazınarak villi izolasyon, villus epitelinden organoid başlatma için^{gerekirse 5},^6,7,8niş sinyallerini sağlayabilecek alttaki mezenkimenin tamamen kaybını önler.

Servikal çıkık ile Tamoksifen ve ötanazi kullanımı da dahil olmak üzere yapılan tüm fare deneyleri, Stevens echnology Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayına sahipti.

1. Fareler

NOT: Smad4^f/füretimi; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 fareleri daha önce^{tanımlanmıştır 3}. Sekiz ila on iki haftalık yetişkin dişi fareler kullanıldı.

1. Smad4 f/f'de Smad4 KO:β-catenin^GOF mutasyonu indükle; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2, art arda dört gün boyunca mısır yağına tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu ile.
2. İlk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra miceby servikal çıkığı feda edin.
3. Fare kürkünün periton boşluğuna girmesini önlemek için karnına% 70 etanol püskürtün.
4. Bağırsağı açığa çıkarmak için karın boşluğunu diseksiyon makası ile açın. Makas ve kümes sapları yardımıyla bağırsağı izole edin.
   NOT: Bağırsak epitelinde β-catenin (Smad4^KO;β-catenin^GOF) fonksiyon mutasyonu kazanımı ile birlikte Smad4'ün eşlik eden^{kaybına Smad4f/f}enjekte ederek ulaşılabilir; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 fareler mısır yağını 0.05 g Tamoxifen / kg vücut ağırlığı ile art arda dört gün boyunca her gün. Bu fareler, ayırıcı villide kök hücre ile ilişkili belirteçleri ifade eden hücrelerin varlığını sağlamak için ilk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra toplanır.

2. Duodenum izolasyonu ve hazırlanması

1. Duodenumun proksimal yarısını parçalara bölün.
2. Işıltı içeriğini temizlemek için duodenumu 10 mL şırıngamda 5 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
3. Duodenumu açılı bir makasla uzunlamasına açın ve duodenumu operatöre bakan duodenumun lümeni ile buz üzerinde 15 cm Petri plakası üzerine düz bir şekilde koyun.

3. Kazıyarak Villi izolasyonu

1. Kazımaya başlamadan önce, 6 kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularından birine 70 μm örgü süzgeç yerleştirin. Tüm kuyuları 4 mL 1x PBS ile doldurun ve 6 kuyu doku kültürü plakasını buza yerleştirin (Şekil 1).
2. Villiyi iki mikroskobik cam slayt kullanarak aşağıdaki gibi kazıyın: biri duodenumu aşağı tutmak ve diğeri kazımak için (Şekil 1B1).
   1. Duodenumun ışıklı tarafını yüzeysel olarak iki kez kazıyın ve mukusu çıkarın. Bu adımın mukus tabakasını kaldıracağı, ancak villiyi kaldırmayacağı şekilde basınç uygulayın.
   2. Duodenumu tekrar kazıyın, 3..1'dekiyle aynı basıncı uygulayarak iki kez dondurun, bu sırada villi slaytlarda toplanırken görülebilir (Şekil 1B2). Bu, villiyi mahzenler bağlı olmadan elde etmek için en uygun basınçtır (operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir).
3. Villiyi (slaytta 3.2.2.adımdan toplanan) 6 kuyulu bir tabağa yerleştirilmiş 70 μm'lik bir ağ süzgecine aktarmak için PBS içeren 1 mL aktarım pipeti kullanın. Villi böylece toplanır, her kazımadan sonra (Şekil 1B2).
4. 70 μm süzgeçte toplanan villiyi (adım 3.3'ten itibaren) süzgeci (villi ile birlikte) soğuk PBS (~ 4 mL / kuyu) içeren 6 kuyulu bir tabakta bir dizi kuyudan geçirerek yıkayın. Bu, varsa gevşek mahzenleri kaldırmaktır.
5. Bir p1000 pipet kullanarak, PBS'deki villi süspansiyonu (~ 3 mL) 70 μm süzgeçten buz üzerinde yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
6. Villi süspansiyonun 50 μL hacmini cam bir kaydırağa aspire etmek için % 0,1 BSA kaplamalı künt uçlu p200 pipet ucu kullanın. PBS süspansiyonundaki villi konsantrasyonunun belirlenmesi için 4x büyütme altındaki 50 μL damlacıktaki villi sayısını sayın. Örneğin, incelenen 50 μL süspansiyonda 10 villi varsa, villi konsantrasyonu 0.2 villi / μL'dir. Bu aynı zamanda bağlı mahzenlerin yokluğunu onaylama zamanıdır.
7. 0,5 villi/μL BME-R1 matrisi konsantrasyonda plakalamak için gereken villi süspansiyonun hacmini hesaplayın. Pipetleme hatasını ve villinin saflığını sağlamak için gereken mikroskobik inceleme için gereken hacmi hesaba katmak için ekstra bir 100 μL ekleyin.
   DİkKAT: Villi'nin salınacağı sonraki sıyrıklarda, villiyi değil, mukusu gideren ilk iki sıyrıkta kullanılan basınç kullanılmalıdır. Villi salınımı ilk gözlendikten sonra to-and-fro kazıma sayısını iki ile sınırlandırın. Bu önlem, villi'nin bağlı mahzenlerle salınmasından kaçınır. Bağlı mahzenlerin yokluğunu sağlamak için villiyi mikroskobik olarak değerlendirmek önemlidir.

