Bir Murine Kuyruk Lenfödem Modeli

Lenfödem, lenfatik disfonksiyondan kaynaklanan ekstremite şişmesidir. Etkilenen uzuv sıvı, yağ ve fibrozis birikimi nedeniyle büyür¹. Lenfödem dünya çapında 250 milyon kişiyi etkiler^2,3,4. Meme kanseri, melanom, jinekolojik/ürolojik tümörler veya sarkomlar gibi katı maligniteler için tedavi gören hastaların %20-40'ında lenfödem^geliştiğitahmin edilmektedir 2^,4,5. Lenfödem morbidite tekrarlayan enfeksiyonlar, ağrı ve deformite içerir⁶. Bu ilerleyici, yaşam boyu süren hastalığın tedavisi yoktur. Mevcut tedaviler variaby etkili^7'dir ve kompresyon, fizyoterapistler tarafından komple dekonjestif tedavi, eksizyonel prosedürler ve damarlı lenf nodu transferi ve lenfovenöz bypass 7 , 8 , 9^,10^,11,12,13,14dahil olmak üzere mikrocerrahi operasyonları içerir. Lenfödem için ideal tedavi henüz keşfedilmedi.

Lenfödem mekanizmasının ve tedavisinin incelenmesi sınırlı olmuştur. Lenfatik yaralanmadan sonra ortalama bir yıl gecikmeli başlangıç vardır^15,16 ve radyasyon ve cerrahi ile iyatrojenik hakaret yaşayan çoğu birey lenfödem^{geliştirmez 4,6,17}. Köpek, koyun ve domuz da dahil olmak üzere büyük hayvan modelleri tanımlanmış olmasına rağmen^18,19,20, fare kuyruk modeli kolaylık, maliyet ve çoğaltma nedeniyle en yaygın olarak uygulanmıştır. Lenfödemi araştırmak için fare modelleri bir kuyruk modeli, difteri-toksin aracılı lenfatik ablasyon ve aksiller veya popliteal lenf nodu diseksiyonu^21,22^,23,24,^25,26içerir. Çoğu kuyruk modeli, kuyruğun tabanına yakın gerçekleştirilen lenfatik kanal kırpmalı bir odak, tam kalınlıkta cilt eksizyonu kullanır²², kuyruk şişmesi ve insan lenfödemi benzeri histolojik özelliklerle sonuçlanır^24,27,28,29. Bununla birlikte, standart murine kuyruk modeli tipik olarak 20 gün gibi kısa bir sürede kendiliğinden çözülür ve periyodik kuyruk nekrozu³⁰eşlik eder. Lenfödem fare kuyruk modeli, sürekli bir lenfödemi 15 haftanın ötesine uzatır, doğrulanmış arteriyel ve venöz açıklığı gösterir ve fonksiyonel lenfatik disfonksiyon değerlendirmesine izin verir.

Lenfödemin bir murine kuyruk modeli, lenfödemi tedavi etmek için yeni terapötiklerin değerlendirilmesini sağlar. Viral vektörlerin aracılık ettiği fare modelinde gen bazlı stratejiler kullanılmıştır^31,32. Lenfömatöz fare kuyruğuna genetik kargo teslimatı için yeni bir doku nanotransfeksiyon teknolojisi (TNT) de kullanıyoruz. TNT, hızlı odaklanmış bir elektrik alanında nanokanelli bir çip kullanarak^doğrudan,transkütan gen iletimini kolaylaştırır³³,^34,35,36. Model, potansiyel gen bazlı terapötiklerin fare kuyruğunun lenfatik yaralanma bölgesine odak gen teslimatına izin vermek için TNT_2.0'ın kullanılmasını içerir³⁵.

Protokol, kurumun hayvan araştırma etik komitesinin yönergelerine uyar. Tüm hayvan deneyleri Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar, yiyecek ve su reklam libitum ile 12 saatlik açık-karanlık bir döngü altında barındırıldı.

