Protein Yapılarında Hidrojen Atomlarının Modellenmesi için Nötron Kristalografisi Veri Toplama ve İşleme

Summary

Nötron proteini kristalografisi, hidrojen atomlarının lokalizasyonuna izin veren ve böylece protein fonksiyonunun önemli mekanistik ayrıntılarını sağlayan yapısal bir tekniktir. Burada bir protein kristali montajı için iş akışını sunuyoruz, nötron kırınım veri toplama, yapı iyileştirme ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarının analizi.

Abstract

Nötron kristalografisi, biyolojik makromoleküller içindeki hidrojen atomu konumlarının belirlenmesine izin veren, radyasyon hasarına neden olmazken protonasyon ve hidrasyon durumları hakkında mekanistik olarak önemli bilgiler veren yapısal bir tekniktir. Buna karşılık X-ışını kırınımı, ışık atomlarının konumu hakkında sadece sınırlı bilgi sağlar ve X-ışını ışını, ışığa duyarlı kofaktörlerin ve metal merkezlerin radyasyon hasarına neden olur. Burada sunulan, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'ndaki (ORNL) IMAGINE ve MaNDi kiriş hatları için uygun boyutta bir protein kristali (> 0,1 ^mm3) yetiştirildikten sonra nötron kırınım yapısı elde etmek için kullanılan iş akışıdır. Nötron kırınım verisi toplanması için hidrojenize protein kristallerinin kuvars kılcal damarlara montesini gösteriyoruz. Ayrıca, döteryum ile değiştirilebilir sahalarda hidrojen atomlarının değiştirilmesini sağlamak için _D2O içeren tampon ile monte edilmiş kristallerin buhar değişim süreci de sunulmaktadır. Döteryumun birleştirilmesi, hidrojen atomlarının tutarsız saçılımından kaynaklanan arka planı azaltır ve negatif tutarlı saçılma uzunluklarının neden olduğu yoğunluk iptalini önler. Örnek hizalama ve oda sıcaklığı veri toplama stratejileri, Yüksek Akı Izotop Reaktörü'ndeki (HFIR) IMAGINE'de quasi-Laue veri toplama kullanılarak gösterilmiştir. Ayrıca, kristal montajı ve sıvı nitrojende hızlı donma, laboratuvar reaksiyonu aralarını hapsetmek için kriyo-veri toplama, Spallation Nötron Kaynağı'ndaki (SNS) MaNDi uçuş zamanı cihazında gösterilmiştir. Model koordinat ve kırınım veri dosyalarının hazırlanması ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarının görselleştirilmesi de ele alınacaktır. İlgi çekici proteinin tamamen atom yapısını elde etmek için sadece nötron verilerine veya ortak X-ışını/nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi nihayet tartışılacaktır. Nötron yapısının belirlenmesi süreci, glikosidik bağın oksidatif bölünmesi yoluyla recalcitrant polisakkaritlerin bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloprotein olan litik polisakkarit monooksijenaz Neurospora crassa LPMO9D kristalleri kullanılarak gösterilecektir.

Introduction

Nötron makromoleküler kristalografi, proteinlerin yapısına ve alttaki kimyasına benzersiz bir pencere sağlayan bir tekniktir. Kavramsal olarak X-ışını kırınımsına benzer şekilde, nötron kırınımı makromoleküler yapının atomik ayrıntılarını sağlar, ancak nötronların çekirdeklerle etkileşimi, genellikle X-ışını kırınımı ile tespit edilmesi zor olan ışık atomlarının lokalizasyonunu ^sağlar1. X-ışını kırınımı sırasında, X ışınları elektron bulutundan dağılır ve hidrojen (H) gibi ışık atomlarını Ångström çözünürlüğüne yakın olmayan elektron yoğunluk haritalarında zayıf görünür hale ^getirir2. Buna karşılık, nötronların saçılma yoğunluğu, aynı elemanın izotoplarının farklı saçılma uzunlukları göstermesiyle çekirdekle karmaşık etkileşimlere bağlıdır. Bu nedenle, ışık atomları ve hidrojen (^1H) ve döteryum (^2H veya D) gibi izotopları, nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarındaki omurga karbon, azot ve oksijen atomlarıyla karşılaştırılabilir görünürlüğe sahiptir. Ayrıca, nötron saçılımının büyüklüğü elektron sayısından bağımsız olduğundan, ışık elementlerinden saçılma, X-ışını saçılmalarında da gözlendiği gibi, birbirlerine yakın olduklarında ağır elementler tarafından gizlenmez. Nötron kırınımı kullanırken H ve izotop D'nin gelişmiş görünürlüğü, katalitik olarak önemli kalıntıların, kofaktörlerin ve ligandların protonasyon durumu hakkında değerli bilgiler sağlar ve su moleküllerinin yönlendirilmesine yardımcı olarak katalitik mekanizmalar ve protein kimyası hakkında önemli bilgiler ortaya ^çıkarır3. Nötron kırınımı ayrıca, özellikle metal merkezleri veya ışığa duyarlı redoks kofaktörleri gibi iyonlaşmaya duyarlı biyolojik örneklere uygun tahribatsız bir teknik olma avantajı ^sunar2. Bu makalenin ana odak noktası, yüksek kaliteli bir nötron proteini kristal yapısı elde etmek için iş akışına genel bir bakış sağlamaktır. Nötron protein kırınımının mükemmel bir genel ^{görünümü için ilgili} okuyucuyu Podjarny ve ^ark.4, ^Blakeley5, Blakeley ve ^ark.6 ve O'Dell ve diğerleri için ve nötron saçılımının daha fazla uygulaması için Ashkar ve ^ark.7'ye yönlendiriyoruz.