4. BME-R1 matrisinde villi kaplaması

1. %0,1 BSA kaplamalı p200 künt uçlu pipet ucu kullanarak, 12,5 μL BME-R1 matrisinde kuyu başına ~ 6 villi yoğunluğunda plakalamak için gereken villi hacmini (adım 3,6'dan itibaren) bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada BSA kaplı künt uç kullanımı, sivri uç için çok büyük olan villinin, ucun kenarlarına sıkışmadan veya kaybolmadan aspire olmasını sağlar.
2. Villiyi 2 dakika boyunca 200 x g'da soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) döndürün ve üst düğmeyi çıkarın.
3. Kalan PBS'leri kaldırmak için 4.2 adımını yineleyin ve laminer akış başlığı altında bir sonraki adıma geçin.
4. Villi peletini buz üzerinde çözülen gerekli miktarda soğuk BME-R1'de hafifçe yeniden depolayın.
5. Bir p20 pipet kullanarak, önceden ısınmış 96 kuyulu U-alt plakada 3D olarak BME-R1 matrisinde villinin plakası 12,5 μL / kuyu.
6. BME-R1 matrisinin katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 15 dakika kuluçkaya yatırın.
7. Önceden ısıtılmış ENR (Epidermal büyüme faktörü/ Noggin / R-spondin1) ortamına 125 μL / kuyu ekleyin: 1x Penisilin ile desteklenmiş gelişmiş DMEM F-12 ortamı: Streptomisin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-asetil sistein ve 0.05 mg/mL Primocin ifade eden HEK293-T hücrelerinden %5 şartlandırılmış ortam.
8. Kaplamalı villiyi % 5 CO₂ile 37 °C'de tutulan bir doku kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve medyayı her gün değiştirin.
9. Villi türevi organoidlerin beklendiği en erken zaman noktası iki gün sonra olduğundan, organoidlerin iki günlük kaplamadan önce göründüğü herhangi bir kuyuyu atın.
   NOT: Villi uzunluğunun yarısı veya yarısından fazla olan herhangi bir villi bir villus olarak sayılır. Kripto türevi organoidlerin aksine, villi türevi organoidlerin kaplamadan sonraki 24 saat içinde beklenmemesi beklenir. Organoid başlatan villi, organoid oluşumundan önce koyulaşıyor ve küçülüyor gibi görünüyor. Bu nedenle, makul kript kontaminasyonundan elde edilmiş olmanın makul olmasını önlemek için, kaplamadan sonraki bir gün içinde gelişen organoidli kuyular atılmalıdır. Koşullandırılmış ortamı üretmek için kullanılan metodoloji istek üzerine kullanılabilir.

