Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması
Bu makalede
Özet
Özet
Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.
Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.
Giriş
ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM'yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM'yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.
Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ECM2'yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil eder2,3.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi'nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık.
NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle tüm adımları steril tutmak önemlidir. Bu nedenle, dikiş, mikro dikiş, çözeltiler, boru, Luer konektörleri ve kateterler de dahil olmak üzere tüm aletler ve cerrahi malzemeler steril olmalıdır. Polistiren tepsi de dahil olmak üzere yüzeyler% 70 etanol ile dezenfekte edilmeli ve perfüzyon tercihen laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler oda sıcaklığında gerçekleşir.
1. Ölüm sonrası mikrocerrahi
- Fareyi bir CO2 odası kullanarak ötenazi edin.
- Fareyi 4 L odaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 0,2 L / dk'dan başlayarak% 100 CO2 ile doldurmaya başlayın, 3 dakika sonra 0,8 L / dk'lık bir akışa ulaşana kadar artırın. Fare ilk 2 dakika boyunca bilinçsiz kalmalı ve daha sonra solunum sona ermelidir (genellikle yaklaşık 5 dakika, ancak akış gerektiği gibi korunabilir). Bir sonraki adıma geçmeden önce ölümü onaylayın.
- Toraksı, karnı ve farenin arkasını saç kesme makinesi ile tıraş edin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tıraş, görüntüleme veya biyokimyasal analiz için numunelerde saç varlığı nedeniyle eser sayısını büyük ölçüde azaltır.
- Fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin.
- Mayo düz desen makası kullanarak, alt menekbüler bölgeden alt karın bölgesine kadar uzanan bir kese kesisi ile cerrahi erişim kurun ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.
- Mikrocerrahi makas kullanarak, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesin.
- Düz desenli makas kullanarak, sternumu önceki kesiler boyunca kesin ve daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomiyi tamamlayın, ardından kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın.
- Yuvarlak uçlu mikro-toparlamalar (veya Dumont mikro-toparlamaları) kullanarak, timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarır. Bu büyük gemileri ortaya çıkardı.
- Koter kullanarak, azalan kava damarını dağla ve düz desen makası kullanarak yemek borusunu kesin.
- Keskin mikro-tokaps kullanarak, brakiyofalik damarları ve brakiyofalik, sol ortak karotis ve sol subklaviyen arterleri alttaki dokudan ayırarak ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırın.
- Mikro iğne tutucu, keskin mikro-emişler ve 9-0 dikiş kullanılarak brakiyofalik, sol ortak karotid ve sol subklaviyen arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirilir.
- Braşiyofalik damarları dağla.
- Boyun kaslarını ve trakeayı açığa çıkarmak için orta hat boyunca submandibuler tükürük bezlerini ayırın. Krikotiroid ligamenti ortaya çıkarmak için kasları ayırın. Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın.
- Trakeaya 27 G kateter takın ve trakea dalları bronşlara girene kadar hassas bir şekilde itin (yani katetere direnç karşılanana kadar, sonra 3 mm geri çekilin). Bronşları bozmamaya dikkat edin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına 3 dikiş yerleştirin.
- Fareyi 12. İnen aort omurgaya doğru ön olarak çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Alt yarısını ayırın.
- Aortu retrograd katetere ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. 9-0 dikiş kullanarak, kateter ucunun 5 mm altından başlayarak aortun etrafına 4 dikiş yerleştirin.
2. Hücreden Arındırma
- Silikon boru ve Luer konektörleri kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca 200 μL / dak'ta deiyonize su ile perfuse. Hücreden arındırma sırasında bu akış hızını koruyun.
- Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0,5 sodyum deoksikolat (DOC) olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.
- Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ile değiştirin ve 8 saat boyunca perfuse yapın.
- SDS ve DOC'u 24 saat boyunca yıkamak için bir gecede deiyonize su ile perfuse.
- Hücreden çıkarılan kalp ve akciğerleri kavisli bir makas kullanarak toraksa bağlayarak resect yapın ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ve 4 °C'de 0.3 μM sodyum azit ile deiyonize su içeren steril bir kriyo-tüpte saklayın. İskele biyokimyasal analiz için kullanılacaksa (örneğin, kütle spektrometresi), sıvı nitrometrede snap dondurun.
