TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Summary

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

Abstract

Elektron mikroskopisi, hücresel ve yapısal detayların nanometre çözünürlüğünde görüntülenmesi için biyoloji ve tıpta uygulanır. Tarihsel olarak, İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) hücre ultrayapısına dair fikir verdi, ancak son on yılda modern Taramalı Elektron Mikroskoplarının (SEM) gelişimi hücrelerin içine bakış şeklini değiştirdi. Protein düzeyinde yapısal detaylara ihtiyaç duyulduğunda TEM'in çözünürlüğü üstün olsa da organel düzeyinde hücre biyolojisi ile ilgili soruların çoğunluğu için SEM çözünürlüğü yeterlidir. Teknolojideki ilerleme, Seri blok yüz görüntüleme (SBF-SEM) ve Odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM) gibi otomatik hacim alma çözümlerini etkinleştirdi. Bununla birlikte, bugüne kadar, ilgi alanlarına kimlik ve navigasyon çok önemli olduğunda bu yöntemler verimsiz kalmaktadır. Görüntülemeden önce hedef alanların kesin olarak yerelleştirilmesi için araçlar olmadan, operatörlerin ihtiyaç duyduklarından çok daha fazla veri elde etmeleri gerekir (SBF-SEM'de) veya daha da kötüsü, birçok ızgara hazırlamaları ve hepsini (TEM'de) görüntülemeleri gerekir. İlgi alanlarının lokalizasyonunu kolaylaştıran SEM'de Array Tomografi'yi kullanarak "yanal tarama" stratejisini ve ardından toplam örnek hacminin ilgili kısmının otomatik olarak görüntülenmesini öneriyoruz. Dizi tomografi örnekleri görüntüleme sırasında korunur ve tekrarlanan görüntülemeye hazır bölüm kitaplıkları halinde düzenlenebilir. Yanal taramanın, başka herhangi bir yöntemle erişmesi inanılmaz derecede zor olan yapısal ayrıntıları analiz etmemizi sağladığı birkaç örnek gösterilmiştir.

Introduction

EM ile ilgili tekniklerin önemine rağmen, onlara hakim olmak için gereken çaba, tüm alanı az sayıda uzmanla sınırlı tutar. Önemli bir zorluk, EM için korunan örneklerde bir İlgi Alanı'nın (ROI) tanımlanması ve alınmasıdır. Optik mikroskopi ile analiz edildiğinde ve EM gözlemi için işlendikten sonra aynı numunenin görünümü önemli ölçüde farklılık gösterir. Kimyasal olarak hazırlanmış numuneler için yapılan değişiklikler arasında dehidrasyon adımlarından sonra anizotropik numune büzülmesi (her boyutta ~%10) ve fiksasyon ve boyama protokolünde osmium kullanırken floresan kaybı(Şekil 1A)sayılabilir. Ultra ince kesit için, numuneler farklı stratejiler kullanılarak epoksi veya akrilik reçinelere gömülüdür (Şekil 1B). Bu preparatın başarılı sonuçları için, numunenin tamamı 1 mm x 1 mm'yi geçmeyen parçalara kesilmelidir. Standart İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) gözlem koşullarının gereksinimlerini karşılamak için, numunenin bu küçük kısmı 50-150 nm kalınlığında dilimlere daha fazla bölümlenmiştir. Elde eden gri tonlamalı görüntüler, tüm numunenin bir dakikalık kısmının doku organizasyonunu ve organel yapısını diğer mikroskopi tekniklerinden daha ayrıntılı olarak göstermektedir (Şekil 1C). Tipik bir TEM veri kümesi, hücre ve dokularda 3D alanda doğal olarak meydana gelen süreçleri anlamak için teorik olarak tahmin edilen 2D bilgiler sağlar. Şekil 1D, ultrayapısal hacimlerin elde edilmesi zorluğunu ortaya getirmektedir: 50 nm kalınlığında 1.000 μm'lik bir küp kesitlenirse, tüm hacmi kapsayacak şekilde 20.000 bölüm gerekecektir; 500 μm yan küp için 10.000 bölüm olacaktır. 50 μm x 50 μm x 50 μm hacmi kapsayacak şekilde "yalnızca" 1.000 bölüm gerekebilir. Bu hacmi manuel olarak elde etmek neredeyse imkansızdır ve otomasyonla gerçekleştirilmesi son derece zordur. Numune derinliğine ek olarak, bu tür varsayımsal küplerin tüm yüzeyini kaplamamız gerekirse, makul çözünürlükte 1 μm² yüzeyin kapsama alanı ciddi bir lojistik sorun haline gelir (Şekil 1E). Bağlaç yaklaşımları gibi olağanüstü büyük ölçekli projeler için, çok sayıda bölüm çok önemlidir, ancak "sıradan" EM projelerinin çoğu için, gözlem için gereken daha fazla bölüm üretmek önemli bir dezavantaj yaratmaktadır.

3D ultrayapısal bilgi edinmenin çeşitli yöntemleri vardır: seri kesit iletim elektron mikroskopisi (TEM), TEM tomografisi, Dizi Tomografisi (AT), Seri Blok Yüz Görüntüleme Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM) ve Odaklanmış İyon Işın TaramaLı Elektron Mikroskopisi (FIB-SEM). Bu yöntemler arasındaki temel farklar bölümleme stratejisi ve görüntü alımının bölüm oluşturma¹ile birleşip birleşmediğidir. Seri kesit TEM'de, yuva ızgaralarında sıralı bölümler toplanır, TEM görüntüleri bu dizilerden oluşturulur ve², 3^,4,5hizalanır. TEM tomografisinde, bir ızgara üzerinde 150-300 nm bölümler arasında eğim serisi ve seri bölümleme ile birleştiğinde, nispeten küçük hacimler 6 ,^7,8olsa da çok yüksek bir çözünürlük sağlar. AT yaklaşımı, cam kapaklı, silikon gofretler veya özel bir bant gibi nispeten büyük destekte çeşitli manuel ve yarı otomatik bölümler toplama ile fiziksel bölümleme kullanır. Görüntü alımı için, destek SEM'de analiz edilir, çeşitli görüntü alma stratejileri mevcuttur^{9,10,11,12,13,14,15} . SBF-SEM için, reçinebloğu^{16, 17 , 18,19}yüzeyinden oluşturulan SEM görüntüsü ile doğrudan SEM odasının içine yerleştirilmiş elmas bıçaklı bir mini mikrotom kullanılarak fiziksel kesit elde edilir. FIB-SEM için, iyon kaynağı numunenin ince katmanlarını temizler, ardından maruz kalan yüzeyin SEM^20,21tarafından otomatik olarak görüntülenmesini izler. TEM-tomografi ve AT, gerekirse yeniden görüntülenebilen fiziksel bölümler oluştururken, FSBF-SEM ve FIB-SEM görüntülemeden sonra bölümü ortadan kaldırır. Çok ışınlı bir SEM tarafından görüntülenen fiziksel bölümlerin yeni bir kombinasyonu, görüntü alma hızının "darboğaz" sorununu çözen yöntemlerin bir kombinasyonunu sağlar²². Bu tekniklerin her biri EM verilerinin elde edilebilme ve analiz edilebilme biçiminde devrim yaratmıştır ve her yaklaşımın belirli bir araştırma sorusuyla ilgili pratik etkileri vardır.

Hazırlığın doğası ve ultrayapısal boyutların ölçeği göz önüne alındığında, örnek blokta belirli bir hedef yapının nerede bulunduğunu tahmin etmek kolay değildir (Şekil1D,E). Yatırım getirisi yerelleştirmesi için bir çözüm, tüm bloktaki görüntüleri en baştan istenen çözünürlükte kaydetmektir. İlgi çekici yapılar mikroskoptan uzaktayken elde edilen veri hacminde olabilir. Bu stratejiyle ilişkili edinme süresi ve veri işleme sorunludur. Kaydedilen veri miktarını azaltmak istenir, özellikle ROI'ler doku bloğundan çok daha küçükse, yani ilgi çekici nesneler belirli hücre türleriyse (tüm organlar değil). Farklı korelatif ışık ve elektron mikroskopi teknikleri (CLEM), floresan aynı örnek 23 , 24 , 25 ,26 ,^27,28,29içinde hazırlanmadan önce veya sonra korunup lokalize edildiğinde başarılı olabilir. Bununla birlikte, birçok hücresel yapı floresan korelasyon olmadan bile, sadece bilinen ultrayapıya dayanarak tanınabilir. Bu durumlarda, yanal tarama Dizi Tomografisi'nin yatırım getirisi yerelleştirmeye yatırılan çaba ile ultrayapısal bilgi kalitesi arasında bir denge sağladığına inanıyoruz. Bu strateji kullanılarak, gofretteki bir alt bölüm kümesi, yatırım getirisinin boyutuna ve doğasına göre kurulabilen düzenli aralıklarla taranır. ROI'ler bulunduktan sonra, veri toplama, bağlantı bölümünden önce başlayıp sonra biten ve ilgili bilgileri hedeflenen bir şekilde toplayan sürekli bir bölüm serisinde ayarlanır.

