Yöntem makalesi

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 Mart 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC) insan kardiyomiyositleri (CD), kardiyak fibroblastlar (KF'ler) ve endotel hücrelerinin (VC) üretilmesi, doku gelişimini ve hastalığı yönlendiren farklı kardiyovasküler hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Kardiyak doku modelleri alanında, çeşitli sofistike üç boyutlu (3D) yaklaşımlar, hücre dışı matrisler ve çapraz bağlantıların bir kombinasyonu ile fizyolojik alaka düzeyini ve doğal doku ortamını taklit etmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kullanır. Bununla birlikte, bu sistemler mikrofabrikasyon uzmanlığı olmadan üretilmek için karmaşıktır ve kendi kendine monte etmek için birkaç hafta gerektirir. En önemlisi, bu sistemlerin çoğu, insan kalbindeki nonmyositlerin% 60'ından fazlasını oluşturan vasküler hücrelerden ve kardiyak fibroblastlardan yoksundur. Burada, her üç kardiyak hücre tipinin de iPSC'lerden kardiyak mikrotizeler uzaması için türetmelerini açıklıyoruz. Bu facile replika kalıplama tekniği, standart çok kuyulu hücre kültürü plakalarında birkaç hafta boyunca kardiyak mikrotissue kültürüne izin verir. Platform, ilk tohumlama yoğunluğuna göre mikrotissue boyutları üzerinde kullanıcı tanımlı kontrol sağlar ve gözlemlenebilir kardiyak mikrotissue kasılmalarının elde etmek için kendi kendine montajı için 3 günden az bir süre gerekir. Ayrıca, kardiyak mikrotissular akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) kullanılarak tek hücreli sorgulama için yüksek hücre canlılığını korurken kolayca sindirilebilir. Kardiyak mikrotissuların bu in vitro modelinin ilaç keşfi ve hastalık modellemesinde doğrulama çalışmalarını hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler araştırma alanında ilaç keşfi ve hastalık modellemesi, klinik olarak ilgili örneklerin eksikliği ve yetersiz çeviri araçları nedeniyle çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır1. Son derece karmaşık klinik öncesi modeller veya aşırı basitleştirilmiş in vitro tek hücreli modeller tekrarlanabilir bir şekilde patofizyolojik koşullar sergilemez. Bu nedenle, birkaç minyatürleştirilmiş doku mühendisliği platformu, yüksek verimli bir şekilde uygulama kolaylığı ile doku fonksiyonunun sadık bir şekilde yeniden kesilmesi arasında bir denge sağlamak amacıyla boşluğu kapatmaya yardımcı olmak için evrimleşmiştir2,3. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin ortaya çıkmasıyla, doku mühendisliği araçları araştırma sorularını yanıtlamak için altta yatan kardiyovasküler hastalık durumu olan veya olmayan hastaya özgü hücrelere uygulanabilir4,5,6. Kalp dokusuna benzer hücresel bileşime sahip bu tür doku mühendisliği modelleri, bir veya birden fazla hücre tipinin davranışındaki patolojik değişikliklerin neden olduğu kardiyotoksikliği ve disfonksiyonu test etmek için ilaç geliştirme çabalarında kullanılabilir.

İnsan iPSC'lerinden elde edilen kendi kendine monte edilen mikrotissues veya organoidler, in vivo meslektaşlarıyla fonksiyonel benzerlikler gösteren minyatür doku benzeri derlemeler olan üç boyutlu (3D) yapılardır. IPSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşması veya embriyoid cisimlerin oluşumu yoluyla in situ organoidlerin oluşumuna izin veren birkaç farklı yaklaşım vardır4. Elde eden organoidler, organogenezini yönlendiren morfogenetik süreçleri incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, çeşitli hücre popülasyonlarının varlığı ve öz örgütlenmedeki farklılıklar, farklı organoidler arasındaki sonuçlarda değişkenliğe yol açabilir5. Alternatif olarak, yerel hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için dokuya özgü hücre tiplerine sahip mikrotizelere kendi kendine monte edilen önceden ayırt edilmiş hücreler, kendi kendine monte edilen bileşenleri izole etmenin mümkün olduğu mükemmel modellerdir. Özellikle insan kardiyak araştırmalarında, hücreler farklı hasta hatlarından veya ticari kaynaklardan türetildiğinde, çok hücreli bileşenlere sahip 3D kardiyak mikrotizelerin geliştirilmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır.