3. İmmünasyon
- Görüntülemeyi planlayın: birincil antikoru (veya antikorları) ve floresan konjuge sekonder antikorların kombinasyonunu birbirleriyle eşleşecek ve floresan mikroskobun lazer hatlarına uyacak şekilde belirleyin.
- Örneği% 6 (v / v) eşek serumu içeren bir kriyotüme batırarak engelleyin - bir gecede% 3 (w / v) sığır serumu albümin (BSA).
- PBS'de %3 eşek serumunda primer antikor (veya antikorlar) ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
- PBS'de (PBST) 20% ara 0,05'te her seferinde 1 saat boyunca 5 kez yıkayın.
- PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor (veya antikorlar) ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- %0,05'te (PBST) 1 saat boyunca 5 kez yıkayın. Her yıkama arasında 1 saat bekleyin.
- İyonize su ekleyin ve doğrudan ışıktan 4 °C'de saklayın. Bu noktada, iskele görüntüye hazırdır.
4. Görüntüleme
- Numuneyi cam tabanlı bir tabağa yerleştirin ve iki damla saklama çözeltisi (PBS veya deiyonize su) ile nemlendirin.
- Hedefi hazırlayın. Suya daldırma hedefi kullanmanızı öneririz.
- Floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.
- Bilgisayar kontrolüne geçin. Lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektör dalga boylarını, kazancı, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın ve edinmeye başlayın. Doku penetrasyonunu artırmak ve ışık, ağartma ve doku hasarının saçılmasını en aza indirmek için multifotoğraf lazer ekscitasyon kullanmanızı öneririz.
5. Hematoksilin-eosin lekeleme
- Ötenazili bir fareden 1 akciğer lobundan alıntı.
- 10 mm x 10 mm x 5 mm kriyoold yerleştirin ve yaklaşık 500 μL OCT bileşiği ile örtün.
- Kuru buzda (-70 °C) dondurun ve numuneyi bu sıcaklıkta saklayın.
- 2.5. adıma göre işlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar.
- En büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyoold yerleştirin ve adım 5.2'de belirtildiği gibi OCT bileşiği ile örtün.
- Kuru buzda (-70°C) dondurun ve numuneyi başka türlü gerekli olana kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir.
- Bölüm donmuş doku blokları -20 °C'de 5 μm kalınlığında bir kriyostatta ve yapışkan cam slaytlara bölümler yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.
- Hava kuruyana kadar (yaklaşık 20 dk) kaymaları oda sıcaklığına alın.
- Kısa bir süre PBS'ye dalın ve slaytları PBS'de % 4 paraformaldehit içine 15 dakika daldırarak düzeltin. PBS'de bir kez 5 dakika, ardından iki kez damıtılmış suda 5 dakika yıkayın.
- Mayer'in hematoksilin çözeltisinin içine 10 dakika daldırın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
- Bir Coplin kavanozunda damıtılmış su altında 10 dakika yıkayın.
- 7 dakika boyunca eosin çözeltisinin içine dalın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
- %70 etanol ve %96 ve %100 etanol 30 saniye boyunca kısa bir süre daldırma ile fazla Eozin ve susuzluk gidermek için% 50 etanol daldırın. Xylene'e birkaç kez daldırın.
- Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak parçası yerleştirin.
- Slaytları kimyasal bir kaputun altında bir gecede kurumaya bırakın.