AT için çok sayıda bölümde ilgi çekici bölgelerin veya olayların edinimini basitleştiren ve hızlandıran ve daha iyi hizalanmış görüntü hacimleri sağlayan protokoller sunuyoruz. Yanal tarama ve çok hızlı alım, tam olarak hedeflenen bölgelerde çok yüksek çözünürlüğe sahip veriler üretir. Tarif ettiğimiz prosedür, 3D EM veri toplamanın sağladığı gibi çeşitli zorlukları ele almaktadır: numune hazırlama iş akışını temelden değiştirmeden çok çeşitli örneklerle uyumluluk; bölümleme ve SEM alımları için hedeflenen yerelleştirme; kurulum sırasında daha az zaman ve çaba; elde eden birimlerin daha iyi hizalanmasıyla birden fazla bölümdeki bölgelerin görüntülenmesi; ve dikişli mozaik resmin içinde farklı görüntüleri derlemek için pürüzsüz bir dikiş ve hizalama prosedürü. Yayınlanan ve devam eden projelerden aldığımız birkaç örnekle yöntemimizin gücünü göstermeyi seçtik. Bu yaklaşımın, sınırlı EM deneyimine sahip araştırmacılar için bile hedeflenen EM verilerinin üretilmesini ve edinimini önemli ölçüde kolaylaştırabileceğine inanıyoruz.

Protocol

NOT: Örnek hazırlama yöntemleri^14,30^,31başka bir yerde açıklanmıştır ve bu yayında ele alınmaz. Kısacası, gösterilen örnekler glutaraldehit ile kimyasal olarak sabitlenmiş, % 1 OsO₄ile sabitlenmiş, daha sonra gömme reçineye gömülmeden önce% 1 sulu uranil asetat ile tedavi edilmiştir. Alternatif olarak, numuneler yüksek basınçlı dondurma kullanılarak hazırlanabilir, asetonda% 0.1 uranil asetat ile ikame edilebilir ve akrilik reçineye gömülür. Örnek bloklar, numunenin net bir şekilde görülmesine izin veren ve kesit için yönünü kolaylaştıran düz bir gömme yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır (Şekil 1B).

1. Dizi oluşturma prosedürü

1. Katıştırılmış örnek yönlendirme ve kırpma
   1. Dürbün/mikroskobu kullanarak, bloğun yüzeyini jiletle hafifçe çizerek gömülü blok yüzeyindeki yatırım getirisini tanımlayın ve işaretleyin. Bu, numuneyi ultramikrotom içinde yönlendirmeye yardımcı olacak ve kesit yüzeyini azaltacaktır.
   2. Numuneyi ultramikrotom tutucuya kelepçeleyin (Şekil 2A).
   3. Reçineyi numunenin etrafına, önce jiletle (kaba kırpma) kesin ve elmas kırpma aletiyle devam edin (ince kırpma; Şekil 2A). Bloğun üst ve alt yüzeylerinin bıçağın kesici kenarına paralel olduğundan emin olmak için 20° veya 90° kenar eğimli bıçaklar kullanın.
      NOT: Bu adım seri bölümleme ve düz şeritlerin alınması için kritik öneme sahiptir.
   4. Ksilen ve tutkalları 3:1 oranında karıştırın. Bir kürdana bağlı bir kirpikle, bu karışımı kesilmiş bloğun üst ve alt kenarlarına uygulayın. İyice kurumasına izin verin.
2. Dizi montaj desteğini A (örneğin, silikon gofretler) hazırlayın.
   1. Gofret parçasını bir gofret kesme aracı (EMS) kullanarak kesin ve boyutunu proje hedefine ayarlayın. 2 cm x 4 cm hem ışık hem de elektron mikroskopi gözlemleri için uygundur.
   2. Enkazdan kurtulmak için gofretleri damıtılmış suda temizleyin.
   3. Işıma deşarjı/plazma standart ekipman kullanarak yüzeyi temizler. Kesin parametreler kullanılan makineye bağlı olacaktır. Izgaraların deşarjı için parametrelerle başlayın ve zamanı ampirik olarak ayarlayın. Bu adım, bölümler kururken destekteki bölümlerin iyi bir şekilde yayılması için çok önemlidir ve atlanmamalıdır.
3. B montaj desteğini (ör. cam kapaklı)
   1. Multipleks immün etiketleme deneyleri planlıyorsanız, floresan sinyalini daha iyi tespit etmek için örnekleri bir kapak kapağına aktarın. Kapak yapışkanlığını iyileştirmek için, daha önce açıklanan ayrıntılı bir jelatin kaplama prosedürü kullanın⁹.
   2. Slaytları indiyum-kalay-oksit (ITO) veya altın ile buharlaşarak kaplayarak iletkenliği artırın. Hazırlanan kapakları temiz bir ortamda saklayın. Işıma deşarjı örnekleri 1.2.3'te açıklandığı gibi boşaltır.

2. Numunenin bölümlenerek

1. AT bıçak hazırlama
   NOT: Dizileri oluşturmak için, uzun şeritlerin alınmasını kolaylaştırmak için tasarlanmış değiştirilmiş bir bıçak (ATS) kullanın. Büyük desteklerdeki bölümlerin üretimi için tasarlanan Histo-Jumbo bıçakları veya benzeri bıçaklar AT kesitleme için de hizmet edebilir.
   1. İğneyi köpüklü yapışkan bandı kullanarak bıçağın dibine takın ve delin (Şekil 2B). ATS bıçağını ultramikrotom tutucuya 0° olarak yerleştirin. Standart prosedürü kullanarak bıçağın kenarını blok yüzeyine paralel olarak ayarlayın.
   2. Kesilmiş bloğu bıçağın kenarına bölümlenmeye hazır bir pozisyonda getirin.
   3. Gofreti/örtü kapağını bıçak havzasının içine yerleştirin ve bıçak kenarı ile aynı seviyeye kadar suyla doldurun. Bıçağın elmas kenarının düzgün bir şekilde nemlendirmesine izin verin ve gerekirse, bağlı şırınnayı kullanarak suyu çekin (Şekil 2C).
2. Dizi bölümleme ve aktarma
   1. Mikrotomları istenen kesme parametrelerine ayarlayın. ATS bıçağı ile 50-100 nm aralığı ve 0,6-1 mm/s kesme hızı tavsiye edilir. Bölümlemeye başlayın (Şekil 2Di).
   2. Hedeflenen bir z hacmini kapsayacak ve koleksiyonu durduracak uzunlukta bir şerit edinin. Blok boyutuna, dokunun homojenliğine ve reçine türüne bağlı olarak, şerit nispeten düz olacaktır (Şekil 2D-ii). Birçok örnek, yatırılan çabaya ve bıçak türü kullanılmasına rağmen düz kurdele üretmeyecektir.
   3. Son hedefe bağlı olarak, yan yana hizalanmış bir uzun veya birkaç kısa şerit yapın. 2 cm x 4 cm destek, 100 ila 1.000 bölümü rahatça tutabilir. Destek adımındaki şeridin düzenlenmesi, el becerisi ve sabit eller gerektiren bir adımdır. Ancak, bu beceri için öğrenme eğrisi hızla kazanilir.
   4. Kürdan üzerine yapışmış bir kirpiğin temiz, yapışkan olmayan bir ucunu kullanarak şeridi bıçak kenarından ayırın (Şekil 2Diii).
   5. Kirpik kullanarak, şeridi destek ortamının merkezinin üzerine hafifçe taşıyın. Bu noktada, gerekirse bölümlerin gerilmesi için kloroform veya ısıtma kalemi kullanın. Ancak, bu düzenlemenin şerit kırılmasına ve deformasyona neden olabileceğini unutmayın.
   6. Şırıngarı çekerek suyu boşaltmaya başlayın. Daha hassas şeritler veya daha yavaş bir su geri çekilmesi için şırınnayı hortumdan ayırarak suyun damlamasına izin verin. Su seviyesi gofret seviyesine indiğinde, şeridi kontrol edin ve gerekirse şeridi yavaşça merkeze iterek yeniden konumlandırın. Şeritleri gofret yüzeye yerledikten sonra, kalan su havzadan tamamen çekilene kadar boşaltmaya devam edin.
      NOT: Dip su geri çekme ATS bıçağını kullanmıyorsanız, türbülansa neden olmamak için ATS bıçağının yanlarındaki suyu dikkatlice azaltın.
   7. Tamamen kurumaya bırakın, banyonun içindeki destek bölümlerini bırakın. Desteğin hidrofobikliğine ve çevresel nem seviyesine bağlı olarak, su farklı bir hızda buharlaşacaktır (Şekil 2Div). Numunenin yavaşça kurumasına izin vermek, numunedeki tüm kıvrımları azaltmak veya tamamen önlemek için önemlidir.
   8. Kir kirlenmesinden korunmak için kuru numuneyi sıkıca kapalı bir kutuya aktarın ve en az 30 dakika boyunca 60 °C fırına yerleştirin. Gerekirse, genel kontrastı artırmak için ağır metaller kullanarak kesitlere karşı koyma.
   9. İşlemin sonunda, üreticinin talimatlarına uyarak bıçağı dikkatlice temizleyin
      NOT: Bir gofret üzerindeki birden fazla veya seri bölümün (Şekil 2E) bir yuva ızgarası üzerindeki aktarıma kıyasla (Şekil 2F) aktarılması EM hazırlık deneyimini tamamen değiştirir. Bölümlerin tek destekle kesintisiz bölümlenerek toplanması, seri bölümlemede sık karşılaşıldığı bölümleme ve kesit toplama ile ilgili hataların miktarını azaltır. Bir gofret üzerinde toplanan 1000 μm x 500 μm'lik 100 bölüme eşdeğer 33 yuva ızgarasına karşılık gelir (Şekil 2G).