1. Fare Kuyruğu Lenfatiklerinin Cerrahi Bozulması

1. Eşit cinsiyet dağılımında sekiz haftalık C57BL/6 fare kullanın.
2. İşlem sırasında %100 oksijende %3-4 izofluran ve ardından %1-3 oranında bakım sedasyonu olan bir indüksiyon odasına genel anestezi altında bir fare yerleştirin.
3. Ağrı kontrolü için 0,5 mg/kg sürekli salınım (SR) buprenorfin subkutan olarak uygulanır.
   NOT: Ameliyat sonrası uygulanan ek analjezik ilaçlar: Carprofen her 24 saat en az 48 saat boyunca ve Bupivacaine bir kez ya kesi yapıldıktan sonra ya da kesiyi kapatmadan önce, cilt kenarlarına damlatılarak uygulanır (4 – 6 saate kadar sürer).
4. Fareyi dorsally yerleştirin ve kuyruğu% 70 izopropil alkolle hazırlayın.
5. İşlemden önce kuyruk çapını bir kaliper kullanarak kuyruğun tabanından 20 mm'den başlayan 5 mm'lik artışlarla ölçün. Bu ölçümler, kesilen koni denklemi³⁷kullanılarak hacmi hesaplamak için kullanılacaktır.
6. Kuyrukta tabandan 20 mm uzaklıkta 3 mm'lik bir çevresel eksizyon işaretleyin.
7. Steril bir cerrahi bıçak (15 beden) ile titiz bir 3 mm tam kalınlıklı cilt eksizyonu gerçekleştirin ve alttaki tüm vaskülatları cerrahi mikroskobik büyütme altında sağlam bırakın. Önce dermisten geçen üstün çevresel işareti (kuyruk tabanından 20 mm) ve ardından ilk kesiye 3 mm distlal olan çevresel tam kalınlıklı bir kesiyi inkünleyin.
   1. İki kesiyi bağlamak için dik tam kalınlıklı dikey kesi yapın. Önde gelen bir kenarı kavramak için dişli ince bir pikap kullanın ve avasküler düzlemin derinliklerinde dermis ve damar adventitiasına yüzeysel olarak dikkatlice parçalamak için mikros makas kullanın.
8. Kuyruğun ucuna 0,1 mL izosulfan mavisi (%1) deri altı proksimal enjekte edin.
9. Cerrahi mikroskop altında lateral kuyruk damarlarına bitişik iki lenfatik kanalı tanımlayın. Lenfatikler izosülfan enjeksiyonu nedeniyle mavi görünecektir. Lenfatikleri düz mikrocerrahi makas kullanarak transekte edin. Makası, yan damar ve lenfatik arasındaki bir düzlemi dikkatlice parçalamak için kullanın. Daha sonra bir makas bıçağının ucunu lenfatik damar ve lateral damar arasına geçirin ve lenfatik damarı transekte etmek için bıçakları kapatın.
10. Kuyruk yarasını steril bir yapışan açık pansumanla giydirin. Enfekte veya kanama olmadığından emin olmak için ameliyat sonrası kesileri günlük olarak kontrol edin ve 2 hafta boyunca yara bakımı sağlayın.
11. Kuyruktan daha fazla yaralanmayı önlemek ve hayvanların birbirlerini ısırmasını önlemek için hayvanları tek tek barındırın, bu da cerrahi komplikasyonlara yol açar.

2. Lazer benek kontrast görüntüleme ile kuyruk vasküler değerlendirme

1. Fareyi adım 1.2'deki gibi uyuşturun.
2. Kuyruk vasküleritesini görselleştirmek için lazer benek kontrastı görüntülemeyi kullanmak için genişliği 0,8 cm, yüksekliği 1,8 cm, nokta yoğunluğunu yüksek, kare hızını 44 görüntü/saniye, süreyi 30 saniye ve renkli fotoğrafı 10 saniyede 1 olarak ayarlayın.
3. Açıklık için venöz ve arteriyel perfüzyonu değerlendirin. Nitel olarak akışın sürekliliği görselleştirilmelidir.

3. Yakın kızılötesi lazer anjiyografi ile fonksiyonel lenfatik değerlendirme

1. Hayvanı adım 1.2'deki gibi uyuşturun
2. İndocyanine green (ICG) (25 mg/10 mL) yeniden inşa edin ve ucun yakınındaki distal fare kuyruğuna deri altından 0,1 mL verin.
3. Odanın ışıklarını kısın. Kızılötesi lazer anjiyografisini tamponlama ayarına ve ardından canlı yakalamaya yerleştirin.

4. TNT kullanarak fare kuyruğuna nükleik asit kargonun odaksal teslimatı

1. Hayvanı adım 1.2'deki gibi uyuşturun.
2. Topikal cilt eksfoliasyon kremi kullanarak fare kuyruğunu pul pul dökülür.
3. Fare kuyruğunu 5 dakika boyunca 37 °C'de kollajenaz çözeltiye (10 mg/mL) daldırin.
4. DNA'ları TNT_2.0 çip haznesine yükleyin³⁵.
5. TNT_2.0 silikon çip cihazını, kuyrukla temas eden nanoneedles ile kuyruk üzerinde istenen odak yeri üzerine yerleştirin.
6. Rezervuara pozitif bir elektrik probu yerleştirin. Negatif probu 30 G'lık bir iğneye takın ve iğneyi kuyruk içine teslimat bölgesine deri altından yerleştirin.
7. Kare dalga darbeli elektrik stimülasyonu uygulayın (10 x 10 ms darbe, 250 V, 10 mA).