Fizyolojik olarak ilgili, kişiselleştirilmiş, in vitro modelde hücre davranışlarına ilişkin mekanistik anlayışımızı geliştirmek için ideal olarak tüm bileşen hücre tipleri aynı hasta hattından türetilmelidir. bir insan kalbi bağlamında, gerçekten temsili bir kardiyak in vitro modeli baskın hücre tipleri arasında çapraz sapı yakalar, yani kardiyomiyositler (CD), endotel hücreleri (VC'ler) ve kardiyak fibroblastlar (KF'ler)6,7. Bir miyokardın sadık rekapitülasyonu sadece biyofiziksel streç ve elektrofizyolojik stimülasyon değil, aynı zamanda VC'ler ve CCS8 gibi hücre tiplerinin desteklenmesinden kaynaklanan hücre-hücre sinyali gerektirir. CF'ler hücre dışı matris sentezinde ve doku yapısının korunmasında rol oynar; ve patolojik bir durumda, CF'ler FIBROZIs'a neden olabilir ve CMs9'daki elektrik iletimini değiştirebilir. Benzer şekilde, VC'ler parakrin sinyalizasyon ve hayati metabolik talepler sağlayarak CD'lerin kontrtil özelliklerini düzenleyebilir10. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili yüksek verimli deneylerin yapılmasına izin vermek için üç ana hücre tipinden oluşan insan kardiyak mikrotizelerine ihtiyaç vardır.

Burada, insan iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler), iPSC türevi endotel hücreleri (iPSC-ECs) ve iPSC türevi kardiyak fibroblastlar (iPSC-CF'ler) ve 3D kültürlerinin tekdüze kardiyak mikrotissue dizilerinde türetilerek kardiyak mikrotissuların imalatında aşağıdan yukarıya bir yaklaşım açıklıyoruz. Kendiliğinden atan kardiyak mikrotizeler üretmenin bu facile yöntemi, kalp fizyolojisinin fonksiyonel ve mekanistik anlaşılması için hastalıkların modellemesi ve ilaçların hızlı testi için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür çok hücreli kardiyak mikrotissue platformları, kronik veya akut kültür koşullarında kardiyak hastalığın zaman içinde ilerlemesini taklit etmek için genom düzenleme teknikleri ile kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Orta, reaktif, kültür plakası hazırlama