3. Örnek gözlem

NOT: Bu bölümde, ticari olarak kullanılabilen bir yazılım kullanılarak uygulanan iş akışı adımları açıklanmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Doğru dedektörlerle donatılmış herhangi bir SEM'deki herhangi bir görüntü alma yazılımı kullanılabilir, ancak belirli kullanıcı eylemleri farklı olacaktır ve genellikle daha manuel olacaktır.

1. Gofretteki bölüm konumlarını gösteren SEM görüntülerinin genel bir haritasını alın. Yerleşik optik kamera görüntüsü, bölümlerden veya tüm bölümlerden oluşan bir şeridi kapsayan bir SEM görüntü mozaiği tanımlamaya yardımcı olur. Örneğin kamera görüntüsünde fareyle tıklatıp sürükleyerek mozaiği oluşturun ve Otomatik Alım'ı başlatın.
   NOT: Çok kaba görüntüleme ayarları, yani 1-2 μm piksel boyutu ve 1 μs durma süresi yeterlidir. Bu işlem Tamamlayıcı Materyalde (sayfa 2-7) gösterilmiştir.
2. Bölüm Bulucu Otomatik Algılama işlevine sahip bölümleri bulun veya el ile bulun. Bölüm konumları ve anahatlar, görüntü eşleştirmeye göre bu yazılımla otomatik olarak alınır. Bu işlemin çizimi için bkz.
3. Genel bakış görüntülerinin ROI'leri net bir şekilde göstermemesi durumunda, bölümlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntülerini alın. Görüntüleri otomatik olarak oluşturmak ve elde etmek için Bölüm Önizleme işlevini kullanın. Bu işlem Ek Malzeme, sayfa 16-18'de gösterilmiştir. Görüntüleme ayarları, kullanıcının aradığı yatırım getirisinin niteliğine ve boyutuna göre seçilmelidir.
   1. En uygun ayarları bulmak için mikroskop kontrol yazılımında Canlı Görüntüleme'yi etkinleştirin ve tek bir yatırım getirisine gidin. Görüntüler ROI'leri net bir şekilde gösterene kadar görüntüleme ayarlarını değiştirin, ancak görüntü alma aşırı uzun değildir.
4. Görüntüleme bölgelerini tanımlama
   NOT: Birkaç farklı strateji önerilmektedir.
   1. Yalnızca birkaç bölümün görüntülenebilmesi gerekiyorsa, ilgili bölümlere gitmek için şimdiye kadar oluşturulan bölümlerin görüntülerini kullanın ve tüm bölümlere bakmak için elde edilen tüm görüntüleri orijinal göreli konumlarında gösteren Yakınlaştırılabilir Görüntüleyici'yi kullanın. Yüksek çözünürlükte görüntülenmesi gereken bir bölüm bulunduktan sonra, tıklatıp sürükleyerek bir görüntüleme bölgesi oluşturun. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ayarlarını seçin ve ayarları bir şablonda depolayın. Diğer bölümler için bu şablonu yeniden kullanın.
   2. Özellikle küçük veya tespit etmesi zor nadir olayları bulmak için Yanal Tarama yaklaşımını kullanın. Her onuncu bölümde veya şerit başına bir bölümde yüksek çözünürlüklü görüntüleme ayarlarına sahip bir görüntüleme bölgesini el ile oluşturun ve görüntüleri alın. Yazılımdaki yatırım getirisini içeren görüntüleri gözden geçirin ve bölümleri işaretleyin veya not alın.
      1. Yatırım getirisini içeren bölümlerden başlayarak, bölüm kümesinde ileri ve geri gidin ve yapı bölümde hala görünür olduğu sürece aynı göreli konumlarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme bölgeleri oluşturun. Bu, el ile veya sonraki adımlarda açıklanan yordam kullanılarak yapılabilir.
   3. Ondan fazla ardışık bölümde görüntü alın. El kitabı içinde açıklandığı gibi kayıtlı bölüm konumlarının duyarlılığını artırmak için görüntüyü yakınlaştırdıktan sonra Konum İyileştirmeyi Başlat'ı tıklatın. Bunu yapmak görüntü serilerinin konum değişkenliğini azaltır. Prosedür Ek Materyal sayfaları 19-21'de gösterilmiştir ve açıklanmıştır.
   4. Alt tuşunu basılı tutarken görüntüleme bölgesi tanımlamak için herhangi bir bölümü tıklatıp sürükleyin ve fare düğmesi serbest bırakıldığında açılan bağlam menüsünden Döşeme Kümesi Dizisi Oluştur'u seçin. Yazılım daha sonra daha önce bulunan veya işaretlenen tüm bölümlerde aynı göreli konumda görüntüleme bölgeleri oluşturur. Bölüm Yayılma Alanı kaydırıcısıyla görüntülemeyi belirli bir bölüm aralığıyla sınırlamak mümkündür.
      NOT: Bu prosedür herhangi bir sayıda görüntüleme bölgesiyle tekrarlanabilir ve bu nedenle her bölüme tek bir büyük görüntü kaydetmek yerine birçok küçük yüksek çözünürlüklü görüntünün kaydedilmesine izin verir.
   5. Oluşturulduktan sonra, gerektiğinde her görüntü serisinde piksel sayısı, piksel boyutu, döşeme düzeni, piksel yerleşim süresi vb. Görüntüleme serileri oluşturulduktan ve kurulduktan sonra, hepsi bir iş ipucunda listelenir.
5. Otomatik işlevleri yapılandırma ve görüntü almayı başlatma
   1. Önceki adımda açıkladığı yöntemi kullanarak otomatik işlevler için ayrı bir görüntü serisi oluşturun. Görüntü serisini, bölümde yüksek karşıtlık yapıları içeren bir konuma taşıyın.
   2. Görüntü serisini 1024 x 884 piksel olarak ayarlayın ve önceki adımlarda ayarlanan görüntü serisinde kullanılan en yüksek çözünürlüğe karşılık gelen bir piksel boyutu seçin. Otomatik fonksiyonlar listesinde, Otomatik Odaklama ve Otomatik Damgalama.
   3. Alım sırası denetimlerinde Bölüme Göre'yi seçin ve otomatik işlevler görüntüsünün listedeki ilk öğe olduğundan emin olun. İş ipucunun yanındaki Çalıştır düğmesini tıklatarak görüntü alımını başlatın. Bu prosedürler Ek Materyal, sayfa 22-23'te gösterilmiştir.
      NOT: Her bölüme manuel olarak önceden odaklanmak gerekli değildir. Kayıt oturumu sırasında, mikroskop yeni bir bölüme ilerlediği zaman, diğer tüm görüntüler bu bölüme kaydedilmeden önce otomatik işlevler yürütülür.

4. Veri hizalaması ve analizi

1. Veri verme
   1. Verilerin .tif biçimde kaydedildiklerine emin olun, böylece özel bir dışa aktarma işlevine gerek yoktur. Verileri, Katman Ağacı'ndaki katmanlara ve öğelere doğrudan karşılık gelen bir klasör yapısına sıralayın.
   2. Görüntü mozaikleri kaydedildikten sonra, tüm döşemeleri otomatik olarak dikmek için StitchAll işlevini kullanın.
2. Fiji'de yığın hizalama ve kırpma
   NOT. Dizi Tomografi verileriyle çalışmak için birçok yazılım paketi (ücretsiz ve ticari) kullanılabilir. Aşağıdaki adımlar açık kaynaklı program Fiji³² ile gösterilmiştir, çünkü yaygın olarak kullanılabilir ve gerekli tüm işlevleri içerir.
   1. Fiji'ye sanal yığın olarak bir görüntü yığını (veya dikişli görüntüler) içe aktarın.
   2. Kontrast/parlaklık normalleştirilmesi gerekiyorsa, Gelişmiş Karşıtlık 'ıseçin ... işlem menüsünden seçin. Doymuş Pikselleri 0,1 veya daha az olarak ayarlayın ve Tüm Dilimleri İşle 'yi denetleyin.
   3. Eklentiler menüsünden Kayıt | SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması.
   4. Beklenen Dönüşüm açılır menüsünden Rijit veya Affine'i seçin. Aksi takdirde, varsayılan ayarları saklayın. Tamam 'ı tıklatarak hizalamayı başlatın.
      NOT: Verileri Sanal Yığın olarak yüklemek, Fiji'nin herhangi bir boyuttaki yığınları işlemesine izin verir. Hizalamanın çıktısı RAM'de oluşturulur; ancak, bu işlenebilen yığınların en büyük boyutunu sınırlayabilir. Bu durumda, sanal yığın dilimleri kaydedinaynı kayıt algoritmasının klasörden klasöre uygulamasıdır. Kayıt tamamlandıktan sonra, çıktı verilerini sanal yığın olarak yükleyin.
   5. Görüntü yığınını, yalnızca yatırım getirisini içermesi için Kırp'ı tıklatarak kırpın.
   6. Yığını tek bir .tif görüntü veya .tif görüntü serisi olarak kaydedin.
      NOT: Dizi Tomografisinin kritik adımları Şekil 3'te gösterilmiştir.

