Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

4.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61809

⸱

1 Nisan 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

Bu makalede

Özet

Prosedür, villinin organoid şekillendirme potansiyellerini belirlemek için adanmışlık geçiren fare bağırsak epitelinden izolasyonunu açıklar.

Özet

Organoidlerin bağırsak epitelinden klonojenikliği, buradaki kök hücrelerin varlığına atfedilir. Fare küçük bağırsak epitelleri mahzenlere ve villilere bölünür: kök ve çoğalan hücreler mahzenlerle sınırlıdır, villi epitel ise sadece farklılaştırılmış hücreler içerir. Bu nedenle, normal bağırsak mahzenleri, ancak villi değil, 3D kültürlerde organoidlere yol açabilir. Burada açıklanan prosedür sadece saplılığa yol açan ayırıcılık geçiren villus epitel için geçerlidir. Açıklanan yöntem, Smad4-fonksiyon kaybı:β-catenin fonksiyon kazancı (Smad4KO:β-cateninGOF)koşullu mutant faresini kullanır. Mutasyon, bağırsak villisinin villide kök hücreleri adamasına ve üretmesine neden olur. Adanmışlık geçiren bağırsak villisi, cam slaytlar kullanılarak bağırsaktan kazınır, 70 μm'lik bir süzgeçe yerleştirilir ve organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için BME-R1 matrisinde kaplamadan önce gevşek hücreleri veya mahzenleri filtrelemek için birkaç kez yıkanır. Elde edilen organoidlerin şifrelerden değil, ayırıcı villus bölmesinden geliştirilmesini sağlamak için iki ana kriter kullanılmıştır: 1) 3D matriste kaplamadan önce ve sonra bağlı herhangi bir mahzenin olmamasını sağlamak için izole edilmiş villinin mikroskobik olarak değerlendirilmesi ve 2) villiden organoid gelişiminin seyrini izlemek. Villiden organoid inisiyonu kaplamadan sadece iki ila beş gün sonra gerçekleşir ve düzensiz şekilli görünürken, aynı bağırsak epitelinden elde edilen kripto kökenli organoidler kaplamadan sonraki on altı saat içinde belirgindir ve küresel görünür. Bununla birlikte, yöntemin sınırlaması, oluşan organoid sayısının ve villiden organoid başlatma için gereken sürenin, ayırma dereceine bağlı olarak değişmesidir. Bu nedenle, mutasyonun özgüllüğüne veya adanmışlığa neden olan hakarete bağlı olarak, villi'nin organoid şekillendirme potansiyellerini test etmek için hasat edilebileceği en uygun aşama ampirik olarak belirlenmelidir.

Giriş

Bağırsak mahzenleri ama villi değil, Matrigel veya BME-R1 matrisinde kültürlendiğinde organoidler oluşturur. Bu organoidler, bağırsak epitel in vivosunda bulunan çeşitli farklılaşmış soyların, ataların ve kök hücrelerin varlığı nedeniyle genellikle "mini bağırsak" olarak adlandırılan kendi kendini organize eden yapılardır. Kriptolardan organoid oluşturma potansiyeli kök hücrelerin varlığına atfedilir1. Öte yandan bağırsak villi sadece farklılaştırılmış hücrelerden oluşur ve bu nedenle organoid oluşturamaz. Bununla birlikte, mutasyonlar2 veya villus epitelinin tahsis edilmesine izin veren durumlar villi2,3'te kök hücrelere yol açabilir. Villi epitelde saplanma ile sonuçlanan bu kader değişikliği, villus epitelinde de-novo saplanma göstergesi olarak organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için 3D matriste ayırıcı villus epitelinin kaplanmasıyla doğrulanabilir. Bu nedenle, bu prosedürün kritik yönü, mahzen kirlenmesinin olmamasını sağlamaktır.