  1. Hücre kültürü için hücre yıkama çözümü: Kalsiyum veya magnezyum olmadan 1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) kullanın.
  2. Kardiyomiyosit farklılaşma ortamı
    1. 500 mL kardiyomiyosit bazal ortama (RPMI 1640) 10 mL takviyesi (50x B27 artı insülin) ekleyerek farklılaşma Orta #1 hazırlayın.
    2. 500 mL kardiyomiyosit bazal ortama (RPMI 1640) 10 mL takviyesi (50x B27 eksi insülin) ekleyerek farklılaşma Orta #2'yi hazırlayın.
    3. 500 mL kardiyomiyosit bazal ortama (RPMI 1640) eksi glikoz takviyesi (50x B27 artı insülin) ekleyerek saflaştırma Orta #3'ü hazırlayın.
  3. Endotel büyüme ortamı ve Manyetik olarak etkinleştirilen hücre sıralama (MACS) reaktifleri
    1. Ticari olarak mevcut endotel hücre büyüme orta takviye kiti ile endotel büyüme ortamı (EGM) hazırlayın.
    2. Sığır serum albümin (BSA) stok çözeltisini durulama çözeltisi ile 1:20'ye seyrelterek hücre ayırma ayırma tampon çözeltisini hazırlayın.
  4. Kardiyak fibroblast diferansiyelasyon ortamı: Fibroblast bazal ortam (DMEM-yüksek glikoz) ve Serumsuz Fibroblast Yaşam Faktörleri kiti ile kardiyak fibroblast diferansiyelasyon ortamını hazırlayın.
  5. Kardiyak mikrotissue imalat ve bakım ortamı: Ek (50x B27 artı insülin) ile kardiyomiyosit bazal ortam (RPMI 1640) ve EGM ile filtrelenmiş ortamı 70/30 v/v oranında hazırlayın.
  6. Küçük molekül ve büyüme faktörü stok çözümleri
    1. Her üç hücre tipinin de farklılaşması için, GSK3-beta inhibitörü CHIR 99021'in 200 μL aliquots'larını hazırlayın (6-[[2-[4-(2,4-Diklorophenyl)-5 -(5-metil-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]etil]amino]-3-piridinkarbonitrile); Wnt inhibitörü IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-kinolinil-Benzamid; ve dimetil sülfit (DMSO) 10 mM konsantrasyonda büyüme faktörü beta (TGF-β) inhibitörü SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-yl]benzamid).
    2. İnsan iPSC-EC farklılaşması için, temel fibroblast büyüme faktörünün (bFGF) (20 μg/mL), vasküler endotel büyüme faktörü 165'in (VEGF165) 100 μL aliquotsunu hazırlayın; 50 μg/mL) ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4; 20 μg/mL) ultra saf damıtılmış suda %0,1 (w/v) BSA. Aliquots 'u -20 °C'de saklayın; uzun süreli depolama için, aliquots 1 yıla kadar -80 ° C'de saklanabilir.
  7. iPSC-CM'lerin, iPSC-EC'lerin ve iPSC-CF'lerin bakımı için ön kaplama plakaları.
    1. DMEM/F12'deki Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) bodrum membran matris ortamını 1:200 oranında seyrelterek iPSC-CM yeniden kaplama için bodrum membran matrisi orta kaplamalı 6 kuyulu plakalar hazırlayın. 6 kuyu plakasının her kuyusuna 2 mL seyreltilmiş bodrum membran matrisi ortamı ekleyin ve en az 2 ila 4 saat ayarlanarak bırakın.
    2. 6 kuyu plakası veya 10 cm'lik yemeği jelatin ile önceden kaplayın. 37 °C'de bir su banyosunda sıvılaştırılmış %2 jelatin çözeltisi ve PBS'de filtrelenmiş %0,2 (v/v) jelatin'i gerektiği gibi uygun bir hacimde hazırlayın. Kültür plakasını kullanmadan önce 37 °C'de en az 30 dakika boyunca % 0,2 jelatin 10 mL ile kapla.
      NOT: Jelatin plakaları MACS'den sonra hem iPSC-CF'ler hem de iPSC-EC'ler için kullanılabilir.
  8. Mikrotissue kalıplarının imalatı: PBS'de kuru 100 mL cam şişede% 2 düşük eritme agarose çözeltisi hazırlayın. Agarose'yi kullanmadan önce 20 dakika boyunca 121 °C, 15 psi'de sterilize edin. Döküm silikon mikro kalıpları 121 °C, 15 psi'de 15 dakika boyunca otoklavlav.
  9. Sindirim, immünostaining ve akış sitometrisi için çözümler
    1. Mikrotissue sindirimi için PBS'de Dispase I (1 U/mL) ve Liberaz (3 U/mL) enzim sindirim tamponu hazırlayın. Bu çözeltiyi buzda tut.
    2. Hem hücre hem de mikrotissue fiksasyonu için% 4.2 paraformaldehit (PFA) içeren buz gibi ticari olarak mevcut fiksasyon reaktifi kullanın.
    3. PBS'de %0,25 Triton X-100'ü permeabilizasyon için, %0,1'i yıkama için ara-20 hazırlayın. Çözelti oda sıcaklığında saklanabilir.
    4. Floresan aktif hücre sıralama (FACS) analizleri için FACS tamponu [PBS veya %2 fetal sığır serumu (FBS) ile HBSS) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
    5. İmmün yetinme için PBS'de %2 normal keçi/eşek/tavşan serumu hazırlayın. Antikorların yetiştirildiği konakta bulunan serum türlerini seçin.

2. Kardiyak farklılaşma ve arınma

NOT: Kardiyomiyosit farklılaşması öncesinde tüm iPSC'ler ~%75 ila %80 oranında iklüzyonda tutulmalıdır. Bu protokol için kullanılan iPSC'ler, Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü (SCVI) Biobank'ta gerçekleştirilen Sendai virüsü yeniden programlaması kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC' ler) türetilmiştir.