Results

Aşağıdaki örnekler, önerilen iş akışlarının çok yönlülüğünü göstermeyi amaçlamaktadır. Örnek olay inceleme illüstrasyonları, diğer tekniklerle tatmin edici sonuçlar almakta zorlandığımız projelerdir. Çok sayıda tür örnekle karşılaşabileceğiniz tipik zorlukları göstermek için Drosophila yetişkinini seçtik. Kesit içinde yaklaşık 6 mm uzunluğunda, 500-1000 μm uzunluğundaki bu borulu organ, benzersiz bir işleve ve hücresel bileşime sahip farklı bölgelere ayrılmıştır (Şekil 4A)³³. Kesit yönüne bağlı olarak, bağırsak profilinin boyutları ve bölümdeki görünümü değişir. Enine veya boyuna yönelimli bölümler nispeten büyüktür ve tek bir TEM ızgarası üzerine yalnızca bir çift yerlenebilir (Şekil 2F). Dokunun sadece küçük bir kısmı FIB'de görüntülenebilir ve SBF-SEM için zorluk homojen olmayan örneklere benzer. AT, bu tür numunelerin analizi için verimli bir denge sağlar ve düz gömme yatırım getirisi yerelleştirmesini kolaylaştırır. Seçilen alanın etrafındaki reçine fazlalığının dikkatlice kesilmesi (Şekil 4B) dizilerin ilgili alandan verimli bir şekilde toplanması için önemlidir (Şekil 4C). Yüzlerce bölüm tek bir gofret üzerinde sırayla veya rastgele toplanabilir (Şekil 4D). Araştırma sorusuna bağlı olarak, örnek tarama ve satın alma, rastgele birkaç senaryoya böldüğü farklı bir strateji gerektirecektir. Sunulan farklı senaryoları daha hedefli bir şekilde göstermek için, farklı araştırma projesinden birkaç vaka çalışması seçtik.

Rastgele dağılmış çok sayıda büyük yapının analizi 1-10 μm aralığı (Şekil 4E)
Genellikle, ultrayapısal veriler, standart ve deneysel olarak değiştirilmiş bir durumu karşılaştırarak, çeşitli deneysel yaklaşımlardan ortaya çıkan bir hipotezi doğrulamak için gereklidir. Bu gibi durumlarda, birkaç bölüm genellikle ızgaralarda rastgele toplanır ve ilgi alanlarını yerelleştirmek ve görüntülemek için taranır. Bu taktik genellikle daha az sistematiktir ve az sayıda analiz edilen bölümle sınırlıdır. Belirli bir şeritten onlarca / yüzlerce orta çözünürlüklü bölüme genel bakış kaydetmeyi öneririz (Şekil 4D). 70 nm'lik tipik bölümler için, 200 bölüm yaklaşık 14 μm'ye yayılacak ve bu da yarım saat içinde tamamen veya kısmen tamamlanan çok sayıda hücre içerecektir. İlk adım olarak, şeridin tamamına düşük çözünürlüklü genel bakış kaydedilir ve genel bakış, hazırlık eserlerini (örneğin, katlanır, kir) gösteren bölümlerin atlanmasına yardımcı olur. Daha sonra, alım manuel veya otomatik olarak doğrudan bölümün seçilen kısımlarına veya tek veya mozaik görüntüleme kullanılarak tüm bölüme gerçekleştirilebilir ve ardından dikiş (Şekil 4E). Daha sonra, seçilen alandan görüntüler yüksek çözünürlüklü parametreler kullanılarak elde edilebilir. Örneğin, mitokondri, çekirdek ve mikrovilli böyle istatistiksel olarak geliştirilmiş bir yöntemden yararlanabilir (Şekil 4Ei-iii).

500-1.000 nm aralığında birden fazla küçük, seyrek dağıtılmış yapının analizi (Tamamlayıcı Film 1)
Bu senaryoda, yatırım getirisi yalnızca düşük büyütmeli bir genel bakış taramasında tanımlanamaz ve yüksek çözünürlüklü görüntülere ihtiyaç vardır. Geleneksel TEM örneklerinde, gerekli özellik bulunana kadar bölüme girip çıkan sıkıcı yakınlaştırma gereklidir. Genellikle, birden fazla örnekte birkaç bağımsız konumu görüntülemek, istatistiksel olarak tek bir büyük hacmin üretilmesinden daha önemlidir. Bu gibi durumlarda, manuel satın almanın karmaşıklığı katlanarak büyür. Çeşitli TEM çözümleri otomatik alımlara veya birden fazla ızgaranın taranmasına olanak tanısa da, ızgaranın boyutu ve seri bölümleme zorlukları genellikle yaklaşımı birçok örnek için uyumsuz hale getirir. Benzer durumlarda, ilgi çekici yapıları tanımlamak için yeterli bir çözünürlükte birden fazla bölümde genel bir yatırım getirisinin tam bir orta çözünürlüklü haritasını oluştururuz. Bu yanal tarama adımı sırasında, rastgele yaklaşıldığında ilgi yapısının en azından bir kısmını vurmayı amaçlayan bir seferde birkaç bölüm atlamanız önerilir. Bu büyük ölçüde yapının genel boyutlarına bağlı olacaktır: örneğin, yapının genel boyutu 500 nm ve bölümler 50 nm kalınlığındaysa, üst üste en az dokuz sıralı bölüm büyük olasılıkla ilgi yapısının bir kısmını içerecektir. Bu sayede 6-7 bölümün atlanması birden fazla alanda birçok farklı yapı çeşidinin bulunması açısından verimli olacaktır. Seçilen bölümlerin çözümlenmiş mozaik haritalarının otomatik olarak alınması, bu bölümlerin alındıktan sonra dikkatli bir şekilde taranmasını sağlar. Böyle yüksek çözünürlüklü bir harita elde edildikten sonra, birkaç ROI kırpılabilir veya ROI'lerde ek yerel görüntüleme alanları tanımlamak için kullanılabilir (Tamamlayıcı Film 1). Golgi, centrioles, kavşaklar, mikrotübüller, farklı veziklin türleri bu senaryodan yararlanabilecek yapılara iyi örneklerdir (Ek Film 1).

Büyük örneklerde seyrek dağıtılmış büyük ROI'lerin analizi (Şekil 4F-4H)
Bu senaryo, sorunun yatırım getirisi tanımlamasında değil, yerelleştirilmesinde olduğu sık sık "samanlıkta iğne" olarak tanımlanan nadir olayları içerir. Birçok örnek için korelasyon yaklaşımı geçerli bir seçenek değildir, ancak sık sık yatırım getirisi ortaya çıkan bir ultrayapıya sahiptir ve lokalize edildiğinde yüksek güvenilirlikle tanımlanabilir. Bu numuneler için, orta çözünürlükte onlarca ila yüzlerce bölüme sahip önceden taranmış örneklerden başlayarak çok düzeyli alım uygulamak önemlidir. Burada kullanılan yazılımda, birden fazla bölümden görüntü kümeleri elde etmek için iki farklı strateji vardır: Önizleme görüntülerini daha yüksek çözünürlükte kaydetmek veya uygun ayarlarla bir Dizi Döşeme Seti almak (Şekil 4F). Drosophila bağırsağındaki farklı özel hücre tipleri rastgele dağıtılır (örneğin kök, enteroendokrin hücreler) ve rastgele yönelimde ince bölümlere ayırılır. Yine de, tek bölümlerden veya seri görüntülerin bir koleksiyonu olarak yüksek çözünürlüklü parametreler kullanılarak elde edilen görüntüleri taradıktan sonra görsel olarak ayırt edilebilirler (Şekil 4G). Hizalamadan sonra, yığınlar farklı yazılım çözümleri kullanılarak işlenebilir (Şekil 4H, Tamamlayıcı Film 2).