Nötronlar öncelikle iki işlemden birini kullanan nükleer reaksiyonlar sırasında üretilir: reaktör kaynaklarında nükleer fisyon veya hızlandırıcı tabanlı kaynaklarda ^spallasyon8. Reaktör kaynakları ^{, 235U} izotopun nükleer fizyonunu kullanarak sürekli bir nötron ışını sağlarken, spallation nötron kaynakları bir hedefi, örneğin cıva gibi sıvı bir metali ^protons9 ile bombalayarak darbeli bir nötron ışını üretir. Oak Ridge, Tennessee'deki Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL), Yüksek Akı Izotop Reaktörü'nde (HFIR) hem sabit bir nötron kaynağına hem de Spallation Nötron Kaynağı'nda (SNS) 60 Hz darbeli bir kaynağa ev sahipliği yapmaktadır. HFIR'da bulunan IMAGINE beamline, biyolojik makromoleküller için optimize edilmiş bir nötron difaraktometresidir (Ek Şekil 1)¹⁰. IMAGINE, birim hücre kenarları <150 şolan tek kristallerden 2,8 – 4,5 şaralığında dar bir bandpass kullanarak yarı Laue verilerini ölçmek için bir nötron görüntü plakası dedektörü kullanıyor. SNS'de bulunan Makromoleküler Nötron Difaraktometresi (MaNDi), küresel dedektör dizi çerçevesi (DAF) (Ek Şekil 2)¹¹ ile donatılmış bir uçuş zamanı (TOF) Laue nötron difaraktometresidir. MaNDi, 2.0 – 6.0 Å12 arasında ayarlanabilir 2 şdalga boyu bant genişliği kullanarak 10 – 300 ^{şaralığında} birim hücre kenarlarına sahip tek kristallerden gelen verileri ölçer.

Nötron üretme süreci oldukça enerji yoğundur, bu da senkrotron kaynaklarında X-ışını ışını akılarının aksine nispeten zayıf nötron ışını akılarına neden ^olur13. Veri toplama sırasında yeterli sinyal-gürültü oranlarını sağlamak için uygun boyutta ve kalitede kristaller yetiştirmek ^gerekir14. Tipik olarak, yeterli istatistiklerle veri toplamak için hacimleri 0,1 ^mm3'> kristallere ihtiyaç ^vardır15. Daha düşük akılara ek olarak, nötronlar ve örnek çekirdekler arasındaki etkileşimin doğal özellikleri dikkate ^{alınmalıdır16}. Nötronların saçılma uzunluğu, aynı elemanın izotopları için farklılık gösterir, bir numunenin bölgelerini maskelamak veya vurgulamak için küçük açılı nötron saçılmada (SANS) avantajlı bir şekilde yararlanılabilen bir özelliktir - kontrast ^{eşleştirme17} olarak bilinen bir işlem. Kırınım deneylerinde, H'nin negatif tutarlı nötron saçılma uzunluğu (-1H için-3.741 fm), nötron saçılma yoğunluk haritası özelliklerinin iptaline neden olabilir, çünkü diğer biyolojik olarak ilgili atomların tutarlı nötron saçılma uzunlukları, karbon (^12C için 6.6511 fm), azot (^14N için 9.37 fm), oksijen (^16O için 5.803 fm), fosfor (31P için ^5.13 fm) ve kükürt (32S için 2.804 fm), pozitiftir (Tablo 1)^12,14. Ayrıca, H'nin (25.274 fm) büyük tutarsız saçılma uzunluğu, veri toplama sırasında arka planı artırarak veri kümesinin kalitesini engeller ve veri çözünürlüğünü tehlikeye ^atar7. H tarafından getirilen bu sınırlamaları atlatmak için, nötron kırınımı için, H'yi pozitif tutarlı nötron saçılma uzunluğuna (6.671 fm) ve önemli ölçüde daha düşük tutarsız saçılma uzunluğuna (4.04 fm)¹⁹ sahip izotop döteryumu, ^2H(D) ile değiştirmek gerekir. Bu, proteinin tamamen döterlenmiş ortamda yetişen organizmalar tarafından ifade edildiği ve H sitelerinde D'nin tamamen birleştirilmesini sağlayan bir süreç olan perdeuterasyon ile elde ^edilebilir20. Proteini kısmen döterleme, H'yi sadece değiştirilebilir sahalarda (titretilebilir gruplar) D ile değiştirerek, değiştirilebilir olmayan karbona bağlı bölgeler hidrojene ^{olarak kalırken kısmen} deutere etmek de mümkündür21. Bu, döterlenmiş ana likörde hidrojenize protein kristallerinin büyümesiyle elde ^edilebilir22. Bununla birlikte, en yaygın olarak, hidrojenize proteinlerin H / D değişimi, _H2O bazlı ^tampon23'te uygun büyük kristallerin büyümesini takiben buhar değişimi ile gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, kristaller bir kuvars kılcal damara monte edilir ve _D20 bazlı bir ana likör ile buharla dengelenir.