İşlemin başarısı için belirleyici faktör, mahzen kirlenmesini önlemektir. Villiden organoid gelişimi (ve herhangi bir kontamine edici mahzenden değil) dört ana kriterin doğrulanmasıyla sağlanır: 1) Villi'yi BME-R1'de kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile hasat edilen villinin saflığını sağlamak, 2) tüm kaplama villilerin tek tek görselleştirilmesine izin vermek için kuyu başına sınırlı sayıda villi kaplamak, 3) organoidin günlük gelişimini sürdürmek; zaman seyrinin görüntüleri villiden organoid gelişimini gösterir (Şekil 3) ve 4) villiden başlatan organoidlerin kinetik ve morfolojik görünümünün onitoring; villiden başlayan organoidler ilk başta düzensiz şekilli görünür ve iyi tanımlanmış kenarlıklara sahip küresel yapılar olarak bir gecede ortaya çıkan mahzen türevi organoidlerin (EDTA/PBS şelasyon yöntemi1,4) kullanılarak şifrelerin izole edilmesiyle kültürlenir) aksine4xbüyütme altında görülebilmesi için iki ila beş gün sürer (Şekil 2).

Villi'nin organoid oluşturan potansiyelini test etmek için fareleri feda etmek için en uygun zaman, villi-epitel ekspres kök hücre belirteçlerinin tahsis edilmesi ve villi in vivo'da ektopik mahzenlerin geliştirilmesine başlanmasıdır (Smad4f / f'ninTamoksifen enjeksiyonundan yaklaşık 10 gün sonra; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 fareler). Bu fareler, tamoksifen ile β-catenin aktivasyonu ile birlikte Smad4 kaybına neden olan tamoksifen indükleyen bir cre-recombinaz vardır. Ektopik mahzenler mutasyonun indüksiyonundan sonraki iki hafta içinde tamamen gelişirken, villus epiteldeki kök hücreler in vivomutasyonun indüksiyonundan sonraki bir hafta içinde ortaya çıkar. Matrigel'de kaplandığında organoid oluşturan villi sayısının% 2 ila% 12 arasında değiştiği bildirilmiştir3. Kök hücrelerin bulunduğu zamanlarda villiyi kaplamak için mutant farenin toplanması (krep-rekombinaz indüksiyondan yaklaşık bir hafta sonra) villi türevi organoidlerin ortaya çıkması için gereken süreyi uzatırken, krem indüksiyonunun kontaminasyon riskini artırmasından on gün sonrasına kadar hasatı geciktirir.

Şekil 1: Bağırsak epitelinden deneysel kurulum ve villi kazıma. A) PBS'de boru ve filtre (Fltr) ile PBS dolu şırıngan (syrg). B) Kazıyarak (B1) ve bir filtreye (B2) aktararak Villi izolasyonu. Ok, villi'nin slaytta toplandığını işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Aynı fare bağırsağının ayırıcı villi epiteline karşı, mahzenlerden çıkan organoidlerin görünümündeki ayrım: A) Villus ve mahzenleri gösteren karikatür. B)Kazınarak hazırlanan villinin tüm montajı (PBS olarak) (üst panel) ve EDTA-şelasyon (alt panel) tarafından hazırlanan mahzenler. C) Villi türevi (üst panel) ve BME-R1'deki aynı fare bağırsak epitelinden şifreli (alt panel) organoidler (ölçek çubukları, 500 um). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ayırıcı villiden organoid oluşumunun zaman seyri. İki farklı villiden organoid başlatma gösterilir (kutulu bölgeler orta ve alt panellerde genişler). Organoid oluşturma potansiyeline sahip villi, muhtemelen alttaki mezenkimlerin tutulması nedeniyle yoğun görünür. Villus'tan organoid inisiyonu ikinci günde (katı ok) villilerden birinden (sınırı kırık kutu) belirgindir, diğer villusta (katı sınırlı kutu) organoid dördüncü günde (ok) görünür. Gün 6 panel üst kutu gelişmiş bir villi türevi organoid gösterir. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.