Senaryo 1: Bağırsak organoidleri (Şekil 5A)
Organoidler, modern yaşam bilimlerinin en son araçlarından biri haline geliyor. Bu fizyolojik 3D kök hücre türevi organ modeli, doku yenileme, ilaçlara yanıt ve rejeneratif tıp da dahil olmak üzere bir dizi in vivo biyolojik işlemin doğru bir çalışmasını mümkün kılar. Yakın zamanda tanıtılan mini bağırsak tüpleri^34, in vivo doku fizyolojisi, hücre tipi kompozisyon ve homeostazı yakından andıran yeni nesil bir organoid teknolojisi açarak hastalık modellemesi, konak mikrop etkileşimi ve ilaç keşfi için geniş perspektifler sağlar. Bununla birlikte, ultrayapısal karakterizasyon gerektiğinde, bu tür büyük dokulardaki farklı hücre tiplerinin rastgele örnekler kullanılarak lokalizasyonu zor olabilir. Ayrıca, değişken "enfeksiyon" tahlillerinde, analizin dokuyu etkileyen farklı gelişim aşamalarını ortaya çıkardığından emin olmak çok önemlidir. Bu tür çalışmalar için, numunenin istatistiksel olarak anlamlı kapsamı merkezidir, ancak geleneksel TEM şebeke içi yaklaşımını kullanarak elde etmek zordur. AT-senaryo 1 bu gibi durumlarda faydalıdır: bir gofret üzerinde birçok sıralı bölüm oluşturulabilir (Şekil 5Aii) ve genel ilgi alanlarını yerelleştirmek için düşük çözünürlüklü parametreler kullanılarak taranabilir (Şekil 5Aiii; oklar). Bu alanlar ileri alım parametreleri kullanılarak daha fazla analiz için hedeflenebilir (Şekil 5Aiv ve Şekil 5Av). İlgili bir yapı algılandığında (genellikle her 100-300 bölümde bir kez 5-10 bölümden oluşan bir küme), ilgi çekici yapıların her birine odaklanmak ve tek görüntüleri manuel olarak elde etmek veya birden fazla bölümde görüntü birimleri elde etmek için otomasyon özelliklerini kullanmak kolaydır.

Senaryo 2: Drosophila pupal notum ( Şekil5B)
Hücre bölünmesinin ve hücre döngüsü boyunca ilerlemeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, çok hücreli organizmalarda hem standart hem de değiştirilmiş süreçleri anlamak için çok önemlidir. Var olan bilgiler genellikle tek hücreli sistemlerden türetilir; ancak, bu çözüm bir dokudaki hücreler arasındaki 3D etkileşimlerin kritik bağlamından yoksundur. Notumun tek hücreli bir monolayer, Drosophila larvasının gelişen sırtı, genel olarak epitel hücreleri ile özellikle hücre bölünmesi arasındaki etkileşim için mükemmel bir modeldir³⁵. Floresan mikroskopi ve genetik manipülasyonların mevcut verilerinin kombinasyonu kullanılarak moleküler ve hücresel etkileşim çalışmaları için kurulmuş bir modeldir. Hücre bölünmesinin son adımı olan abscission, iki bölünen hücre arasındaki son ayrımı garanti eder ve çekimserlik sırasında meydana gelen yapısal değişiklikleri karakterize etmek mitoz anlayışımız için gereklidir. Bununla birlikte, notumdaki mitotik bölünmelerin ultrayapısal düzeyde lokalize etmesi kolay değildir: hücreler, çekimser bölgeye kıyasla nispeten büyüktür (Şekil 5B). Çekimser bölgenin genel büyüklüğü ile kaplanacak bölümün yüzeyi arasındaki oran büyüktür (Şekil 5Bi). TEM veya SBF-SEM yöntemleri³⁶kullanarak çekimser bölgeyi yerelleştirmek mümkün olsa da, görev zahmetlidir. Bu senaryoda, 20-40 bölümün sıçramalarının otomatik orta çözünürlüklü genel bakış görüntüleri, bölünen hücreleri yerelleştirmek için kullanılabilir (Şekil 5Bii). Bu tür hücreler tanımlandığında, bölümler civardaki bölümlerin daha yakından incelenmesi için çapa görevi alır ve daha fazla analiz için çok sayıda bölünen hücre bulunabilir ve seçilebilir. Bu şekilde, çekimser bölge bütünüyle bulunabilir ve görüntülenebilir (Şekil 5Biii). Soruya bağlı olarak, yapının derinliğini kapsayacak şekilde tek bir yüksek çözünürlüklü görüntü veya 3-7 görüntü dizisi toplanabilir (Şekil 5Biv).

Senaryo 3: Fare tanycyte nöronları (Şekil 5C)
Fare, beyin gelişimi için iyi kurulmuş bir model sağlar ve EM de dahil olmak üzere farklı seviyelerde iyi belgelenmiştir. Beyin dokusunu incelemek için farklı otomatik seri blok yüz yöntemleri yoğun olarak kullanılmış olsa da, AT'nin gerekli verileri toplamak için daha iyi adapte edildiği durumlar vardır. Hipotalamus, beynin birden fazla nöronal tip fonksiyon içeren bir parçası olan köklü bir nörobilim modelidir. Hipotalamik tanysitler, üçüncü ventrikülün tabanını kaplayan ependymoglial hücrelerin belirli bir alt kümesini, alışılmadık derecede uzun süreçler (300 μm'ye kadar) ve büyük endfeet (~5 μm)³⁷ile temsil eder. Bu, onları TEM veya FIB yöntemleriyle analiz için sakıncalı hale getirir. Birkaç bağımsız tanycytes yerelleştirilmesi ve analiz edilmesi gerektiğinde görev daha karmaşıktır. Bu görevi kolaylaştırmak için yaklaşımlardan biri, EM için sabitleme ve gömmeden önce floresan haritanın floresan etiketli örneklerden elde edildiği yarı korelatif hedefleme olabilir. Kesitleme, floresan numunesinden elde edilen konumsal bilgiler ve düz gömülü plastik replika birleştirilerek yakalanan alan üzerinde gerçekleştirilir. Bundan sonra, AT senaryo 3 kullanılabilir: tanycyte endfeet kümeleri olan bölgeleri ortaya çıkarmak için üst düzey genel bakış mozaik görüntüleri oluşturulur. Daha sonra, yazılımdaki otomasyon özellikleri, görüntülerin sıralarının tek bir görüntüde veya döşeli modda bir veya birkaç alandan alınmasını ayarlamak için kullanılır. Bu görüntüler, hizalanmış yığınlar olarak ayrı ayrı analiz edilebilir veya bundan sonra işlenebilir.

AT yönteminin gücü, verilerin 2B'den 3D'ye nispeten zahmetsiz "yükseltilmesine" izin sağlar: haritalar birincil alımdan edinilebilir ve hacimler seçilen alandan ve çevresinden elde edilebilir. Elde edilen yığın hizalanabilir ve daha sonra işlenebilir. ROI'leri bulmak için hangi çözünürlük ve görüntü kalitesinin gerekli olduğunu önceden belirlemek önemlidir. Görüntüleme, ROI'leri tanımayı etkinleştirmeli, ancak bu değerin ötesinde olmamalıdır, çünkü edinme süresi piksel sabitleme süresi ve piksel boyutunun ters karesiyle orantılı olarak ölçekler.