Nötron kaynaklarındaki sınırlı nötron akıları, günler ile birkaç hafta arasında değişen daha uzun veri toplama sürelerine neden ^oluyor24. ORNL'de hem IMAGINE hem de MaNDi, veri toplamayı optimize etmek için 2-6 şaralığında dar bir dalga boyu bandpası ^kullanır25. Veriler oda sıcaklığında veya kriyo sıcaklığında toplanabilir. Kriyo-veri toplama potansiyel olarak veri kalitesini artırabilir ve dondurarak katalitik ara ürünler için olasılık açar. Nötron kırınım veri toplamayı takiben, bir X-ışını veri kümesi genellikle aynı sıcaklıkta aynı kristalde veya aynı koşullarda yetiştirilen bir kristal üzerinde ^toplanır26. Aynı sıcaklıkta veri toplama, hem X-ışını hem de nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi yapılmasına izin vererek, suların görünürlüğünde ve konumundaki değişiklikler veya alternatif konformasyonlarla kalıntıların doluluğu gibi potansiyel sıcaklık kaynaklı eserleri ^önler27. Ortak X-ışını nötron veri rafine etme veri-parametre oranını artırır ve protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesine izin verme avantajı sağlarken, nötron kırınım verileri H/D atomlarının konumunu iyileştirmek için ^{kullanılır28}. Bu, protein üzerinde değiş tokuş edilemeyen bölgelerde H atomları nedeniyle yoğunluk iptalinin mevcut olduğu kısmen deuterated örnekleri kullanırken özellikle yararlıdır. X-ışını yapılarının sayısı Protein Veri Bankası'nda (PDB) biriken nötron yapılarının sayısını çok aşsa da, başlangıçta X-ray verilerinin iyileştirilmesi için tasarlanan yazılım paketleri nötron verilerinin yanı sıra ^3,29,30'u kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Veri toplamayı takiben modeller phenix.refine, CNSsolve (nCNS) veya SHELXL28,31,32,33 gibi arıtma paketleri kullanılarak geliştirilebilir. Arıtma işlemi sırasında, nötron saçılma yoğunluk haritaları ^COOT34 kullanılarak manuel montaj için görselleştirilebilir. Yapı çözümünü takiben, koordinatlar ve nötron ve/veya X-ışını kırınım veri dosyaları, modeli doğrulayacak ve yatıracak olan PDB'ye gönderilebilir ve bu da genel erişime açık hale ^{getirir18,29,30}.

Proteinlerin yapısal analizi, işlevlerini ve mekanizmalarını araştırmak için çok sayıda tekniğin kullanıldığı çok yönlü bir ^{yaklaşımdır35}. Nötron proteini kristalografisi, X-ışını kırınımı, spektroskopi, nükleer manyetik rezonans (NMR) veya mikro kristal elektron kırınımı (microED)³⁶ gibi ek çalışmalardan elde edilen bulguları genişletmek ve tamamlamak için değerli kimyasal içgörüler sağlar. Nötron protein kırınımı, enzimmatik mekanizmalar hakkında içgörüler sağlamak için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır, çünkü H atomları kimyalarının merkezindedir. Nötronlar tarafından indüklenen radyasyon hasarının olmaması, onları metalloproteinlerin çalışmasına son derece uygun bir prob haline ^getirir37. Burada, numune hazırlamadan veri toplama, arıtma ve analize kadar nötron protein kırınımı sürecinin temsili bir örneğini sunuyoruz (Şekil 1). Metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D) nötron kırınım deneyleri için yeterli büyüklükte kristaller yetiştirilmiştir. Nc LPMO9D, glikosidik bağda oksijen atomu yerleştirilmesi ile recalcitrant selülozun bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloproteindir38,39. NcLPMO9D aktif bölgesi, N-terminal histidin ve ikinci bir korunmuş histidinden oluşan karakteristik bir "histidin-ayraç" içinde mononükleer bakır merkezi içerir (Ek Şekil 3)⁴⁰. Mantar LPMO'larının N terminali metillenmiştir, ancak geçiş sonrası modifikasyon mayadaki rekombinant ekspresyoz sırasında gerçekleşmez. NcLPMO9D dinlenme durumunda, bakır merkezi ^{Cu2 +} oksidasyon durumunda bulunur ve ^Cu1+ için tek elektron azaltımı ile aktive edilir, moleküler oksijenin hızla bir süperoksit türüne indirgenerek bağlanmasına ve aktive edilmesine izin ^verir41,42. Genel NcLPMO9D reaksiyonu, hidroksillenmiş polisakkarit ürününü oluşturmak için bir elektron ve iki protonun daha fazla eklenmesini ^gerektirir43. Polisakkarit substratından hidrojen atom soyutlamasından (HAA) sorumlu aktif oksijen türlerinin kimliği tespit edilememiş diriltilmiş diri dırı dırım ve yoğun yapısal ve hesaplamalı çalışmalar halen devam ^{etmektedir44,45}. NcLPMO9D aktif sahasındaki redoks kimyası göz önüne alındığında, radyasyon hasarının azaltılması özellikle önemlidir. NcLPMO9D yapısını sırasıyla ^46'da, dinlenme durumunda ve etkinleştirilmiş azaltılmış formda belirlemek için NcLPMO9D kristallerinde oda sıcaklığını ve kriyo sıcaklığı veri toplamayı burada gösteriyoruz. Protein kristal montajına, veri toplama için beamline enstrüman kurulumuna, verilerin ve koordinat dosyalarının hazırlanmasına ve tamamen atomlu bir nötron yapısını modellemek için gerekli iyileştirme adımlarına vurgu yapılacaktır.

