Yöntem makalesi

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

DOI:

10.3791/61812

⸱

25 Ekim 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer hepatositler karaciğer in vitro araştırmalarında , özellikle glukoz metabolizması çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman, işçilik, maliyet ve primer hepatosit kullanımı gibi farklı ihtiyaçlara göre bir baz tekniği uyarlanmış ve çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri sağlanmıştır. Bununla birlikte, primer hepatosit izolasyonundaki sayısız basamak ve zaman alıcı reaktif preparatları, verimlilik için önemli dezavantajlardır. Farklı protokolleri artıları ve eksileri için karşılaştırdıktan sonra, her birinin avantajları birleştirildi ve hızlı ve verimli bir primer hepatosit izolasyon protokolü formüle edildi. Sadece ~ 35 dakika içinde, bu protokol diğer protokoller kadar olmasa da, sağlıklı primer hepatositler üretebilir. Ayrıca, izole primer hepatositler kullanılarak yapılan glukoz metabolizması deneyleri, in vitro karaciğer metabolizması çalışmalarında bu protokolün yararlılığını doğrulamıştır. Ayrıca, gelecekteki araştırmacıların bu protokolü ihtiyaçlara göre daha da optimize edebilmeleri için bu çalışmadaki her adımın önemini ve amacını kapsamlı bir şekilde gözden geçirdik ve analiz ettik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer, gıda sindirimi, kan dolaşımı ve detoksifikasyon gibi yaşamı destekleyen birçok fonksiyonda oynadığı hayati rol nedeniyle omurgalı vücudundaki en önemli organlardan biri olarak hizmet eder. Fare primer hepatosit in vitro kültürünün kullanımı, karbonhidrat metabolizması ve hepatik karsinom çalışmalarında giderek daha popüler hale gelmektedir. Bu nedenle, doğuştan gelen fizyolojik işlevini korurken fare primer hepatosit izolasyonu için uygun bir yöntem geliştirmek önemlidir. Glikoz metabolizmasının merkezi olarak işlevi nedeniyle, karaciğer aynı zamanda glikoz üretimi ve depolanması için de merkezidir1. Primer hepatositlerle yapılan deneyler in vitro olarak çoğu glukoz metabolizması çalışması için bir zorunluluktur. Bu nedenle, yıllarca, çeşitli araştırma grupları fare primer hepatosit izolasyonu için protokoller geliştirmiştir.

Fare hepatosit izolasyonunun genel prosedürü, önce karaciğerdeki kanı fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) gibi izosmotik bir sıvı ile temizlemek ve daha sonra hepatositleri ayırmak için kollajenaz içeren çözelti kullanmaktır. Bu protokoller genel bir prosedürü paylaşır, ancak farklı ihtiyaçlara göre reaktiflerde ve adımlarda farklılık gösterir. Ancak, gerekli reaktiflerin hazırlanması ve izolasyon adımlarının uygulanması zaman alır. Mevcut protokolün geliştirilmesinde verimlilik, kullanıma hazır ve piyasadan temin edilebilen tüm reaktifler ve mümkün olduğunca az adımla bir öncelik olarak belirlenmiştir. Bu protokolün genel amacı, izole edilmiş primer hepatosit saflığını ve canlılığını tehlikeye atmadan, primer hepatositleri fareden izole etmek için hızlı ve emek verimli bir yöntem sağlamaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57BL/6 dişi fareler (8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Hazırlık:

  1. Kültür ortamını yapmak için William'ın E Medium'unu (GlutaMAX Takviyesi)% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile karıştırın.
  2. Partikül kalıntılarını gidermek için 25 mL kollajenaz-dispaz ortamını (örneğin, Karaciğer Sindirim Ortamı) 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden filtreleyin.
  3. Sıcak 50 mL çift damıtılmış H 2 O (ddH2O), 35mL perfüzyon Ortamı (örneğin, Karaciğer Perfüzyon Ortamı) (veya bu protokolü ilk kez kullanarak 50 mL) ve 30 dakika boyunca 45 ° C'lik bir su banyosunda 25 mL filtrelenmiş kollajenaz-dispase ortam.
  4. Steril bir doku kültürü davlumbazında, 20 mL 1x Percoll-HBSS yapmak ve buz veya 4 °C üzerinde tutmak için 50 mL'lik bir tüpte 2 mL 10x HBSS ve 18 mL Percoll karıştırın.
    NOT: 1x Percoll-HBSS en az 6 ay boyunca 4 °C'de tutulabilir.
  5. Steril bir doku kültürü davlumbazının içinde, temiz bir Petri kabına 30 mL yıkama ortamı (örneğin, Hepatosit Yıkama Ortamı) dökün ve buz üzerinde tutun.
  6. Pompalama borusunu 45 °C'lik bir su banyosunun suyuna batırın. Oda sıcaklığı 25 °C'de ise sonuçlar en güvenilirdir.
  7. 225 μL Ketamin HCL, 93.75 μL Ksilazin ve 1681 μL 1x PBS karıştırarak 2 mL 1x anestezik hazırlayın.
  8. Onaylanmış bir yöntem kullanarak bir fareyi uyuşturun. Burada fareye intraperitoneal olarak 150 μL 1x anestezik enjekte edildi. Tam anesteziyi sağlamak için ayak parmağı sıkışmasına reaksiyon gibi refleks kaybı testlerini gerçekleştirin.
  9. Fareyi sırt üstü diseksiyon pedine dört uzuvla, iğneleyerek veya su geçirmez bant veya kurumun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (veya eşdeğerleri) tarafından onaylanan diğer yöntemleri kullanarak sabitleyin.
  10. Diseksiyon için sterilize forseps ve makas hazırlayın. Olası kontaminasyonu önlemek için, tüm adımları steril bir başlık içinde uygulayın.

2. Prosedür:

  1. Peristaltik bir pompa kullanarak, ısıtılmış ddH2O'yu 5 dakika boyunca 4 mL/dak hızla pompalamaya başlayın. Pompalama tüpünü sudan ısıtılmış bir perfüzyon ortamına değiştirin.
  2. Anestezi uygulanan farenin karnını% 70 EtOH ile dezenfekte edin ve karaciğeri, portal veni ve inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarmak için bir makasla açın.
  3. Peristaltik pompayı durdurun. IVC'ye 24 G'lik bir kateter (örneğin, Kapalı IV Kateter, 24 G, 0,75 IN) yerleştirin. Pompalamaya başlayın ve portal damarı açın.
  4. Yıkanan sıvı temizlenene kadar pompalamaya devam edin (yaklaşık 3-5 dakika). Sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Hava kabarcıklarının IVC'ye girmesine izin vermemeye dikkat edin.
    NOT: Bu adım, karaciğerden mümkün olduğunca fazla kan akıtmaktır.
  5. Pompalama tüpünü perfüzyon ortamından kollajenaz-dispase ortamına değiştirin. Adım 2.6 yapılırken kollajenaz-dispase ortamın 25 mL'sinin tamamı tükenene kadar pompalamaya devam edin.
  6. Sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın.
    NOT: Bu aşamada, tamamen kan kaybı fare için ölümcüldür. Farenin ölümü, deneyden sonra kalp atışı eksikliği ile doğrulanabilir. Karkası tesis politikalarına göre bertaraf edin.
  7. Tüm karaciğeri safra kesesi olmadan buz üzerindeki Petri kabındaki 30 mL yıkama ortamına izole edin.
  8. Primer hepatositleri çözeltiye bırakmak için forseps ile parçalara ayırın. Bu adım, yıkama ortamını salınan birincil hepatositler ve küçük karaciğer parçaları ile dolu bulutlu bir çözeltiye dönüştürecektir.
  9. Bulutlu çözeltiyi adım 2,8'de 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerindeki 50 mL'lik bir tüpte 20 mL 1x Percoll-HBSS'ye filtreleyin. Tüpü 20 kez ters çevirerek karıştırın.
  10. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
  11. Doku kültürü davlumbazının içinde, süpernatanı aspire edin. Peleti soğuk 30 mL yıkama ortamı ile yıkayın.
  12. 4 °C'de 5 dakika boyunca 50 x g'de santrifüj.
  13. Süpernatantı çıkarın ve peleti, doku kültürü davlumbazındaki kültür ortamının (veya uygun diğer hacimlerin) 25 mL'sinde yeniden askıya alın.
  14. Hücre numarasını sayın ve istenen kültür plakalarındaki hücreleri deneysel tasarıma göre plakalayın.
    NOT: 8 haftalık bir fareden uygun şekilde izole edilen birincil hepatositler genellikle dört adet 6 delikli plaka veya dört adet 12 delikli plaka üzerine kaplanmak için yeterlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkinliği test etmek için, mevcut primer hepatosit izolasyon protokolü 8 haftalık dişi C57BL/6 farelerde uygulandı. İzole primer hepatositlerin ataşmanı ve saflığı test edildi. Primer hepatosit izolasyonu, hepatik ilaç etkileri ve glukoz metabolizması, farmasötik biyobelirteç aktivitesi2, insülin duyarlılığı ve glikoz üretimi gibi karaciğer fizyolojisi üzerine çok çeşitli deneyler için kullanılır. Bu nedenle, bu protokolle izole edilen primer hepatositlerin aktiviteleri aşağıdaki deneylerde test e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri geliştirilmiştir. Ayrıca farklı ihtiyaçlara göre optimize edilmiş ve uyarlanmıştır (Tablo 1). İzolasyon protokolleri genellikle iki bölümden oluşur: perfüzyon (enzim sindirimi dahil) ve saflaştırma.