Şekil 1: EM numune hazırlama ve hacim kazanımının zorlukları. (A) Floresan ve büzülme kaybı, numune hazırlama sırasında yüksek ağır metal konsantrasyonu ve dehidratasyon nedeniyle olur. (i) LM (ii) altında gözlemlenen bir numunenin şematik çizimi, EM için hazırlanan, tamamen opak hale gelen ve hacminin yaklaşık% 10'unu kaybeden aynı örnek. (B) Numune gömme genellikle epoksi veya akrilik reçineler kullanılarak yapılır. Geleneksel bloklar (i) belirli bir oryantasyon gerektirmeyen homojen örnekler için başarıyla kullanılabilir. Düz bloklar (ii), örneğin homojen olmayan örneklerde veya korelatif mikroskopi prosedürlerinde kesit oluşturmayı amaçlayan hassas bir alan olan mikroskop altında hedeflemek ve yönlendirmek gerektiğinde faydalıdır. (C) Tüm örnek hacmin yalnızca sınırlı bir kısmı tek bir 50 nm bölümde temsil edilir ve genellikle yabancı bir yönde 3D örneğin 2D görüntüsünü sağlar. (D) Hassas hedeflemeye karşı aşırı büyük hacimlerin kaydedilme sorununu göstermek için, 1000, 500 ve 50 μm yüzleri varsayımsal 1000 x 500 x 500 μm örnek (koyu bordo) içerecek şekilde düzenlenmiş üç eşmerkezli küp seçtik. Bu tür varsayımsal örnek küpler 50 nm dilimlerle iyice bölümlenirse, tüm birimi kapsayacak şekilde toplam 20.000, 10.000 ve 1.000 dilim ve buna göre 800 tb, 100 tb ve 100 gb gerekir (görüntüleme çözünürlüğü 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8 bit veri). Bu, EM verilerinin alınmasının yalnızca gerekli minimum hacmi elde etmek için planlanmasındaki önemi göstermektedir. (E) Büyük bir numune yüzey alanını yüksek çözünürlükte kaplamak, büyük hacimdekine benzer bir sorun ortaya çıkarır. Birkaç yüksek çözünürlüklü görüntüyi bire döşemek, böyle bir sorun için yararlı bir çözümdür. Bununla birlikte, 2024 x 1048 çerçevesini kullanarak 1 mm x 1 mm'lik bir yüzeyi 10.000x büyütmede kaplamak için çok sayıda karo gerekir ve bu da dikişi zorlaşabilir. Ayrıca, kesim sırasında bölümler değişken bir şekilde sıkıştırılırsa veya bozulursa, elde edilen veri yığınlarının hizalaması neredeyse imkansız hale gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Büyük destekteki bölüm dizilerinin doğrudan üretimi için iş akışı. (A) Kırpma aracını kullanarak sıkı kırpma için bloklar mikrotom tutucunun içine sabitlenir. Bu adım, bir bloğun paralel taraflarını sağlamaya yardımcı olur ve ayrıca numunenin etrafındaki boş reçineyi azaltır. (B) AT bölümleri alımları için modifiye bıçak. Büyük bir tekne, numune bölümleme sırasında bölümlerin aktarılmasını ve manipülasyonlarını ve destek üzerine aktarılmasını kolaylaştırır. Büyük bir havza bölümlerin manipülasyonu sağlar; boşaltma sistemi, boşaltma adımı sırasında şeritlerin hareketini sınırlar, düz taban desteğin kademeli olarak kurumasını güvenilir hale getirir. (C) Bıçak, havzanın dibine yerleştirilmiş parıltılı bir gofret ile bölümlere hazır ve kenarlara doğru düzleştirilmiş su. Bıçağın yapımı, desteğe müdahale etmeden iğneyi gömülü tutar. (D) Dizi üretimi, mikrotom kesit alanında üst görünüm. (i) İlk bölümlerin birbirine yapışıp düzenli bir kurdele oluşturduğu için elde etmesi genellikle kolaydır. (ii) Şeride daha fazla bölüm eklendiğinde ve uzadığında, şerit kararlılığını kaybeder ve sık sık eğriler. Görüntü alma adımına hazırlık için sırayla dizi parçalarının düzenli tutulması çok önemlidir. (iii) Bir kesit şeridi istenen uzunluğa ulaştığında, kirpik kullanılarak bıçak kenarından dikkatlice ayrılır. (iv) Havzadan su boşaltılır; gofret tamamen hava kuruyana kadar içeride kalır. Bu adım, bölümleri düzleştirmeye ve mikro kıvrımların oluşumunu önlemeye yardımcı olduğu için gereklidir. Gofret, bölümleri desteğe takmak için en az 30 dakika boyunca 60 °C'de fırına yerleştirilir. (E) Aktarılan bölümlerin yer yaptığı örnek gofretler. Düz ve doğru şeritler elde etmek uygun olsa da, gerçek numuneler çoğu durumda bu tür ideal şeritlerin oluşumunu önler. Bununla birlikte, "özensiz" kurdeleler bile çok sayıda vaka için çok bilgilendiricidir ve "temiz" şeridin önemi bölümlerin toplandığı bir araştırma stratejisine bağlı olacaktır. Ölçek çubuğu 1 cm. (F) Seri bölümleri olan örnek yuva ızgaraları. Birçok bölüm bir ızgarada toplandığında bile, tek bir gofret üzerinde toplanabileceklerin küçük bir kısmıdır. Bir ızgaradaki bölümlerin transferinde ustalaşmak için gereken beceri (özellikle yuva ızgarası), elektron mikroskopi numunesi hazırlanmasında ustalaşmak için önemli bir darboğazı temsil ediyordu. Ölçek çubuğu 500 μm. (G) Hangi bölüm toplama yöntemi kullanılırsa kullanılsın, AT yaklaşımının güçlü yönleri, ızgaradaki koleksiyona kıyasla sıralı bölümlerin üretim kolaylığıdır. 1000 μm x 500 μm örnek blok düşünülirse, 2 cm x 4 cm gofrete (i) yaklaşık 100 bölüm sığdırmak sorun olmaz. Yuva ızgarası üzerindeki aynı boyut bölümleri maksimum (ii) olarak yalnızca üç bölüme/ızgaraya sığar. Izgaradaki seri bölümleri toplamanın zorluğundan bahsetmeden, aynı sayıda bölümü kapsayacak şekilde kaç ızgaranın gerekli olabileceğini göstermek için ölçeklendirilmiş bir görüntü sağlıyoruz. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dizi Tomografisi iş akışının kritik adımları. Yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının sahipsiz alımı için iş akışının şeması. Tüm hazırlık adımları otomatiktir (yeşil dişli sembolleri) ve bölüm bölüm manuel olarak herhangi bir işlem yapılmasını gerektirmez. Görüntü yığınları, otomatik sert veya afin hizalama yapabilen herhangi bir görüntü analizi yazılımında hizalanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir gösteri modeli olarak Drosophila yetişkin bağırsak ile üç satın alma senaryosu. (A) farklı renklerle belirlenmiş üç ana bölge ile parçalanmış bir Drosophila midgut çizimi: ön, orta ve arka. (B) Enine kesit için bir bağırsak yönlendirildiği kesilmiş düz blok. Boş reçine miktarının ilgi çekici bölgeyi (beyaz dikdörtgen) içeren dokunun etrafında dikkatlice dengelenmiş olduğunu unutmayın. (C) Enine seri kesitler AT bıçağının havzası içindeki su yüzeyinde yüzüyor. Tüm görüntüler, ters kontrastlı ayna dedektörü kullanılarak İkincil elektron SEM modunda elde edildi. (D) Bir gofret üzerinde enine seri bölümlerin dikişli mozaik görüntüsü. Ölçek çubuğu 1000 μm. (E) Drosophila bağırsağı boyunca kesittir. Ölçek çubuğu 20 μm. Görüntü, 7 x 7 orta sınıf görüntüden oluşan dikişli bir mozaiktir. İçeler - belirli ilgi alanlarının daha yüksek büyütme ve çözünürlük görüntüleri: (ii) çekirdek, (iii) fırça kenarlığı ve (i) mitokondri. Ölçek çubuğu herkes için 5 μm. (F) Bağırsaktan geçen ve gelişmekte olan hücrelerin (kare) yerini hedefleyen enine bir bölümün orta sınıf görüntüsü. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. (G) Panelde bulunan bölümün analizi sırasında yerelleştirilen alana göre toplanan hedeflenen seri bölümler dizisi 10 μm'dir. (H) 3B model, panel G'deki hedeflenen seri alımından elde edilen 50 bölümlük yığın dizisine göre işlenir.