Smad4KO:β-cateninGOF koşullu mutasyonu, villide çoğalma ve kök hücre belirteçlerinin ekspresyumu ile işaretlenen bağırsak epitelinde farklılaşmaya neden olur, ve sonunda ektopik kriptolar olarak adlandırılan villide şifreli benzeri yapıların oluşumu Bu adanmış villi kök hücrelerin varlığı, ektopik mahzenlerdeki kök hücre belirteçlerinin ekspresyözü (in vivo) ve mutant villinin organoidleri oluşturma yeteneği ile belirlendi. en kaplama Matrigel3. Aşağıda belirtilen prosedür, Smad4 KO:β-cateninGOF mutant farelerinde ayırıcı bağırsakepitelinin sapını doğrulamak için kullanılan metodolojiyi detaylandırır. Villi izole etmek için bu metodolojinin önemli bir özelliği, EDTA şelasyon yönteminin aksine bağırsak lümeninin kazınmasıydı4. EDTA şelasyon yönteminin aksine, kazıyarak villi izolasyonu alttaki mezenkimin çoğunu korur ve kazıma basıncını bağlı mahzenler olmadan villi vermek için ayarlamaya izin verir. Kazıma basıncı operatöre özneldir, bu nedenle, şifreli bağlı olmadan villi vermek için en uygun basınç operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Bu prosedürün kritik yönü, Villi'nin BME-R1 matrisinde hem kaplamadan önce hem de sonra mikroskobik incelemesi ile kripto kontaminasyonunun olmamasını sağlamaktır.

Bağırsak villisi, bme-R1 matrisinde kaplamadan önce, varsa gevşek hücrelerden veya mahzenlerden kurtulmak için bağırsak lümenini cam slaytlarla kazınır ve 70 μm filtreye yerleştirilir ve PBS ile yıkanır. Yöntem, kripto kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki kriterlere vurgular: a) villinin en uzun olduğu duodenumun proksimal yarısının villi hasadını sınırlamak, b) villi-verimli sıyrıkların sayısını en aza indirmek, c) Villi içeren filtrenin altı kuyulu bir tabakta bir dizi PBS aracılığıyla yıkanması ve d) BME-R1 matrisinde kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile kripto kontaminasyonunun olmamasını onaylamak. EDTA şelasyonu yerine kazınarak villi izolasyon, villus epitelinden organoid başlatma içingerekirse 5,6,7,8niş sinyallerini sağlayabilecek alttaki mezenkimenin tamamen kaybını önler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Servikal çıkık ile Tamoksifen ve ötanazi kullanımı da dahil olmak üzere yapılan tüm fare deneyleri, Stevens echnology Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayına sahipti.

1. Fareler

NOT: Smad4f/füretimi; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 fareleri daha öncetanımlanmıştır 3. Sekiz ila on iki haftalık yetişkin dişi fareler kullanıldı.

  1. Smad4 f/f'de Smad4 KO:β-cateninGOF mutasyonu indükle; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2, art arda dört gün boyunca mısır yağına tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu ile.
  2. İlk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra miceby servikal çıkığı feda edin.
  3. Fare kürkünün periton boşluğuna girmesini önlemek için karnına% 70 etanol püskürtün.
  4. Bağırsağı açığa çıkarmak için karın boşluğunu diseksiyon makası ile açın. Makas ve kümes sapları yardımıyla bağırsağı izole edin.
    NOT: Bağırsak epitelinde β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) fonksiyon mutasyonu kazanımı ile birlikte Smad4'ün eşlik edenkaybına Smad4f/fenjekte ederek ulaşılabilir; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 fareler mısır yağını 0.05 g Tamoxifen / kg vücut ağırlığı ile art arda dört gün boyunca her gün. Bu fareler, ayırıcı villide kök hücre ile ilişkili belirteçleri ifade eden hücrelerin varlığını sağlamak için ilk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra toplanır.

2. Duodenum izolasyonu ve hazırlanması

  1. Duodenumun proksimal yarısını parçalara bölün.
  2. Işıltı içeriğini temizlemek için duodenumu 10 mL şırıngamda 5 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
  3. Duodenumu açılı bir makasla uzunlamasına açın ve duodenumu operatöre bakan duodenumun lümeni ile buz üzerinde 15 cm Petri plakası üzerine düz bir şekilde koyun.