Protocol

1. Kristal boyutu değerlendirmesi

1. Normal ve polarize ışıkla donatılmış bir mikroskop kullanarak kristallerin boyutunu ölçün. Minimum hacim ~0,1 ^mm3 olan kristalleri seçin (Ek Şekil 4).
2. Yeterince büyük kristallere sahip kuyuları etiketle ve bu kristalleri üretmek için kullanılan kristalleşme koşullarını not edin.

2. Kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponunun hazırlanması

1. D2O'daki kristalizasyon tampon bileşenlerini eriterek kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponu oluşturun.
2. Aşağıdaki denklemi kullanarak çözümün pD'sini hesaplayarak arabelleğin pH'ını ayarlayın:
   (1)
   burada _pHmeas standart bir cam elektrot ile ölçülen pH'dır. NcLPMO9D kristalizasyon tamponunun orijinal pH'ı 6.0 idi, bu nedenle pD 6.0'daki kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponu için 5.6 _pHmeas kullanacağız.
3. pH metre elektrodu kullanmadan önce on dakika boyunca _D2O'ya daldırin (Ek Şekil 5).
4. Baz NaOD veya asit DCl kullanarak _pHmeas'ı 5,6'ya ayarlayın.

3. Kristal hasadı

1. Kristalleşme tepsisinin yanına kristalize 22 mm yuvarlak cam kaydıraklar yerleştirin. Kristal başına temiz bir cam slayt kullanın (Şekil 2A).
2. 9 kuyulu büyük hacimli silikonlu cam plakadaki protein kristallerini içeren kapalı sandviç kutusunu açın.
3. Kristalizasyon rezervuar çözeltisinden bir mikropipette ile 10-20 μL çıkarın ve çözeltiyi cam kaydırağın üzerine yerleştirin (Şekil 2B).
4. Kristali uygun boyutta bir mikroloop kullanarak hasat edin ve kristalle birlikte sık sık hasat edilen kalıntıları gidermek için kristali cam kaydırağın üzerindeki rezervuar çözeltisi damlasına yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 2D).
   NOT: Küçük hacimli damlacıklar buharlaşabileceğinden hızlı bir şekilde çalışmak gerekecektir. Hasat edilen kristaller de atmosfere maruz kaldıklarında kuruma riski altındadır. Kristallerin küçük kristalleşme damla hacimlerinde kurumasını önlemek için protein damlasına bir miktar rezervuar çözeltisi eklemek gerekebilir.

4. Kristal montajı

NOT: Kılcal montaj protokolleri deneysel tercihlere göre değişiklik gösterir. Kristallerin zarar görmesini önlemek için, kısaltılması gereken kılcal damarlar, pürüzsüz bir kırılma sağlamak için bir kesme taşı veya zımpara kağıdı ile puanlanmalıdır.

1. 2 mm çapında 50 mm uzunluğunda kuvars kılcal damarın bir ucunun bir ucunun kılcal damar etkisiyle veya doğrudan kılcal damara ~10 μL rezervuar tamponu pipetleme ile rezervuar tamponu ile doldurun (Şekil 3A).
   NOT: Kullanıcılar kuvars kılcal borulardan yararlanmaya teşvik edilir, çünkü mekanik mukavemetine ek olarak, nötron ışını emilimini ve kılcal damardan daha düşük arka plan katkılarını sınırlamak önemlidir. Cam kılcal damarlar yüksek arka plan sunar ve veri kalitesinden ödün vererek nötronları emer.
2. Kristali montaj halkasını kullanarak kuvars kılcal damardaki rezervuar tamponuna hafifçe yerleştirin (Şekil 3B ve Şekil 3C).
3. Rezervuar tamponu ve orada batırılmış kristali kılcal damardan aşağı taşımak için tüpe hafifçe dokunun (Şekil 3D).
4. Kristali kılcal damarın bir ucundan 13,5 mm'den daha yakın ve 27,5 mm'den daha fazla yerleştirmeyin; bu montaj ucu olacaktır (Tamamlayıcı Şekil 6).
5. Kristalin etrafındaki tampon çözeltisini uzun ince bir pipet ucu kullanarak epire edin ve kristali hafifçe ıslak bırakın. Kristale dokunmayın (Ek Şekil 7A).
6. Kılcal duvarları ince bir kağıt fitil ile kurulayın (Ek Şekil 7B).
7. Pipet 20-50 μL sönmüş tampon çözeltisi montaj ucunun karşısındaki kılcal damarın ucuna (Şekil 4A).
8. Alemini bir ısı "değneği" ile eritin ve kılcal damarları bu erimiş aeswax'a hafifçe yerleştirin. Hava geçirmez bir conta oluşana kadar tekrarlayın (Şekil 4B ve Şekil 4C).
9. Pipet çok az miktarda sönmüş tampon, kılcal damarın montaj ucunda yaklaşık 5 μL sıcak arı su birikintisi için bir "ısı emici" görevi görür. Her iki ucuna da kapatılmış bir kılcal damar oluşturmak için daha önce açıklandığı gibi hava geçirmez bir conta oluşturmak için bu ucu eritilmiş beeswax'a batırın (Şekil 4D).
10. Hava geçirmezliği sağlamak için monte edildikten sonra bir mikroskop kullanarak monte edilmiş kristali inceleyin (Şekil 4E).
11. Monte edilen kristalleri 15 ml Falcon tüpü veya Petri Kabı gibi bir kapta Kim mendilleriyle dikkatlice sabitleyin ve kristallerin yetiştirildiği sıcaklıkta yatay olarak saklayın (Şekil 4F).

