Method Article

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer hepatositler karaciğer in vitro araştırmalarında , özellikle glukoz metabolizması çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman, işçilik, maliyet ve primer hepatosit kullanımı gibi farklı ihtiyaçlara göre bir baz tekniği uyarlanmış ve çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri sağlanmıştır. Bununla birlikte, primer hepatosit izolasyonundaki sayısız basamak ve zaman alıcı reaktif preparatları, verimlilik için önemli dezavantajlardır. Farklı protokolleri artıları ve eksileri için karşılaştırdıktan sonra, her birinin avantajları birleştirildi ve hızlı ve verimli bir primer hepatosit izolasyon protokolü formüle edildi. Sadece ~ 35 dakika içinde, bu protokol diğer protokoller kadar olmasa da, sağlıklı primer hepatositler üretebilir. Ayrıca, izole primer hepatositler kullanılarak yapılan glukoz metabolizması deneyleri, in vitro karaciğer metabolizması çalışmalarında bu protokolün yararlılığını doğrulamıştır. Ayrıca, gelecekteki araştırmacıların bu protokolü ihtiyaçlara göre daha da optimize edebilmeleri için bu çalışmadaki her adımın önemini ve amacını kapsamlı bir şekilde gözden geçirdik ve analiz ettik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer, gıda sindirimi, kan dolaşımı ve detoksifikasyon gibi yaşamı destekleyen birçok fonksiyonda oynadığı hayati rol nedeniyle omurgalı vücudundaki en önemli organlardan biri olarak hizmet eder. Fare primer hepatosit in vitro kültürünün kullanımı, karbonhidrat metabolizması ve hepatik karsinom çalışmalarında giderek daha popüler hale gelmektedir. Bu nedenle, doğuştan gelen fizyolojik işlevini korurken fare primer hepatosit izolasyonu için uygun bir yöntem geliştirmek önemlidir. Glikoz metabolizmasının merkezi olarak işlevi nedeniyle, karaciğer aynı zamanda glikoz üretimi ve depolanması için de merkezidir1. Primer hepatositlerle

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57BL/6 dişi fareler (8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Hazırlık:

  1. Kültür ortamını yapmak için William'ın E Medium'unu (GlutaMAX Takviyesi)% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile karıştırın.
  2. Partikül kalıntılarını gidermek için 25 mL kollajenaz-dispaz ortamını (örneğin, Karaciğer Sindirim Ortamı) 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden filtreleyin.
  3. Sıcak 50 mL çift damıtılmış H 2 O (ddH2O), 35mL perfüzyon Ortamı (örneğin, Karaciğer Perfüzyon Ortamı) (veya bu protokolü ilk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkinliği test etmek için, mevcut primer hepatosit izolasyon protokolü 8 haftalık dişi C57BL/6 farelerde uygulandı. İzole primer hepatositlerin ataşmanı ve saflığı test edildi. Primer hepatosit izolasyonu, hepatik ilaç etkileri ve glukoz metabolizması, farmasötik biyobelirteç aktivitesi2, insülin duyarlılığı ve glikoz üretimi gibi karaciğer fizyolojisi üzerine çok çeşitli deneyler için kullanılır. Bu nedenle, bu protokolle izole edilen primer hepatositlerin aktiviteleri aşağıdaki deneylerde test e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri geliştirilmiştir. Ayrıca farklı ihtiyaçlara göre optimize edilmiş ve uyarlanmıştır (Tablo 1). İzolasyon protokolleri genellikle iki bölümden oluşur: perfüzyon (enzim sindirimi dahil) ve saflaştırma.

Perfüzyon tüm karaciğer in vivo 2,20,21,22,23 veya disseke karaciğer lobları

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12 oyuklu PlakaFALCON353043Kaplama gerekli değildir
6 oyuklu PlakaFALCON353046Kaplama gerekli değil
Anti-AKTHücre Sinyali2920S
Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100x), StabilizeSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Hücre Sinyali97635S
anti-GAPDHHücre Sinyali2118S
anti-p-AKT (S473)Hücre Sinyali9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Hücre Sinyali84192S
Hücre Süzgeci, 70 &mikro; mCELLTREAT229483
Kapalı IV Kateter, 24 Gauge 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, glikoz yok, glutamin yok, fenol yok kırmızıThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glikoz Test KitiBiyotahlil SistemleriEBGL-100
Fetal Sığır Serumu (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlukagonSigma-AldrichG2044
Keçi Anti-fare IgG İkincil AntikorLI-COR926-68070
Keçi Anti-tavşan IgG İkincil AntikorLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad YazılımıNA
Hepatosit Yıkama OrtamıGibco17704-024
IBMXHücre Sinyalizasyonu13630S
İnsülinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamin HCL (100 mg / mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutaminGibco25030081
Karaciğer Sindirim OrtamıGibco17703-03450 mL'lik tüpte her biri 25 mL'ye kadar doku kültürü başlığı içinde alikot ve -20 °C'de tutun; C dondurucu
Karaciğer Perfüzyon OrtamıGibco17701-038
Kalem StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Peristaltik PompaGilsonMinipuls 24 mL/dk'da pompalama kabiliyeti
Petri KabıFisherbrand08-757-12
Soğutmalı SantrifüjSorvallLegend RT50 mL'lik tüpü 4 ° C'de santrifüjleyebilir; C
Sodyum L-LaktatSigma-AldrichL7022
Sodyum PiruvatGibco11360070
Şırınga Filtresi, PVDF 0.45 ve mikro; m 30mm çaplıCELLTREAT229745
Şırınga, 0.5 mLBecton Dickinson329461
Şırınga, 60 mLBecton Dickinson309653
Tripan Mavi Solüsyonu, %0.4Gibco15250061
Tüpü, 15 mLCorning430052
Tüpü, 50 mLCorning430290
Su Banyo TankıCorningCLS6783Veya 45 dereceye kadar ısıtma yapabilen herhangi bir su banyosu tankı; C
William' s E Orta (GlutaMAX Takviyesi)Gibco32551020
Ksilozin (100 mg / mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Related Articles