  1. Farklılaşmadan önce, kültür iPSC geçişe kadar koloniler (P20).
  2. iPSC kültür ortamını 6 kuyulu plakadan çıkarın ve hücreleri 2 mL PBS ile bir kez yıkayın.
  3. 0. günde, her kuyuya CHIR (6 μM final) ile 2 mL farklılaşma Orta #1 ekleyerek mezendoderm indüksiyona başlayın. Son konsantrasyon, farklı iPSC hatları için 6 ila 9 μM arasında değişebilir. Bu nedenle, optimal kardiyak mezoderm indüksiyonunu tanımlamak için 6 kuyulu bir plaka üzerinde farklı CHIR konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir.
  4. 2. günde, her kuyuda taze 2 mL Orta #1 ile değiştirerek hücreleri kurtarın.
  5. 3. günde, kardiyak soy spesifikasyonunu teşvik etmek için her kuyudaki ortamı 2 mL farklılaşma ile Wnt inhibitörü IWR-1-endo (5 μM) ile değiştirin.
  6. 5. günde, her kuyuda ortayı taze 2 mL Orta #1 ile değiştirerek hücreleri kurtarın.
  7. 7. günde, her kuyuda ortayı 2 mL Orta #2 ile değiştirin. Kardiyomiyositlerin kendiliğinden dövülmesi 8-9. Bazı çizgiler için, dayak hücreleri 11 gün kadar geç görünebilir.
  8. Farklılaşma kültürünün saflaştırılması için, 10. günde her kuyuda 2 mL eksi glikoz Orta #3 ile değiştirin.
  9. 13. günde, her kuyuda 2 mL artı glikoz Orta #2 ile ortamı değiştirerek hücreleri kurtarın.
  10. 16. günde, her kuyuda 2 mL Orta #3 ile ikinci saflaştırma turu gerçekleştirin.
  11. 19. günde hücreleri 2 mL artı glikoz Orta #2 ile kurtarın.
  12. 20. günde, kuyuları 1 mL PBS ile bir kez yıkayın ve 37 °C'de 6 dakika boyunca 1 mL 10x Tripsin kullanarak hücreleri ayrıştırın. Kuluçkadan sonra, hücreler kuyu yüzeyinden 15 s'den daha az bir süre boyunca tek hücrelere kaldırılır ve enzimi nötralize etmek için eşit miktarda Orta #2 ile 15 mL konik tüpe eklenir. Hücre süspansiyonu 270 x g'da 3 dakika santrifüj.
  13. Hücre peletini 3 mL Orta #3'te yeniden oluşturun. Hücreleri sayın ve yeni bir bodrum membran matrisi orta kaplamalı 6 kuyu plakasının her kuyusuna toplam ~ 3 milyon hücreyi kaplamak için uygun orta #3 hacmini ekleyin. Yeniden kaplamadan sonraki ikinci günde, ortamı taze 2 mL Orta #2 ile değiştirin ve dondurma veya gelecekteki deneyler için kardiyomiyositlerin trypsinasyonuna kadar her gün 2 mL Orta #2 ile yenilenin.

3. Endotel hücre farklılaşması ve MACS

  1. % 75 ila% 80 iPSC konfluency'de, plakayı PBS ile yıkayın, kuyu başına 2 mL.
  2. 6 μM CHIR ile 2 mL farklılaşma Orta #1 ile değiştirerek 0.
  3. 2. günde, ortamı 2 mL farklılaşma ile değiştirin Orta #1, 2 μM CHIR ile.
  4. 4. günde, ortamı 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 ve 20 ng BMP4 ile birlikte 2 mL EGM ile değiştirin.
  5. 6. günden 10. güne kadar her 2 günde bir büyüme faktörleriyle desteklenmiş 2 mL EGM ile ortamı değiştirin. 8 μM konsantrasyonda TGFβ inhibitörünün (SB431542) eklenmesi, endotel genişlemesini teşvik etmek ve diğer mezenkimal kökenli hücre tiplerinin farklılaşmasını bastırmak için isteğe bağlıdır.
  6. 12. günde, 37 °C'de 8 dakika boyunca 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunda 1 mL 10x Tripsin kullanarak her bir kuyuda 1 mL PBS ile durulayarak MACS için adımlara başlayın.
  7. Ayrışma enzimini nötralize etmek için 50 mL konik tüpte eşit hacimde EGM ortamı hazırlayın. 50 mL konik tüpe 40 μm hücre süzgeci yerleştirin ve ayrışmış hücre süspansiyonunu süzgeçten geçirin. Her 2 ila 3 ayrışmış kuyu için filtreyi değiştirin.
  8. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak %0,4 Trypan mavisi kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri numaralandırır.
  9. 4 °C'de önceden soğutulmuş bir santrifüj setinde 5 dakika boyunca 300 x g'da hücre süspansiyonu pelet.
  10. Üstnatant atın ve adım 3.8'deki toplam sayıya göre hücre peletini uygun sıralama arabelleği hacminde yeniden diriltin.
    NOT: Toplam 107 hücre başına 80 μL sıralama arabelleği ekleyin.
  11. Manyetik boncuk etiketleme için, 107 hücre başına 20 μL FcR Engelleme reaktifi ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  12. 107 hücre başına 20 μL CD144 veya CD31 Mikrobead ekleyin ve iyice karıştırın. Hücre süspansiyonu 15 dakika boyunca 4 °C'de karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
  13. Etiketli hücreleri yıkamak için 20 mL sıralama tamponu ekleyin ve 4 °C'de önceden soğutulmuş bir santrifüjde 5 dakika boyunca 300 x g hücreleri peletleyin.
  14. Hücre peletini 3 mL sıralama tamponunda yeniden süzülür ve buzun üzerinde bırakın.
  15. Sütunu ayırıcı çentik içine yerleştirerek manyetik bir ayırma sütunu hazırlayın.
  16. 3 mL ayrıştırma tamponu ile durulayarak sütunu aşındırın ve akışı atık konik bir tüpte toplayın.
  17. Durulama arabelleği aktıktan sonra, kümeleri kırmak ve hücre süspansiyonunu sütuna uygulamak için hücre süspansiyonunu iyice yeniden uygulayın.
  18. Hücre süspansiyonu aktıktan sonra, etiketlenmemiş hücreleri çıkarmak için sütunu 3 mL sıralama arabelleğiyle üç kez yıkayın.
  19. Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve CD144+/CD31+ hücre elüasyonu için 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
  20. Sütuna 5 mL sıralama arabelleği ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri pistonla hemen yıkayın.
  21. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak %0,4 Trypan mavisi kullanarak uygulanabilir hücre numarasını belirleyin.
  22. Hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş bir santrifüjde 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.
  23. Hücre peletini, adım 3.21'deki toplam sayıya göre 5-8 μM TGFβ inhibitörü (SB431542) ile uygun EGM hacminde yeniden kullanın.
  24. Bu pasajı 0 (P0) hücrelere uygun hücre yoğunluğunda (4 x 104 hücre/cm2) önceden kaplanmış %0,2 jelatin plakasında plakala.
  25. P0 ve P1 için, TGFβ inhibitörü ile her 2 günde bir taze EGM ile ortamı yenilemeye devam edin. P2'den itibaren, hücreler TGFβ inhibitörü olmadan endotel büyüme ortamında kültürlenebilir.