5. Buhar değişimi

1. Kısırlaştırılmış tamponu kristal montajından iki gün sonra taze tamponla değiştirin.
2. Balmumu contasını kristalden en uzağa bir ısıtma halkası ile eritin ve tamponu çıkarmak için bir pipet ve kağıt fitil kullanın.
3. Kılcal damarı 20-50 μL döterlenmiş tampon çözeltisi ile yeniden doldurun ve balmumu ile kapatın.
4. Döterlenmiş tampon buhar değişiminin tamamlandığından emin olmak ve en az iki hafta boyunca buhar değişimine izin vermek için döterlenmiş tampon değişimini dört gün aralıklarla iki kez daha tekrarlayın.

6. Nötron protein kırınımı

NOT: IMAGINE ışın hattı özellikleriyle ilgilenen okuyucuların Meilleur ve ark. 2013, Meilleur ve ark. 201810,47'ye danışmaları teşvik edilir.

1. HFIR'daki IMAGINE beamline'da oda sıcaklığı veri toplama
   1. Örnek montaj
      1. Kılcal damara monte kristali goniometreye macunla sabitleyin.
      2. Goniometreyi numune çubuğuna monte edin ve kristali off-line hizalama istasyonunu kullanarak kirişe ortalayın.
      3. Numune çubuğunu cihaz numune aşamasına sabitleyin (Ek Şekil 1B).
      4. Deneysel mandalın boşaldığından emin olun ve nötron veri toplama için kiriş çizgisi deklanşörunu açın.
   2. Veri toplama
      1. Işın çizgisi denetim bilgisayarında veri toplama programını açın ve veri toplama stratejisini ayarlamak için Kur sekmesini tıklatın. Deneme Parametreleri'nin altına Örnek Adın yanına örnek adı yazın ve Teklif'in yanına teklif numarasını girin. Resim Adlandırma altında Klasör şablonünü seçin ve elde edilen verilerin kaydedilecek hedefini ayarlayın ve Görüntü Öneki'ni seçin ve ilgili çerçeve adını yazın (Tamamlayıcı Şekil 8).
      2. Optik GUI'yi açın ve veri toplama için yarı Laue aralığını ayarlamak için _φmin için 2.78 ve _φmax için 4.78'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 9).
      3. Topla sekmesine geçiş yapın ve Sonraki Tarama Parametreleri'nin altına Pozlama altında pozlama süresini saniyeler içinde, N Çerçeveleri altındaki kare sayısını ve Δ φ/Kare altındaki veri toplama açılarını ekleyin. Görüntü Öneki altında toplanacak çerçeveyi adlandırın ve Taramayı Başlat düğmesini (Tamamlayıcı Şekil 10) tıklatarak veri toplamayı başlatın.
      4. Dağınık nötronlar Görüntü Plakası Dedektörü tarafından tespit edilecektir. Her pozlamanın sonunda, görüntü plakası okunacak ve desen veri toplama GUI'sinde görüntülenecektir (Tamamlayıcı Şekil 11).
      5. Çerçeveler, kullanıcıya veri toplamayı takiben birleştirilmiş yansıma dosyasını sağlayacak sorumlu beamline bilim adamı tarafından Lauegen, ^Lscale50 ve Scala kullanılarak dizine dahil edilir, entegre edilir, dalga boyu normalleştirilir ve ölçeklendirilir (Tamamlayıcı Şekil 12).
         NOT: Hem IMAGINE hem de MaNDi'de veri toplama, Helliwell ve ^ark.48 ve Nieh ve ark.49 tarafından geliştirilen Laue kırınım veri toplama için geliştirilen metodoloji ve yazılım kullanılarak yarı Laue modunda gerçekleştirilecektir.
      6. Nötron kırınımı veri toplamayı takiben aynı sıcaklıkta aynı kristal üzerinde karşılık gelen bir X-ışını veri kümesi toplayın (Tamamlayıcı Şekil 13).