- Slayt tarayıcıdaki slaytları tarayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kardiyopulmoner desellülerizasyon
Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan kalır2. Şekil 2 , fare kardiyo-pulmoner k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların kullanımı4,5,6 bildirilmi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Prof. Ivana Novak ve Dr. Nynne Meyn Christensen'e (Kopenhag Üniversitesi İleri Biyogörüntleme Merkezi)'ne mikroskop erişimi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ve JTE); Lundbeck Vakfı'ndan doktora bursu (R286-2018-621; SN. ); İsveç Araştırma Konseyi (2017-03389; CDM); İsveç Kanser Derneği, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj ve 190007; CDM); Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe; RR); ve Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454; RR).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MİKROCERRAHİ | |||
| 6-0 sütür, üçgen kesitli iğne (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 mikro-sütür (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forseps | Güzel Bilim Araçları | 11006-12 | |
| Dişli Adson forseps | Güzel Bilim Araçları | 11027-12 | |
| Castroviejo mikro iğne tutucu | Güzel Bilim Araçları | no. 12061-01 | |
| CO2 fare ötenazisi | |||
| Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar su sistemi) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Tek kullanımlık polistiren tepsi (~30 &kat; 50 cm) | |||
| Diseksiyon mikroskobu (Greenough, iki kollu deveboynu ile) | Leica | S6 D | |
| Çift uçlu mikrospatula | Güzel Bilim Araçları | 10091-12 | |
| Dumont mikroforseps (iki) | Güzel Bilim Araçları | 11252-20 | |
| 45 derece ile Dumont mikroforseps; ipuçları (iki) | Güzel Bilim Araçları | 11251-35 | |
| Saç kesme makineleri | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey iğne tutucu (tungsten karbür çeneli) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| İntravenöz 24-gauge kateter (Insyte) | BD | 381512 | |
| İntravenöz 26-gauge kateter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayonez makas (sert kesim, düz) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Halkalı uçlu mikroforseps (iki) | Aesculap | FM571R | |
| Mikro yaylı makas (Vannas, kavisli) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| İğneler (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Kağıt havlu (steril) veya cerrahi peçete | |||
| Tırtıklı makas (CeramaCut, düz) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yaşargil) | Aesculap | OL166R | |
| Şırınga (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Şırıngaları (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon makası (Walton) | Güzel Bilim Araçları | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 eşek anti-kobay IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 eşek anti-tavşan IgG | Yaşam Teknolojileri | A11037 | |
| BSA (albümin sığır fraksiyonu V, standart derece, liyofilize) | Serva | 11930.03 | |
| Kollajen IV poliklonal antikor (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Ana bilgisayar: tavşan |
| PBS (pH 7.4, 10 kez;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Ev sahibi: keçi |
| Periostin poliklonal antikoru (Manuel Koch'tan nazik bir hediye. RRID:AB2801621) | Ev sahibi: kobay | ||
| Neşter tek kullanımlık bıçak no.11 (adet. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal eşek serumu) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Dedektörler (hibrid dedektör (Leica, HyD S modeli) ve fotoçoğaltıcı tüpler (PMT'ler; ) | Leica | ||
| Floresan ışık kaynağı | Leica | EL6000 | |
| Mikroskop (ters multifoton mikroskobu) | Leica | SP5-X MP | |
| Objektif (lambda mavisi, 20&0 kez;, 0.70 sayısal açıklık (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| İki foton Ti– safir lazer (Spectra-fizik, Mai Tai DeepSee modeli) | |||
| Beyaz ışık lazeri (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| %70 Etanol (mutlak alkol %99,9); mutlak alkol, deiyonize su kullanılarak %70'e (hacim/hacim) ayarlanmalıdır | Erik | 1680766 | |
| Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar su sistemi) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing erkek bağlantı parçaları (1/8 inç) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penisilin-streptomisin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltik pompa (12 kanallı) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silikon boru (2 mm iç çap ve 4 mm dış çap ile) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodyum Azid | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodyum deoksikolat (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodyum Dodesil Sülfat | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H & E BOYAMA | |||
| %4 PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| %96 Etanol | Erik | 201446-5L | |
| Mutlak etanol | Erik | 201152-1L | |
| Lameller (24x50mm; 1000 adet) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 adet) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Kriyostat | Leica | CM3050S | |
| DPX montaj ortamı | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y çözeltisi alkollü% 0.5 | Sigma | 1024390500 | |
| Tüy mikrotom bıçağı paslanmaz çelik, C35 (50 adet) | Pfm medikal | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slaytlar (25 x 75 mm; 144 adet) | Thermofisher | ||
| Mayers hematoksilen | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT bileşiği | VWR | 361603E | |
| Slayt tarayıcı (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Kaynaklar
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