4. Kardiyak fibroblast farklılaşması

  1. iPSC'lerin %90 ila %95 bir arada olmasına izin verin; her kuyuya 1 mL PBS ile yıkayın.
  2. 11 μM CHIR ile 2 mL farklılaşma Orta #1 ekleyerek 0. Hassas iPSC hatları için konsantrasyon 9-10 μM arasında değişebilir.
  3. 1. günde plakaya uyun. Plakaya yapışlanmış ~%30 ila %40 hücre ile önemli hücre ölümünü gözlemlemek normaldir.
  4. 3. günde, kardiyak progenitörlerin genişlemesini teşvik etmek için 5 μM IWR-1-endo ile 2 mL farklılaşma Orta #1 ekleyin.
  5. 4. günde, ortamı 2 mL kardiyak fibroblast farklılaşma ortamı ile değiştirin. 16. güne kadar her 2 günde bir taze ortamla değiştirin.
  6. 18. günde, 37 °C'de 10 dakika boyunca 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunda 1 mL 10x Tripsin kullanarak hücreleri ayırın.
  7. Hücre tabakasını iyice bozun ve hücre süspansiyonunu% 5 FBS ile desteklenmiş eşit miktarda DMEM / F12 ortamı içeren 50 mL konik bir tüpte 70 μm hücre süzgecinden geçirin.
  8. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak %0,4 Trypan mavisi kullanarak uygulanabilir hücre numarasını belirleyin.
  9. Bir pelet elde etmek için hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.
  10. İlk yeniden kaplama için, hücre peletini uygun bir farklılaşma ortamı hacminde ve plakayı% 90 izdiah edene kadar% 0,2 jelatin kaplı bir plaka üzerinde bir hücre yoğunluğunda (6 x 104 hücre / cm2) yeniden biriktirin.
  11. Plakayı bölün ve jelatin kaplı plakalarda% 10 serum ile normal DMEM / F12'de kardiyak fibroblastları koruyun.