         NOT: Aynı damladan veya aynı kristalizasyon koşullarında yetiştirilen bir kristal, eklem nötron/X-ışını arıtma için X-ışını kırınım verilerini toplamak için de kullanılabilir.
2. SNS'deki MaNDi kiriş hattında cryo veri toplama
   NOT: Işın çizgisi özellikleriyle ilgilenen okuyucuların Coates ve ark. (2015), Meilleur ve ark. 201810,11'e danışmaları teşvik ^edilir.
   1. Örnek montaj
      1. Kristallerin ve döterlenmiş kriyoprotektörün azaltılması için döterlenmiş askorbat ıslatma çözeltisini hazırlayın. Bu çözeltilerin her birinin 20 μL damlalarını bir kristalizasyon plakasına oturtma kuyularına yerleştirin.
         NOT: Kriyoprotektif çözeltisi genellikle _D2O'da hazırlanan kriyo sıcaklık X-ışını kırınım veri toplama için etkili olduğu kanıtlanmış kriyoprotektanttır. Bu kriyoprotektant, gerekirse nötron veri toplama için daha da optimize edilebilir (örneğin konsantrasyon).
      2. Örnek montajı için döngüleri seçin ve MaNDi yönergelerini izleyerek manyetik kriyo tabanına takın (Tamamlayıcı Şekil 14).
      3. Köpük kriyo-Dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun. Soğutmak için sıvı nitrojenin içine metal bir kriyo koruma manşonu yerleştirin (Ek Şekil 15A).
      4. Balmumu tıkaçlarını kılcal damarın her iki ucundan çıkarın ve tampon fişini hareket ettirmek için kılcal damara dokunun, böylece monte edilen kristal tampona batırılır. Kristali, oturma damlasındaki 20 μL rezervuar çözeltisi damlasına yıkayın (Ek Şekil 15B ve Tamamlayıcı Şekil 15C).
         NOT: Kristalizasyon damlalarının döterlenmiş tampona karşı dengelenmesi veya kristalin kısırlaştırılmış tampona doğrudan batırılması ile H/D değişimi yapıldıysa bu adım gerekli değildir.
      5. Kristali iki saat boyunca askorbat ıslatma çözeltisinin içine daldır. Kristali manyetik kriyo tabanına bağlı bir mikroloop içine monte edin. Monte edilen kristali kriyoprotektantın içine 10 saniye daldırın ve kristali ve kriyo yuvasını donmak üzere sıvı nitrojene daldırın (Ek Şekil 15D).
      6. Kristal dondurulduktan sonra, önceden soğutulmuş kriyo pim maşası kullanın ve kristali bir kriyo akışı ile donatılmış MaNDi örnek aşamasına monte edin. Kriyo pim maşasını yavaşça açın ve kristalin kriyo akışında kaldığından emin olun (Ek Şekil 2C).
   2. Veri toplama
      1. Deneme bilgilerinin otomatik olarak doldurulacağı veri toplama yazılımını açın.
      2. Kristalin ortasına tıklayarak bilgisayar kontrollü goniometre ile ortalanın (Ek Şekil 16).
      3. Tablo altında, "phi" altında veri toplama açılarının yanı sıra Değer (Tamamlayıcı Şekil 17) altında kare başına toplam nötron ışını pozlamasını girerek veri toplama stratejisini ayarlayın.
      4. Veri toplamayı başlatmak için Gönder'e tıklayın.
      5. Veriler toplanırken, dağınık nötron görünür olacaktır (Tamamlayıcı Şekil 17). Pozlama süresi arttıkça kırınım noktaları daha net hale gelecek ve sinyal-gürültü oranını artıracaktır (Şekil 5).
      6. Çerçeveler, veri toplamayı takiben kullanıcıya birleştirilmiş yoğunluk dosyasını sağlayacak sorumlu beamline bilim adamı tarafından Mantid ve Lauenorm kullanılarak dizine eklenecek, entegre edilecek, dalga boyu normalleştirilecek ve ^{ölçeklendirilecek51}.