Şekil 5: AT uygulama senaryoları için vaka çalışmaları. (A) Bağırsak organoidinde farklı hücre yapılarının lokalizasyonu. (i) Gömülü silikon mikroçip. Ölçek çubuğu = 200 μm. (ii) Çipin orta kısmından 127 kesitten oluşan dikişli mozaik görüntü. Ölçek çubuğu = 1500 μm (iii) Bağırsak organoidinin bir kısmından tam bir enine bölümün dört düşük çözünürlüklü görüntüsü. Oklar potansiyel ilgi alanına işaret eder. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. (iv) Daha fazla analiz için seçilen düşük çözünürlüklü mikrografilere yönelik farklı ROI'ler. Ölçek çubuğu = 10 μm. (v) Enfekte olmuş ilgi hücresinin yüksek çözünürlüklü görüntüsü. Bitişik bölümlerde aynı bölgenin analizi, gerekirse hedeflenen 3D bilgileri sağlayabilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) Drosophila melanogaster pupal notumda orta gövde lokalizasyonu. (i) Parçalanmış bir Drosophila pupasının şematik görünümü. Koruyucu kütikül (kahverengi) kısmını çıkardıktan sonra diseksiyon (bej) için maruz kalan notum. Siyah çizgi, bölümleme yönünü belirler (ii) Diyagramda sunulan alandan bir kesit. Görüntü, tek bir mozaik panele dikilmiş 3x7 sırayla çekilmiş yüksek çözünürlüklü SEM görüntülerini birleştirir. Siyah dikdörtgen, bölünen bir hücre içeren alanı sınırlar. Ölçek çubuğu 15 μm'dir. (iii) Panel II'den bölme hücresi üzerinde yakınlaştırılmış bir görüntü. Bu büyütme ve çözünürlükte, orta gövde belirgindir (beyaz oklar). Bölünen hücreleri bulmak için tüm bölüm analiz edilir. Yanal tarama adımı sırasında 20-30 bölüm aralıklarında bölümlerin farklı şeritleri arasında sıçrama, çok sayıda bölünen hücre çiftini yerelleştirmeye izin veriyor. Bir bölme hücresi lokalize edildiğinde ölçek çubuğu 5 μm 'dir (iv), paneldeki sarı kareyle sınırlandırılmış orta gövdenin etrafındaki dört bölümden toplanan orta gövdenin sıralı görüntüleri (iii). Ölçek çubuğu 1 μm. (C) Fare hipotalamusunda tanycytes endfeet lokalizasyonudur. (i) Vibratom diliminin floresan görüntüsü. Tanycytes ekspres tdTomato floresan protein (kırmızı). Beyaz bir dikdörtgen ilgi alanını sınırlar. Ölçek çubuğu 500 μm. (ii) EM için hazırlanan aynı vibratom bölümü, panelden (i) floresan bilgilerin dolaylı korelasyonuna bağlı olarak ilgi alanı etrafında dikkatlice kırpılacaktır. Noktalı beyaz çizgi, ultra ince kesit alanını temsil eder. Ölçek çubuğu her iki panel için de 50 μm'dir. (iii) İlgi alanı içinde vibratom diliminden kesit. SEM mozaik görüntüsü 75 dikişli görüntüden oluşmaktadır. Birkaç bölüm yanal tarama ile hedeflenir ve benzer parametrelerle görüntülenir. Bölümler, yatırım getirisini bulmak için "çevrimdışı" olarak analiz edilir - tanycyte endfeet. Siyah dikdörtgen, tanycyte endfeet'i içeren alanı temsil eder. Bu bölüm daha fazla analiz için bir çapa görevi görecektir. Ölçek çubuğu 15 μm'dir. (iv) Bir kan damarını çevreleyen tanycyte endfeet'in yüksek çözünürlüklü, yüksek büyütme görüntüsüdür. Yatırım getirisinin bir bölümdeki ilk yerelleştirilmesinden sonra, z sırası bitişik bölümlerden yukarı akıştan bağlantı bölümüne (panel iii) toplanır. Ölçek çubuğu 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Ultra mikrotomi, kesit toplama ve kesit depolama sırasındaki sorunlar eserlere yol açabilir. (A) Bir gofret üzerinde beyin örneği bölümleri. Boş reçinenin çoğu dokudan ayrılır ve kendi üzerine katlanır (sepya). Kesikli kara kutu, bölümün tamamını içermek için kullanılan bir alanı belirler. Ölçek çubuğu 500 μm. (B ) 50 nm kalınlığında zebra balığı bölümünün yüzeyinde küçük, yerel bir kıvrım. Ölçek çubuğu 1 μm. (C) 70nm fare beyin bölümünün yüzeyinde bıçak işareti. Ölçek çubuğu 5 μm. (D) Gofret yüzeyindeki bir zebra balığı kas bölümünü kısmen kaplayan saç (yıldız işareti). Sarıda, doku analiz için hedeflenmiştir. Pembe olarak, etkilenen bölgenin büyüklüğü için referans olarak kullanılan bir hücre. Ölçek çubuğu 50 μm. (E) Zebra balığı notochord altta kırışıklıklar ile sağ altta (siyah oklar), burada yoğun sinir dokusu (mavi gölgeli) daha yumuşak kas dokusu ve boş reçine (siyah oklar) sınırları. Ölçek çubuğu 10 μm. (F) E'de olduğu gibi 50 görüntü yığınının hacim segmentasyonu, bu bölgenin çoğu bölümde kırışıklıklar gösterdiğini göstermektedir. Kesikli çokgen, G. Scale çubuğunda gösterilen alanı özetler 10 μm. (G) XY F'dekiyle aynı hacim segmentasyonu görünümü, kırışıklıkları bloğun sağ yarısında kısa siyah vuruşlar olarak gösterir. Dokunun kalan kısımlarındaki yığının hizalamasının kırışıklıklardan etkilenmediğini unutmayın. Ölçek çubuğu 5 μm. (H) XZ projeksiyonu G ile aynı bölgenin, 50 bölümün tamamında kırışıklıkları gösteren. Ölçek çubuğu 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 1: Drosophila ön midgut aracılığıyla bir kesitin yüksek çözünürlüklü montaj görüntüsü. Ters SE-MD SEM görüntüsünün mozaik görüntüsü. 352 ayrı görüntü karoları otomatik olarak 5 nm çözünürlükte elde edildi ve kesitin tamamını sunmak için dikildi. Daha fazla ayrıntı için yakınlaştırmak ve aynı görüntüyü kullanarak verilerin kapsamlı bir kapsamını elde etmek mümkündür. Yakınlaştırırken sıkı kavşaklar, mikrotübuli, farklı veziklin türleri olabilir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek film 2: Drosophila bağırsak hücreleri render. Bağırsak hücrelerinin bölündüğü bölgedeki bölümlerin elli hizalanmış mozaik görüntüsü. Hücre kenarlıklarının (mavi, turkuaz ve turuncu) ve çekirdeklerin (beyaz) IMOD işlemesi. Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Malzemeler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Discussion

Elektron mikroskopisi, hücrelerin ve organizmaların ultrayapısına ilişkin fikir verir, bunun için genellikle 3 boyutlu bağlamlarında ilgi çekici yapıları görüntünün istenmesi istenir. Ultrayapısal analiz için çok sayıda EM taktiğine rağmen, hala "altın standart" bir çözüm yoktur. Ana neden, sık sık özel bir yaklaşım gerektiren çok çeşitli numuneler, birçok biyolojik sorudur. Önerilen AT iş akışı, örnek işleme, veri toplama, değerlendirme ve depolama için gereken süreyi en aza indirmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, değiştirilmiş bıçak dizi alımını basitleştirmek için yararlı bir araç sağlar. Gofretlerdeki bölümlerin kompakt düzeni, hem gözlem hem de numunelerin sonraki depolaması için uygundur. Bu düzenleme, şeritten şereğe yatay olarak geçerek ve her birinde yalnızca bir bölümü tarayarak örneklerin "Yanal Taramasını" etkinleştirir ve bir yatırım getirisini yerelleştirmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır. Önerilen veri toplama senaryoları, küçük ve rastgele dağıtılmış alanların hedef alınmasını kolaylaştırır. Bulunduktan sonra, AT/SEM, manuel olarak veya otomatik işlev yardımıyla gerçekleştirilse de, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi tam olarak ilgi hacmiyle sınırlar. Sınırlı hacimler için AT, operatör numunede gezinerek ve görüntüleme bölgelerini tek tek tanımlayarak manuel olarak tamamlanabilir. Yazılımın otomatik modülü, küçük alanların geniş bölümlerde görüntülenmesi için esnek bir görüntü alma stratejisi sağlar. Bu yazılımdaki otomasyon, yüzlerce bölüme büyük yüksek çözünürlüklü görüntüler kaydetmeye izin verir ve SBFI ile benzer hacimlere sahiptir. Tüm bölümlerin genel bakış görüntülerini kaydetmek yatırım getirisi yerelleştirmesini basitleştirir ve mikroskopta harcanan süreyi azaltır. Genel bakışların ve daha yüksek çözünürlüklü Önizlemelerin kaydı sırasında bölümlere zarar veilmediğinden, AT/SEM, diğer ROI'lerin daha fazla verisini toplamak için veya daha yüksek çözünürlükte örneği yeniden kullanır.

Görüntü alma süresi, 3D EM'nin en önemli (ve en pahalı) yönlerinden biridir ve bu nedenle deney tasarımında dikkate alınmalıdır. Geniş alanların görüntülenmesinin küçük alanları görüntülemekten daha uzun sürmesi şaşırtıcı olmasa da, etkiyi az tahmin etmek kolaydır: Seçilen görüntüleme parametrelerine bağlı olarak, her bölümdeki edinme süresi saniyelerden saatlere kadar değişebilir. Kritik görüntüleme parametreleri görüş alanının boyutunu, çözünürlüğü ve çalışma süresini içerir. Piksel başına 10nm hedef çözünürlük ve 1 μs durma süresi varsayarsak, 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm veya 500 μm x500 μm'lik bir alanı görüntülemek 4 saniye, 100 saniye veya 2.500 sn sürer. Tüm görüntüleme işi için gereken süreyi tahmin etmek için bu bölüm başına görüntüleme sürelerini bölüm sayısıyla çarpabiliriz. Bölüm sayısı azsa veya mikroskop takım süresi önemli değilse, bölüm başına uzun görüntüleme süreleri kabul edilebilir.

Ancak, kayıt süresini çoğu durumda bir gecelik iş veya hafta sonu işi ile sınırlamak gerekir. 3D EM'nin dikkate alınması gereken eşit derecede kritik bir yönü, elde edilen görüntü verilerinin miktarı ve yapısıdır. Yukarıda belirtilen görüntüleme alanlarını 100 bölüm halinde kaydetmek sırasıyla 400 mb, 10 gb veya 250 gb görüntü verisi oluşturur; 500 μm x 500 μm görüntüler, her biri 2 GB'den büyük olmanın ek sorununu oluşturur. Veri değerlendirmesi için kullanılan yazılım programlarının çoğu bu boyuttaki görüntüleri açamaz.