5. Kardiyak mikrotissue kalıplarının dökümü ve hücre tohumlama

  1. Agarose'yi mikrodalga fırında 100 mL cam şişede kaynatana kadar eritin. Agarose şişesini püskürtün ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Agarose'un ~3 dakika soğumasını bekleyin.
  2. Pipet 700 μL erimiş agarose 9 x 9 dizi silikon mikro kalıp içinde. Pipetleme yaparken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
  3. Agarose jelleşmeyi hızlandırmak için kalıbı önceden soğutulmuş bir buz bloğuna dikkatlice yerleştirin.
  4. Agarose jelleştikten sonra yarı saydam hale geldiğinden emin olun. Agarose replikasını gevşetmek için mikro kalıbın kenarlarını dikkatlice bükün. Daha sonra, agarose replikasını silikon mikro kalıptan ayırmak için kopyayı her taraftan nazikçe soyun.
  5. 81 dairesel girinti (800 μm çap; 800 μm derinlik) içeren agarose mikrotissue tepsisini steril 12 kuyulu bir plakaya aktarın.
  6. Agarose mikrotissue tepsisine 2 mL PBS ekleyin ve mikroskop altında sıkışmış kabarcıklar veya düzensiz şekilli kuyular olup olmadığını inceleyin.
  7. Agarose tepsisini bir gecede 2 mL% 70 etanol içine batırın, ardından biyogüvenlik kabininde 1 saat boyunca UV tedavisi.
  8. Kullanmadan önce% 70 etanolünü çıkarın ve damıtılmış suyla iki kez yıkayın ve 2 mL PBS ile son bir yıkama.
  9. iPSC-CM'leri, iPSC-EC'leri ve iPSC-CF'leri deneyin, etkisiz hale getirin ve sayın ve hücre süspansiyonlarını buza yerleştirin.
  10. PBS'yi girintilere dokunmadan kuyudan ve hücre tohumlama odasından dikkatlice çıkarın.
  11. Yeni bir tüpte, 106 hücre/mL'lik son hücre yoğunluğunu elde etmek için iPSC-CM'leri, iPSC-EC'leri ve iPSC-CF'leri sırasıyla 7:2:1 oranında karıştırın. Daha yüksek hücre yoğunlukları daha büyük mikrotizelere neden olacaktır.
    NOT: 2 x 106 hücre/mL'yi aşmayın.
  12. Hücre süspansiyonunun 200 μL'lik kısmını tohumlama odasına damla yönünde dikkatlice ekleyin.
  13. Hücrelerin 2 saat boyunca bir CO2 inkübatörde 37 °C'ye yerleşmesine izin verin.
  14. Sadece iç odanın yüzeyini kaplamak için agarose kalıbını çevreleyen mikrotissue imalat ortamını ekleyin.
  15. 24 saat sonra, hücreler dairesel girintilerde kendiliğinden monte edilir ve önemli ölçüde sıkıştırır. Bakım için her 2 günde bir taze ortamla değiştirin.

6. İmmünasyon için hücrelerin ve kardiyak mikrotissuların sabitlenmesi ve permeabilizasyonu

  1. Her bir hücre tipi için, hücreleri bodrum membran matrisi orta veya jelatin kaplı oda slaytlarında (yaklaşık 2,5-3 x 105 hücre/mL) ayrı ayrı kültürlendirin. Kardiyak mikrotissues, 15 mL konik tüpte hafifçe dairesel girintilerden temizlenerek toplanabilir.
  2. Ortamı aspire edin ve hücreleri veya mikrotizeleri 1 mL PBS ile durulayın; daha sonra, oda kaydıraları için 20 dakika boyunca% 4.2 PFA ve oda sıcaklığında mikrotizeler için 1 saat içeren sabitleme tamponu ile sabitleyin.
  3. PFA'yı epire edin ve oda kaydıraları için 5 ila 7 dakika ve 15 mL konik tüpte mikrotisezler için 20 dakika boyunca 1 mL permeabilizasyon çözeltisi (PBS'de% 0,25 Triton X-100) ekleyin.
    NOT: Bu adımdan itibaren, numuneler tezgah üstü sallanan bir platformda hafifçe sallanabilir.
  4. Permeabilizasyon çözeltisini epire edin ve 2 ila 3 mL PBS ile bir kez durulayın.
  5. Hücreleri 500-1.000 μL bloke çözeltisi (%2 ila %5 normal keçi serumu veya eşek serumu) ile oda slaytları için en az 1 saat ve mikrotissues için 3 ila 4 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Hücreleri veya kardiyak mikrotissuları, numuneyi kapsayacak şekilde blokaj çözeltisinde hazırlanan konjuge antikorlarla kuluçkaya yatırın. Anti-kardiyak Troponin-T (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) ve anti-DDR2/Vimentin (1:50) ile oda slaytları için 1 saat ve kardiyak mikrotissular için 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  7. Oda kaydırağını her yıkama arasında 5 dakika boyunca 500 μL% 0.1 Ara-20 ile üç kez yıkayın ve PBS ile son yıkama.
  8. Kardiyak mikrotissular için, her yıkama arasında 20 dakika süre ile beş kez 2 mL% 0.1 Ara-20 ile yıkayın. 20 dakika daha son bir yıkama adımı gerçekleştirin.
  9. Konfokal mikroskopiden önce hücreleri veya mikrotizeleri 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 μg/mL) ile kuluçkaya yatırın.
  10. Kardiyak mikrotissular için, 35 mm'lik bir cam alt tabağa dikkatlice aktarın ve mikrotsuları batırmak için PBS ekleyin.
  11. 3D görüntüleme için, mikrotissue'nin 20x veya 40x yağ daldırma hedef kazanç merkezi odağı kullanarak ve her florofor için pozlama parametrelerini ayarlayın.
  12. Z yığını elde etmek için, 5-10 μm dilim aralığı ile toplam görüntüleme derinliği 100-200 μm olan Canlı modda ilk ve son koordinatları ayarlayın.