7. Yapı iyileştirmesi

1. Ortak X-ışını ve nötron veri iyileştirmesi
   1. Yapı hazırlığı
      1. Tamamlanmış bir yapı elde etmek için fenix.refine yazılım paketini ve manuel oluşturma için Coot'u kullanarak bir protein yapısı elde etmek için X-ışını verilerini iyileştirin.
      2. CCP4'ü açın ve nötron verilerinin R-free veri bayraklarını X-ray verilerinin bayraklarıyla eşleştirmek için MTZ'ye Dönüştür/değiştir/genişlet programını seçin. Yansıma dosyasını MTZ biçiminde almak için seçin. In altında elde edilen nötron MTZ dosyasını yükleyin ve X-ray mtz dosyasını Import FreeR MTZ (Tamamlayıcı Şekil 18) altında yükleyin. Dışarı'nın altında yeni MTZ dosyası için bir ad verin ve Çalıştır'ı tıklatın.
      3. Phenix yazılım paketini açın ve İyileştirme Araçları altında ReadySet'e tıklayın. PDB dosyasının yanına, X-ray verilerine göre geliştirilmiş PDB koordinat dosyasını yükleyin. Yoksa modele hidrojen eklemek için seçin ve değiştirilebilir sitelerde H/D'yi seçin, açılan menüden H başka bir yerde . Solvent moleküllerine döteryum ekle'yi seçin ve kalan seçenekleri varsayılan değerleri üzerinde bırakın (Tamamlayıcı Şekil 19A).
         NOT: Perdeuterated protein kullanılıyorsa, yoksa modele hidrojen ekle seçeneğini belirleyin ve değiştirilebilir bölgelerde, D'yi başka bir yerde seçin.
   2. Yapı iyileştirmesi
      1. Hem X-ray hem de nötron verilerini kullanarak iyileştirmeyi ayarlamak için İyileştirme sekmesinin altındaki phenix.refine programını açın. Giriş dosyalarındaki Yapılandır sekmesinde, ReadySet ile işlenen X-ray yapısından PDB dosyasını ve ilgili ligandlar için gerekli CIF kısıtlama dosyasını girin. MTZ dosyasını CCP4 kullanılarak atanan Rfree bayraklarıyla nötron verilerinden yükleyin ve bunu Veri türü başlığı altında "Nötron verileri" ve "Nötron R-free" olarak atayın. MTZ dosyasını X-ray verilerinden yükleyin ve bunu Veri türü başlığı altında "X-ray data" ve "X-ray R-free" olarak atayın. Veriler yüklendikten sonra Alan grubu ve Veri etiketleri otomatik olarak doldurulur (Tamamlayıcı Şekil 19B).
         NOT: Arıtmayı gerçekleştirirken ve kristal bilgilerini girdiğinizde, X-ışını verilerinden belirlenen birim hücreyi kullanın.
      2. İyileştirme ayarlarındaki Yapılandır sekmesinin altında standart iyileştirme stratejisini koruyun. Döngü sayısını beşe çıkarın (Tamamlayıcı Şekil 20)
      3. Tüm parametreleri seçin, Gelişmiş'e tıklayın ve Hidrojenler'i seçin.... Hidrojen arıtma modelini tek tek değiştirin ve Kuvvet sürme adp'yi kapatın (Tamamlayıcı Şekil 20).
      4. Tüm parametreler'i seçin ve Parametreleri ara seçeneğini açın. Nükleer kelimesini arayın ve X-H/D için nükleer mesafeleri kullanmayı seçin (Ek Şekil 20).
      5. İyileştirmeyi başlatmak için Çalıştır'ı seçin.
   3. Model oluşturma
      1. Phenix'teki iyileştirmenin ardından, X-ışını elektron yoğunluğunu ve nötron SLD haritalarını görselleştirmek için Sonuçlar sekmesindeKi Coot'ta Aç'a tıklayın. Görüntü Yöneticisi sekmesine tıklayın ve Haritalar'ın altında nötron haritalarını kaldırmak için haritaları _neutron yanındaki Haritayı Sil'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 21). Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs...'a tıklayın. Geçerli iyileştirme dosyalarını seçin ve .mtz dosyasını açın. Hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden 2FOFC WT_no_fill_neutron verilerini seçin. Bunu tekrarlayın ve _FOFC WT_neutron verilerini açın. Ekran Yöneticisi'ni açın ve hem nötron hem de X-ray 2FOFCWT eşlemeleri için Kaydırmak üzere geçiş yapın, ardından 2FOFCWT eşlemelerinin rmsd'sini 1,00'e düşürün (Ek Şekil 21). Hem nötron hem de X-ışını _FOFCWT haritaları için Kaydırmak için geçiş yapın ve _FOFCWT eşlemelerinin rmsd'sini 3.00'e düşürün.
      2. Modelin verilere uyup uymadığını belirlemek için kalıntıların görsel incelemesini gerçekleştirin. Fark yoğunluk haritası zirvelerini analiz ederek değiştirilebilir tüm sitelerin doğru yönlendirmesini ve H/D doluluğunu belirleyin. Bu serines, threonines ve tirozin hidroksil gruplarını içerir; histidin, glutamin, kuşkonmaz ve lizin azot; sistein sülfhidrit; karboksil grup aspartat ve glutamat; omurga amid grupları; ligandlar; kofaktörler ve olası fonksiyonel kalıntılar (Şekil 6).
      3. Su moleküllerini nötron yoğunluğuna ve hidrojen bağı etkileşimlerine göre Döndürme Tercüme Bölgesi/Zincir/Molekül özelliği kullanılarak döndürerek yeniden yönlendirin (Tamamlayıcı Şekil 22A ve Tamamlayıcı Şekil 22B). Chi Açılarını Düzenle aracını ve Çevirme Bölgesini/Zinciri/Molekülü Döndür özelliğini (Tamamlayıcı Şekil 22C ve Tamamlayıcı Şekil 22D ) kullanarak protein kalıntısı H/D değiştirilebilir bölgelerinin konumlarını ayarlayın.
2. Yapı iyileştirmesi – nötron verilerine özel iyileştirme
   1. Yapı hazırlığı
      1. Phenix'i açın ve "Moleküler Değiştirme" yi seçin ve pdb formatında bir başlangıç koordinat dosyası oluşturmak için cihaz bilimcisi tarafından moleküler değiştirme ile sağlanan ölçeklenmiş yoğunlukların aşamasını türetmek için "Phaser-MR (tam özellikli)" seçeneğini seçin. Başlangıç pdb yapısını "Giriş ve genel seçenekler sekmesine girin ve Topluluklar, ASU içeriği ve Arama Prosedürü seçeneklerini tamamlayın.