Perfüzyon tüm karaciğer in vivo 2,20,21,22,23 veya disseke karaciğer lobları

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12 oyuklu PlakaFALCON353043Kaplama gerekli değildir
6 oyuklu PlakaFALCON353046Kaplama gerekli değil
Anti-AKTHücre Sinyali2920S
Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100x), StabilizeSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Hücre Sinyali97635S
anti-GAPDHHücre Sinyali2118S
anti-p-AKT (S473)Hücre Sinyali9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Hücre Sinyali84192S
Hücre Süzgeci, 70 &mikro; mCELLTREAT229483
Kapalı IV Kateter, 24 Gauge 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, glikoz yok, glutamin yok, fenol yok kırmızıThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glikoz Test KitiBiyotahlil SistemleriEBGL-100
Fetal Sığır Serumu (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlukagonSigma-AldrichG2044
Keçi Anti-fare IgG İkincil AntikorLI-COR926-68070
Keçi Anti-tavşan IgG İkincil AntikorLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad YazılımıNA
Hepatosit Yıkama OrtamıGibco17704-024
IBMXHücre Sinyalizasyonu13630S
İnsülinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamin HCL (100 mg / mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutaminGibco25030081
Karaciğer Sindirim OrtamıGibco17703-03450 mL'lik tüpte her biri 25 mL'ye kadar doku kültürü başlığı içinde alikot ve -20 °C'de tutun; C dondurucu
Karaciğer Perfüzyon OrtamıGibco17701-038
Kalem StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Peristaltik PompaGilsonMinipuls 24 mL/dk'da pompalama kabiliyeti
Petri KabıFisherbrand08-757-12
Soğutmalı SantrifüjSorvallLegend RT50 mL'lik tüpü 4 ° C'de santrifüjleyebilir; C
Sodyum L-LaktatSigma-AldrichL7022
Sodyum PiruvatGibco11360070
Şırınga Filtresi, PVDF 0.45 ve mikro; m 30mm çaplıCELLTREAT229745
Şırınga, 0.5 mLBecton Dickinson329461
Şırınga, 60 mLBecton Dickinson309653
Tripan Mavi Solüsyonu, %0.4Gibco15250061
Tüpü, 15 mLCorning430052
Tüpü, 50 mLCorning430290
Su Banyo TankıCorningCLS6783Veya 45 dereceye kadar ısıtma yapabilen herhangi bir su banyosu tankı; C
William' s E Orta (GlutaMAX Takviyesi)Gibco32551020
Ksilozin (100 mg / mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

İlgili makaleler