Görüntüleme süresini azaltmak için, sonraki veri değerlendirmesi (örneğin, yeniden yapılandırma, izleme) için sinyal-gürültü oranı gereksinimlerini karşılamak ve kayıtları tanımlanmış ROI'lerle sınırlamak için piksel bekleme süresini seçmek önemlidir. Yazılımın AT uzantısı, seri bölümlerdeki küçük alanlarda görüntü alımını kolaylaştırır. Yazılım manuel ve otomatik iş akışlarını ve birçok yarı otomatik varyantı destekler: görüntüleme alanları manuel olarak konumlandırılabilir ve her bölüme odaklanabilir veya kullanıcı otomatik bölüm bulucu ve konum hizalama özelliklerini kullanabilir. Örnek tür veya görüntüleme hedefleri tarafından seçilen ve desteklenen otomasyon düzeyine bağlı olarak, yüzlerce bölümde görüntü alımını ayarlamak için gereken süre tüm bir iş günü (el ile yapılır) veya yalnızca birkaç dakika sürebilir. Prensip olarak, Dizi Tomografisi küçük ROI'ler elde etmeyi diğer 3D EM yöntemlerinden daha zor hale getirir; ardışık bölümlere kesin olmayan bölge yerleşimi, daha geniş alanlar elde edilerek telafi edilmelidir. Örneğin, yatırım getirisi 20 μm x 20 μm boyutlardaysa ve görüntüleme alanlarının kesit-kesit konum değişkenliği 10μm ise, yatırım getirisinin her görüntüde, her bölümde tam olarak yakalandığından emin olmak için 40 μm x 40 μm görüntü elde edilmesi gerekir. Gerçek dünyadaki görüntü konumu değişkenliği, konum hizalaması veya kullanıcının sabrı için yazılım özelliklerinin kullanılabilirliğine veya kalitesine bağlı olarak 100 μm ile 10 μm < arasında değişir. Bu yazılımla, çoğu numunede çok fazla manuel müdahale olmadan 10 μm elde edilebilir.

Her teknik gibi, AT'nin de başarılı veri toplamayı etkileyebilecek birkaç zayıf noktası vardır ve birçoğu diğer bölümleme tabanlı yöntemlere benzer. Boş reçinenin dokuya karşı homojen dağılımının olmaması kavisli veya kırık dizilere neden olabilir. Aşırı durumlarda, bölümler destekten ayrılabilir (Şekil 6A). Kesme işlemi sırasında değişken sıkıştırma veya germe, sonraki bölümlerde değişken bölgelerde numuneyi bozabilecek kıvrımlar oluşturabilir (Şekil 6B). Bıçak izleri, hasarlı bir bıçak kullanılarak toplanan bölümlerin yüzeyinde görünebilir (Şekil 6C). Kesit koşullarındaki farklılıklar zaman zaman kesit sıkıştırma ve kalınlık farklılıklarına neden olabilir. Toz veya kir parçacıkları bir bölüme inebilir ve ilgi alanını kısmen gizleyebilir (Şekil 6D). Kusurlu otomatik kontrast, otomatik odaklama ve otomatik damgalama işlevleri nedeniyle görüntü alma başarısız olabilir. Otomatik olarak oluşturulan görüntüleme alanlarının konumlandırılması değişken olabilir ve tüm bölümlerde yatırım getirisini yakalayamayabilir.

Dikiş ve hizalama aşamasında çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. Mozaik karo alımlarının otomatik dikişi, örneğin numunenin içindeki geniş boş alan nedeniyle başarısız olabilir. 3D'deki köklü bir şekil değişikliği nedeniyle, görüntü yığınlarının kaydedilmesi zor olabilir. Özel olarak geliştirilen programlar (örneğin, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB veya MAPS-AT) yarı otomatik hizalama^{32 , 38,39,40'ı}kolaylaştırabilir. Daha zorlu bölümler, fotoğraf düzenleme yazılımı kullanılarak manuel olarak hizalanabilir. Ne yazık ki, bazı veri kümelerinin doğru hizalaması imkansız olabilir.

Büyük numuneler, ızgaralara uyan TEM seri bölümleri için zorludur; öte yandan, birçok proje FIB/SEM veya SBF-SEM kullanılarak uzun otomatik satın almayı haklı çıkarmaz. AT, bir gofret üzerindeki seri bölümlerin toplanması ve manipülasyonunun yuva ızgaralarından daha basit olduğu sıkıcı bir seri bölüm TEM'e basit bir alternatiftir. Dizilerin toplanmasını kolaylaştırmak için çeşitli stratejiler geliştirildi ve mevcut araç setini genişletme yöntemimizi paylaşıyoruz. Yatırım getirisinin tanımlanmasının zor olduğu durumlarda AT-SEM, 50 ila 500 bölümde organel ölçeğinde çözünürlüğün gerekli olduğu numunelerin verimli bir şekilde taranmasını sağlayarak temel bir avantaj sağlar. Daha büyük birimler için, daha fazla bölüm gerekiyorsa otomatik toplama AT stratejileri verimli bir şekilde toplanabilir. AT örnekleri birden çok kez yeniden görüntülenebilir ve daha önce elde edilen genel bakış görüntülerine dayanarak yüksek çözünürlüklü alanların hedefli görüntülenmesini kolaylaştırır. Burada önerilen AT/SEM tarafından hedeflenen analizin ve azaltılmış aşırı örneklemenin işgücü ve veri depolama gereksinimlerini azalttığına inanıyoruz. Sonuç olarak, bölüm kitaplıkları daha sonra yeniden kullanım ve danışma için toplanabilir ve korunabilir. Hacim alımı için FIB veya SBF-SEM yaklaşımları, yatırım getirisinin blok yüzünde tanımlanması kolay olduğunda veya analiz için büyük 3B hacimlere ihtiyaç duyulduğunda mükemmel bir çözüm sunar. Ancak, fib/SBF-SEM, yüksek çözünürlüklü yığın görüntüsünün tanımlanmış bir yatırım getirisinden hedeflenen bir şekilde toplanması gerektiğinde daha az verimlidir. Sonuç olarak, AT örneklerinin taranmesi ve orta çözünürlüklü genel bakış görüntülerinin kullanılması için önerilen yöntemler, görüntü alımını bölüm dizisinin ilgili bölümleriyle sınırlamaya izin verir. Görüntüleme bölgelerinin hassas bir şekilde hedef alınması, veriye olan süreyi hızlandırır ve veri değerlendirmesini kolaylaştırır.

Özetle, AT/SEM kavramı yeni olmasa da, kullanımı hala esaslarının önereceği kadar yaygın değildir. Genel olarak, diğer mevcut EM yöntemlerine tamamlayıcı bir prosedür sağlar. AT/SEM, en geniş numune hazırlama protokolleri ve görüntüleme iş akışları ile uyumludur ve eşlik eden bir teknik olarak herhangi bir FIB/SEM veya SBF-SEM mikroskopunda yapılabilir. Bu yazıda, diğer yöntemlerle başarıyla ele alınma olasılığı daha düşük olan örneklerden ultrayapısal verilerin kaydedilmek üzere AT'ye odaklandık. Bölümlerin ve önemli ölçüde otomatik satın alma stratejilerinin uygun bir şekilde toplanması için açıklanan prosedürün, yöntemle hiç karşılaşmamış olanlar için ilk denemelerde yardımcı olacağını ve zaten bazı deneyime sahip olanlar için mükemmelleştirmeye yardımcı olacağını umuyoruz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kesme< / güçlü >< / em >
AT kesit bıçağı	Diyatom	DUATS3530	Diyatom Jumbo bıçak
90 derece kırpma için elmas bıçak;	Diatom	DTB90	Diyatom düzeltme 20 derece; Cam bıçak
Pattex kontak yapıştırıcı	Pattex	PCL3C
Silikon gofret	Ted Pella	16015	Direnç: 1-30 Ohm Tip P: (Bor) (1 birincil düz) Pürüzlülük: 2 nm SiO2 yok üst kaplama TTV: = < 20 ve mikro; m Gofret bir tarafı cilalıdır
Ultramikrotom	Leica UC6		Alternatifi: Leica UC7
Gofret parçalama kiti	EMS	7642	EMF, Küçük Numune Satırı, CatNo. 7652
Image acquisition
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternatifler: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
İlişkili İş Akışı ve İlişkili İş Akışı ile SEM için Haritalar 3 Array Tomography	Thermo Fisher Scientific	1135932	Maps, SEM görüntüleme iş akışlarının otomasyonunu sağlar ve CLEM ve navigasyon için 3. taraf verilerinin içe aktarılmasına izin verir.
Image analiz
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira, Array Tomografi verilerinin yeniden yapılandırılması için çeşitli pratik işlevlere sahip bir 3D veri görselleştirme ve analiz yazılımıdır.
Görüntü işleme	Açık kaynak	: Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (Referanslar için metne bakın)