Sürekli lenfödem için fare kuyruk modeli tekniği Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil, fare kuyruk modelinin ilgili anatomisini sergiler. Şekil 2 lenfödem indüksiyonu sonrası fare kuyruğunda ilerleyici şişlik ve sürekli dirençli lenfödem göstermektedir. Kesilen koni denklemi tarafından hesaplanan fare kuyruk hacmi, 4. haftada zirveler ve 6. haftaya platolar ve ardından 15. haftaya kadar sürdürülen kademeli iyileşme. Kuyruk hacmi, modelde lenfödem için terapötik müdahalelerin etkisini değerlendirmek için bir sonuç değişkeni olarak kullanılabilir. Şekil 3'tekuyruk vaskültür açıklığının değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü lazer benek gözlenebilir. Bu, kuyunun venöz yaralanma yerine lenfatik disfonksiyona ikincil olmasını sağlamak için modele titizlik katar. Müdahalelerin etkisi daha sonra potansiyel olarak lenfödem tedavisine daha fazla güvenle çevrilebilir. Şekil 4'te kızılötesi lazer lenfiljiye yakın bir lazer epimphangiografisi ile yapılan fonksiyonel lenfatik değerlendirme gösterilmiştir. Bu ek sonuç değişkeni, müdahalelerin fonksiyonel lenfatik etkisini sağlar. Şekil 5, doku nanotransfeksiyon teknolojisi (TNT2.0)kullanılarak genetik kargonun cerrahi bölgeye transkütan olarak odak teslimini göstermektedir. TNT2.0, bu lenfödem modelinde potansiyel aday gen temelli terapötiklerin bakım noktasının verilmesini kolaylaştırır.

Şekil 1: Sürekli lenfödem için fare kuyruk modeli. (A) Cerrahi mikroskopi altında tabandan 20 mm uzaklıktaki bir murine kuyruğuna 3 mm genişliğinde tam kalınlıkta cilt eksizyonu yapılır. Vaskülatın korunmasına özen edilir. (B) Fare kuyruğunun kesitinin şeması. DV=dorsal ven, LV=lateral damarlar, A=ventral kaudal arter, CV=kaudal omur, T=tendon ve kas, sarı oklar lenfatikleri gösterir. (C) Lenfatiği lokalize etmek için kuyruk ucuna izosülan mavisinin verilmesinden sonra, lenfatikler (sarı ok) mavi renk sergiler. Lenfatikler bitişik yan damarları (beyaz ok) korurken bozulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fare kuyruğu lenfödem modelinin ilerleyici şişmesi. (A) Tam kalınlıklı cilt eksizyon ve lenfatik transeksiyonun ardından, fare kuyruğu 15 hafta boyunca devam eden ilerleyici şişlik sergiler. Braket, kuyruğun tabanından cerrahi tam kalınlıkta cilt eksizyonunun başlamasına kadar 20 mm'yi gösterir. (B-C) 15 hafta boyunca kuyruk hacmindeki değişimin ölçülmesi, her bir nokta bir hayvanı temsil eden(B) çubuk grafikler, n=15 veya(C) çizgi grafiği olarak temsil edilir. SEM ± olarak temsil edilen veriler.

Şekil 3: Lenfödem fare kuyruk modelinde fare kuyruğu perfüzyonunu doğrulamak için yüksek çözünürlüklü lazer benek kontrast görüntüleme. Lazer benek, lenfatik etiyolojinin şişmesini doğrulamak ve kuyruk nekrozunu en aza indirmek için fare kuyruğu vaskülatını postoperatif olarak değerlendirmek için kullanılır. (A) Lazer benek ile tespit edilen yaralı lateral damarlara (siyah ok) sahip bir fare kuyruğu. (B) Lazer benek ile saptanmış sağlam lateral kuyruk damarı (siyah ok) lenfödem sonrası ameliyat. (n=5) çözünürlük 0,02 mm; Renk kodlu çubuk, rastgele göreli birimlerde ölçülen perfüzyonu (mavi: düşük, kırmızı: yüksek) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Fare kuyruk modelinde kızılötesi lazer lymphangioraphy'ye yakın kullanılarak lenfatik fonksiyonun değerlendirilmesi. Fare kuyruğunun ucuna enjekte edilen indocyanine yeşili (ICG) lenfatiklere lokalize olur. Ameliyat öncesi, lenfatikler fare kuyruğu boyunca sağlamdır. Ameliyat sonrası, şişliğin lenfatik disfonksiyondan kaynaklandığını doğrulayan cerrahi bölgenin ötesinde ICG geçişi yoktur. Sarı ok kuyruğun tabanını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Doku nanotransfeksiyon teknolojisi (TNT) kullanılarak genetik kargonun odak teslimi. (A) TNT teslimatının illüstrasyonu. (B) Plazmidler TNT2.0 rezervuarına yüklenir. Pozitif ve negatif elektrik probları takılır ve odak, viral olmayan, transkütan transfeksiyonunu kolaylaştıran kısa, kare dalga darbeli elektrik stimülasyonu (10 x 10 ms darbe, 250 V, 10 mA) iletilir. (C) Flor kuyruğuna floresan amidit (FAM) etiketli DNA teslimatı ile gözlemlenen TNT2.0 kullanılarak genetik kargo teslimatının verimliliği. Fare kuyrukları TNT tedavisinden iki gün sonra bölümlendi ve floresan mikroskopi ile değerlendirildi. Beyaz noktalı çizgiler, murine kuyruğu derisinin epitelini gösterir. Beyaz oklar DNA etiketli FAM'ı gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların rakip çıkar çatışmaları yoktur.