7. Kardiyak mikrotissuların sindirimi ve akış sitometrisi için hücrelerin hazırlanması

  1. Mikrotissuları sindirmek için, mikrotissues'i orta #1 ile dairesel girintilerden 15 mL konik bir tüpe geniş delikli 1 mL pipet ucu kullanarak hafifçe yıkayın.
  2. Mikrotissuların ortamı dikkatlice yerleştirmesine ve aspire etmesine izin verin ve hücreleri veya mikrotissuları 1 mL PBS ile durulayın ve 37 °C'de 20 dakika boyunca 200-300 μL enzim sindirim tamponu ekleyin. 10 dakikada, mikrotissuları 1 dakika hafifçe karıştırın ve geri kalan süre boyunca 37 ° C'de tekrar kuluçkaya yatırın.
  3. Kuluçkadan sonra, bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek için mikrotissuları kuvvetlice karıştırmak için düzenli bir 1 mL pipet ucu kullanın.
  4. Mikrotissues tek hücrelere yeterince sindirildikten sonra, hücre süspansiyonunu hemen% 5 FBS içeren 5 mL orta ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgecinden süzün. Toplam hücre sayısını sayın ve tek hücre süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.
  5. FitC Annexin V ve 100 μg/mL propidium iyodür (PI) veya To-Pro3 ölü hücre dışlama boyası ile 100 μL eksel bağlama tamponunda 1 x 105-1 x 106 hücreyi buz üzerinde 10 dakika boyunca epire edin ve yeniden biriktirin.
  6. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonu için 300 μL eksel bağlama tamponu ekleyin ve akış sitometri analizi için yuvarlak bir alt FACS tüpüne aktarın. Belirli floroforlar için doğru lazerleri ve emisyon filtrelerini kullanın.
  7. Sabit hücreler kullanarak hücre yüzeyi işaretleyicilerinin ölçülmesi için, 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre peletinin sabitlenmesini ve permeabilizasyonunu gerçekleştirin.
  8. Permeabilizasyondan sonra, hücre peletini durulayın ve hücreleri 1 saat boyunca ilgili konjuge antikorlarla kuluçkaya yatırın. Hücre peletini 4 mL FACS tamponunda (PBS'de % 2 FBS) yıkayın ve 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
  9. Akış sitometri analizi için hücreleri 200-300 μL FACS tamponunda yeniden biriktirin.
  10. Öne ve yana saçılma özelliklerini lekesiz bir örnekle ayarlayın ve lazer voltajlarını ayarlamak için her florofor için bir izotip kontrolü kullanmayı düşünün. Veri analizi için en az 20.000 olay toplayın.