3. Kazıyarak Villi izolasyonu

  1. Kazımaya başlamadan önce, 6 kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularından birine 70 μm örgü süzgeç yerleştirin. Tüm kuyuları 4 mL 1x PBS ile doldurun ve 6 kuyu doku kültürü plakasını buza yerleştirin (Şekil 1).
  2. Villiyi iki mikroskobik cam slayt kullanarak aşağıdaki gibi kazıyın: biri duodenumu aşağı tutmak ve diğeri kazımak için (Şekil 1B1).
    1. Duodenumun ışıklı tarafını yüzeysel olarak iki kez kazıyın ve mukusu çıkarın. Bu adımın mukus tabakasını kaldıracağı, ancak villiyi kaldırmayacağı şekilde basınç uygulayın.
    2. Duodenumu tekrar kazıyın, 3..1'dekiyle aynı basıncı uygulayarak iki kez dondurun, bu sırada villi slaytlarda toplanırken görülebilir (Şekil 1B2). Bu, villiyi mahzenler bağlı olmadan elde etmek için en uygun basınçtır (operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir).
  3. Villiyi (slaytta 3.2.2.adımdan toplanan) 6 kuyulu bir tabağa yerleştirilmiş 70 μm'lik bir ağ süzgecine aktarmak için PBS içeren 1 mL aktarım pipeti kullanın. Villi böylece toplanır, her kazımadan sonra (Şekil 1B2).
  4. 70 μm süzgeçte toplanan villiyi (adım 3.3'ten itibaren) süzgeci (villi ile birlikte) soğuk PBS (~ 4 mL / kuyu) içeren 6 kuyulu bir tabakta bir dizi kuyudan geçirerek yıkayın. Bu, varsa gevşek mahzenleri kaldırmaktır.
  5. Bir p1000 pipet kullanarak, PBS'deki villi süspansiyonu (~ 3 mL) 70 μm süzgeçten buz üzerinde yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
  6. Villi süspansiyonun 50 μL hacmini cam bir kaydırağa aspire etmek için % 0,1 BSA kaplamalı künt uçlu p200 pipet ucu kullanın. PBS süspansiyonundaki villi konsantrasyonunun belirlenmesi için 4x büyütme altındaki 50 μL damlacıktaki villi sayısını sayın. Örneğin, incelenen 50 μL süspansiyonda 10 villi varsa, villi konsantrasyonu 0.2 villi / μL'dir. Bu aynı zamanda bağlı mahzenlerin yokluğunu onaylama zamanıdır.
  7. 0,5 villi/μL BME-R1 matrisi konsantrasyonda plakalamak için gereken villi süspansiyonun hacmini hesaplayın. Pipetleme hatasını ve villinin saflığını sağlamak için gereken mikroskobik inceleme için gereken hacmi hesaba katmak için ekstra bir 100 μL ekleyin.
    DİkKAT: Villi'nin salınacağı sonraki sıyrıklarda, villiyi değil, mukusu gideren ilk iki sıyrıkta kullanılan basınç kullanılmalıdır. Villi salınımı ilk gözlendikten sonra to-and-fro kazıma sayısını iki ile sınırlandırın. Bu önlem, villi'nin bağlı mahzenlerle salınmasından kaçınır. Bağlı mahzenlerin yokluğunu sağlamak için villiyi mikroskobik olarak değerlendirmek önemlidir.