8. Kendiliğinden atan kardiyak mikrotizelerin kasılma analizlerinin yapılması

  1. En az üç vuruş yakalamak için kardiyak mikrotissues videoları kaydedin. Kayıt çözünürlüğünü kare hızında >30 kare hızında en az 1280 x 720 piksel olarak ayarlayın ve videoyu 'ye kaydedin. AVI formatı.
  2. Kullanıcı arabirimini başlatmak için MotionGUI script11'i MATLAB ortamında çalıştırın.
  3. 'nin. Videoyu yüklemek için klasörünüzdeki AVI dosya konumu. Ardından, Giriş paneline videonun çekildiği kare hızını girin.
  4. Gelişmiş giriş panelinde, çözünürlüğe ve yakalama büyütmeye göre bir piksel boyutu belirtilebilir.
  5. Mikrotissue daralmasının gücüne bağlı olarak uygun bir makroblok piksel boyutu (varsayılan 16) ve algılanabilir bir piksel hareketi belirtilebilir.
  6. Parametreleri ayarladıktan sonra, analize başlamak için Hareket Vektörlerini Al'a tıklayın.
  7. Dairesel girintideki tek mikrotissue'yi çevreleyen alanları dışlamak için AOI radyo seç düğmesiyle ilgi çekici bir bölge seçin.
  8. X ve Y eksenlerinde algılanan harekete dayalı ortalama bir daralma ısı haritası oluşturmak için Harita Süresi Ave işlevini kullanın.
  9. En yüksek izleme verileri için, daralma ve gevşeme zirvelerini otomatik olarak ölçmek için Daralma Verilerini Al işlevini kullanın.
  10. Düşük sinyal-gürültü oranı durumunda, maksimum kasılma hızına (mavi nokta) ve maksimum gevşeme hızına (kırmızı üçgen) doğru bir şekilde açıklama eklemek için bir tepe yüksekliği ve mesafe eşiği uygulayın.
  11. Doğru eşikleri ayarladıktan sonra, daralma ve gevşeme değerlerini beat hızı ve beat aralığı ile elde etmek için Tepeleri Analiz Et'i seçin.
  12. İstatistiksel analizler için en az 25 ayrı mikrotizeden ölçüm elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC türevli CD' lerin, EC'lerin ve CD'lerin immünostaining ve akış sitometrisi karakterizasyonu
iPSC-CM'ler, iPSC-EC'ler ve iPSC-CF'lerden oluşan kardiyak mikrotissular üretmek için, her üç hücre tipi de ayrı ayrı ayırt edilir ve karakterize edilir. iPSC'lerin iPSC-CM'lere in vitro farklılaşması son birkaç yılda gelişmiştir. Bununla birlikte, iPSC-CM'lerin verimi ve saflığı çizgiden satıra farklılık gösterir. Mevcut protokol, 9. gün boyunca kendiliğinden atmaya başlayan% 75'in üzerinde saf i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceden ayırt edilmiş iPSC-CM'lerden, iPSC-EC'lerden ve iPSC-CF'lerden kardiyak mikrotissues üretmek için, kardiyak mikrotizeler içinde temasla inhibe edilen hücre sıkışmasından sonra hücre numaralarının daha iyi kontrol altına alınması için son derece saf bir kültür elde etmek önemlidir. Son zamanlarda, Giacomelli ve. al.18 , iPSC-CM'ler, iPSC-EC'ler ve iPSC-CF'ler kullanılarak kardiyak mikrotissuların imalatını göstermiştir. Açıklanan yöntem kullanılarak oluşturulan kardiyak mikrotissular ~5.000...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. Khloris Biosciences'ın kurucularındandır, ancak burada sunulan çalışma tamamen bağımsız olduğu için rakip çıkarları yoktur. Diğer yazarlar çakışma olmadığını bildiriyor.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Amanda Chase'e el yazması hakkındaki yararlı geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Finansman desteği Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP), T29FT0380 (D.T.) ve 27IR-0012 (J.C.W.) tarafından sağlanmıştır; Amerikan Kalp Derneği 20POST35210896 (H.K.) ve 17MERIT33610009 (J.C.W.); ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ve NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 oyuklu plakalarFisher Scientific08-772-29
3D mikro kalıplarMikro dokular12-81 formatı
6 oyuklu plakalarFisher Scientific08-772-1B
AutoMACS DurulamaSolüsyonu Thermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Takviyesi eksi İnsülinYaşam TeknolojileriA1895601
B27 Takviyesi artı İnsülinYaşam Teknolojileri17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, hESC nitelikli matrisBD Biosciences354277
Kardiyak Troponin T AntikoruMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) Mikro BoncuklarMiltenyi130-097-857
CD31 AntikorMiltenyi130-110-670
CD31 Mikro boncuklarMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biyoteknolojisc-81707
Annexin V FITC ve PI ile Ölü Hücre Apoptoz Kiti ThermoFisher ScientificV13242
Dispase IDMEM4942086001
, yüksek glikoz (4.5g / L) glutamin ortamı11960044
DMEM / F-12 bazal ortamGibco11320033
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yokYaşam Teknolojileri14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Fetal sığır serumYaşam Teknolojileri10437
FibroLife Serumsuz Fibroblast Yaşam Faktörleri KitiLifeLIne Hücre TeknolojisiLS-1010
Glikozsuz RPMI ortamıYaşam Teknolojileri11879-020
Keçi serumuYaşam Teknolojileri16210-064
İnsan FGF-basicThermo Fisher Bilimsel13256029
İnsan VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberaz TLMillipore Sigma5401020001
LS Sıralama SütunlarıMiltenyi130-042-401
MACS BSA Stok çözümüMiltenyi130-091-376
MACS Durulama TamponuMiltenyi130-091-222
MidiMACS AyırıcıMiltenyi130-042-302
RPMI ortaYaşam Teknolojileri11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Bilimselkırmızı
Vimentin Alexa Fluor & 488 konjuge AntikorR & D SistemleriIC2105G
Millipore Sigma yok

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64(2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948(2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39(2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886(2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kardiyak MikrodokularStromal Vask ler FraksiyonAk SitometrisiTek H cre RNA DizilemeKonfokal MikroskopiAgaroz Kal plama Tekni iH cre Ekim Yo unlu uKontraktil Fonksiyon Analizimm nofloresan Boyama

İlgili makaleler