4. BME-R1 matrisinde villi kaplaması

  1. %0,1 BSA kaplamalı p200 künt uçlu pipet ucu kullanarak, 12,5 μL BME-R1 matrisinde kuyu başına ~ 6 villi yoğunluğunda plakalamak için gereken villi hacmini (adım 3,6'dan itibaren) bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada BSA kaplı künt uç kullanımı, sivri uç için çok büyük olan villinin, ucun kenarlarına sıkışmadan veya kaybolmadan aspire olmasını sağlar.
  2. Villiyi 2 dakika boyunca 200 x g'da soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) döndürün ve üst düğmeyi çıkarın.
  3. Kalan PBS'leri kaldırmak için 4.2 adımını yineleyin ve laminer akış başlığı altında bir sonraki adıma geçin.
  4. Villi peletini buz üzerinde çözülen gerekli miktarda soğuk BME-R1'de hafifçe yeniden depolayın.
  5. Bir p20 pipet kullanarak, önceden ısınmış 96 kuyulu U-alt plakada 3D olarak BME-R1 matrisinde villinin plakası 12,5 μL / kuyu.
  6. BME-R1 matrisinin katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  7. Önceden ısıtılmış ENR (Epidermal büyüme faktörü/ Noggin / R-spondin1) ortamına 125 μL / kuyu ekleyin: 1x Penisilin ile desteklenmiş gelişmiş DMEM F-12 ortamı: Streptomisin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-asetil sistein ve 0.05 mg/mL Primocin ifade eden HEK293-T hücrelerinden %5 şartlandırılmış ortam.
  8. Kaplamalı villiyi % 5 CO2ile 37 °C'de tutulan bir doku kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve medyayı her gün değiştirin.
  9. Villi türevi organoidlerin beklendiği en erken zaman noktası iki gün sonra olduğundan, organoidlerin iki günlük kaplamadan önce göründüğü herhangi bir kuyuyu atın.
    NOT: Villi uzunluğunun yarısı veya yarısından fazla olan herhangi bir villi bir villus olarak sayılır. Kripto türevi organoidlerin aksine, villi türevi organoidlerin kaplamadan sonraki 24 saat içinde beklenmemesi beklenir. Organoid başlatan villi, organoid oluşumundan önce koyulaşıyor ve küçülüyor gibi görünüyor. Bu nedenle, makul kript kontaminasyonundan elde edilmiş olmanın makul olmasını önlemek için, kaplamadan sonraki bir gün içinde gelişen organoidli kuyular atılmalıdır. Koşullandırılmış ortamı üretmek için kullanılan metodoloji istek üzerine kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İşlemin başarısı için belirleyici faktör, mahzen kirlenmesini önlemektir. Villiden organoid gelişimi (ve herhangi bir kontamine edici mahzenden değil) dört ana kriterin doğrulanmasıyla sağlanır: 1) Villi'yi BME-R1'de kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile hasat edilen villinin saflığını sağlamak, 2) tüm kaplama villilerin tek tek görselleştirilmesine izin vermek için kuyu başına sınırlı sayıda villi kaplamak, 3) organoidin günlük gelişimini sürdürmek; zaman seyrinin görüntüleri villiden organoid gelişimini gös...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntem, kök hücre belirteçlerini in vivo edinen villi epitelin farklılaşma kapasitesini doğrulayabilir. Normal bağırsak epitelleri, mahzende kök hücrelerin varlığı nedeniyle 3D olarak kültürlendiğinde, vizipten organoidlere yol açabilir, ancak villi bölmesine yol açamaz1. Bu nedenle, 3D kültürlerde kültüre edilen farklılaşmış villi epitelden organoid oluşumu, hücre kaderinin tersine dönmesinden kök hücre oluşumunu doğrular. Mutasyonlardan ve/veya yaralanmadan kaynaklanan bağırsak epite...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu yayın NIH Ulusal Kanser Enstitüsü'nden K22 CA218462-03 ödül numarası ile desteklendi. R-Spondin1'i ifade eden HEK293-T hücreleri Dr. Michael P. Verzi'nin cömert bir hediyesiydi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş DMEM F-12 ortamıGibco12634010
3,3-diaminobenzidinVektör LaboratuvarlarıSK-4105
96 kuyulu U-alt plakaFisher ScientificFB012932
ABC kitiVektörLaboratuvarları  PK4001
Açılı makasFisher Scientific11-999
Hayvansız Rekombinant İnsan EGFPeprotechAF-100-15
B-27 Takviyesi (50X), eksi A vitaminiGibco12587010
Sığır Serumu Albümini (BSA) Proteaz İçermeyen TozFisher ScientificBP9703100
CD44 antikoruBioLegend
Cdx2 antikoruHücre Sinyali12306
Mısır yağıSigma-AldrichC8267-500ML
Corning 70 mikron hücre süzgeciYaşam Bilimleri431751
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Temel Membran Özü, Tip R1R& D3433-005-R1
Diseksiyon makasıFisher Scientific22-079-747
ForsepsFisher Scientific17-456-209
Glutamax (100X)Gibco35050-061
HEK 293-T RSPO-1 eksprese eden hücrelerDr. Michael Verzi'den
HEPES (1M)Gibco15630-080
HistogelThermoscientificHG-4000-012
Ağ filtresiFisher Scientific07-201-431
Mikroskop cam slaytVWR89218-844
N-2 Takviyesi (100X)Gibco17502048
N-asetil sisteinSigma-AldrichA9165
p200 Künt uçlarVWR46620-642
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140-122
Primocin (50mg/mL)Invivogenant-pm-1
Kalite Biyolojik Inc PBS (10X)Fisher Scientific50-146-770
Rekombinant Murin NogginPeprotech250-38
Sinyal seyrelticiHücre Sinyalizasyonu8112L
TamoksifenSigma-AldrichT5648-1G
6 oyuklu doku kültürü plakasıFisher Scientific50-146-770
1030001Hediye

Kaynaklar

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
  3. Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
  4. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
  5. Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
  6. Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
  7. Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
  8. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  9. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
  10. Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
  11. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  12. Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  13. Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
  14. Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
  15. Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
  16. Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
  17. Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
  18. Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
  19. Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757(2013).
  20. Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Organoid OluşumuDediferansiyasyon ProtokolüSmad4 NakavtBeta-katenin Fonksiyon KazanımıVillus Kazıma YöntemiBME-R1 Matris EkimiOrganoid Başlatma ZamanlamasıKript Kontaminasyonundan KaçınmaFenotipik Analiz
Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.