      2. Model araçlarını açın ve PDB Araçları'nı seçin. pdb dosyasını Giriş dosyası olarak ekleyin. Seçenekler sekmesine gidin ve Atom seçimini kaldır'ın altında çözücü, ligandlar, kofaktörler ve metallerin adlarını seçin. Bu, minimum bir model oluşturmak için tüm su moleküllerini, kofaktörleri, ligandları ve metal iyonlarını ortadan kaldırır. Ayrıca, Modelden alternatif konformatörleri kaldırmak için seçin (Tamamlayıcı Şekil 23).
      3. Fenix'te İyileştir'i seçin ve ReadySet'i açın. Düzenlenen pdb koordinat dosyasını PDB dosyasının yanına girin. Yoksa modele hidrojen eklemek için seçin ve değiştirilebilir sitelerde H/D'yi seçin, Nötron arıtma seçeneklerinin açılır menüsünden başka bir yerde H (Tamamlayıcı Şekil 23).
   2. Yapı iyileştirmesi
      1. Phenix'teki arıtma sekmesinin altındaki phenix.refine programını açın. Yapılandır sekmesinde, Giriş dosyaları kutusunun altında ReadySet ile işlenen PDB dosyasını girin. Giriş dosyaları kutusunda nötron verilerinden MTZ dosyasını yükleyin ve nötron verileri olmasına rağmen Veri türü sütunu altında X-ray verileri ve X-ray R-free olarak atayın. Bir sonraki adımda ayarlanan iyileştirme yapılandırması, yansıma dosyasını nötron verisi olarak ele almak için kullanılacaktır. Veriler yüklendikten sonra Alan grubu ve Veri etiketleri otomatik olarak doldurulur (Tamamlayıcı Şekil 24A).
      2. İyileştirme ayarlarındaki Yapılandır sekmesinin altında standart iyileştirme stratejisini koruyun. Döngü sayısını beşe çıkarın. Diğer seçenekler'in altında Saçılma tablosu açılır menüsünden nötron seçin. Suları güncelleme seçeneğinin seçimini kaldırın (Ek Şekil 24B).
      3. Tüm parametreler>Advanced>Hydrogens'i seçin. Yeni pencerede Hidrojen arıtma modeli açılır menüsünden Bireysel'i seçin ve Kuvvet sürme adp'yi kapatın (Tamamlayıcı Şekil 20).
      4. Arama parametreleri > Tüm parametreleri seçin... seçenek. Nükleer kelimesini arayın ve X-H/D için nükleer mesafeleri kullanmayı seçin (Ek Şekil 20).
      5. İyileştirmeyi başlatmak için Çalıştır'ı seçin.
         NOT: İlk iyileştirmeyi takiben, nötron SLD haritalarını görsel olarak incelemek ve Coot'ta manuel model oluşturma gerçekleştirmek gerekecektir. Modelde bulunan ligandları/kofaktörleri yerleştirmek gerekebilir. Sonraki iyileştirmeler, ilgili ligandlar için gerekli CIF kısıtlama dosyasını gerektirir ve bunlar phenix.refine'nin Yapılandır sekmesinde yüklenmelidir.
   3. Model oluşturma
      1. Phenix'teki iyileştirmenin ardından, nötron SLD haritalarını ve yapısını görselleştirmek için Sonuçlar sekmesindeKi Coot'ta Aç'a tıklayın. Hem 2FOFCWT hem de FOFCWT haritalarını silmek için Görüntü Yöneticisi sekmesine tıklayın ve Haritalar Haritayı Sil'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 25). Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs...'a tıklayın. Geçerli iyileştirme klasörünü seçin ve .mtz dosyasını seçin. Hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden 2FOFC WT_no_fill verilerini seçin. Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs... seçeneğine tıklayarak tekrarlayın ve hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden FOFCWT verilerini seçin. Ekran Yöneticisi'ni açın ve _2FOFC WT_no_fill eşlemesi için Kaydırma'ya geçiş açın, ardından _2FOFC WT_no_fill verilerinin rmsd'sini 1,00'e düşürecek şekilde kaydırın (Tamamlayıcı Şekil 25). _FOFCWT eşlemesi için Kaydırma'ya geçiş ve _FOFCWT verilerinin rmsd'sini 3,00'e azaltmak için kaydırın.
      2. Modelin nötron SLD haritasına uyup uymadığını belirlemek için protein yapısının görsel incelemesini gerçekleştirin.
      3. 7.1.3.2'de açıklandığı gibi, H/D değiştirilebilir sitelere sahip kalıntı ve grupların doğru oryantasyonunu ve H/D doluluğunu belirleyin. Çevir'i Döndür aracını ve Ki Açılarını Düzenle'yi kullanarak kalıntı konumlarını ayarlayın (Şekil 6). Gerekirse, Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi kullanılabilir. Doğru atom koordinatlarını eklemek için metin düzenleyicisini kullanarak kalıntıdan patlayan D atomlarını el ile düzeltin
         NOT: Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi Coot nötron SLD haritaları için optimize edilmemiştir ve D'ye bağlı atomlar için düzensiz bağ uzunluklarına neden olabilir, patlama artıkları olarak adlandırılan (Ek Şekil 26). Gerekli atomik koordinatları manuel olarak düzenlemek ve Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi'nin kullanımından kaçınmak tercih edilir.
      4. Su moleküllerini nötron yoğunluğuna göre yerleştirin ve yeniden yönlendirin. Coot'a su eklemek için İşaretçiye atom yerleştir simgesini seçin ve bir su molekülü eklemeyi seçin (Tamamlayıcı Şekil 27A). Coot varsayılan olarak bu konuma bir O atomı yerleştirilecektir.
      5. Coot'a yerleştirilen suların O atomlarına D atomları eklemek için Phenix kullanın. İyileştirme menüsünü açın ve ReadySet'i tıklatın. Nötron Arıtma Seçenekleri'nin yanında sadece solvent moleküllerine döteryum ekleme seçeneğini belirleyin. Seçimi Kaldırın Yoksa modele hidrojen ekleyin (Tamamlayıcı Şekil 27B ve Tamamlayıcı Şekil 27C).
         NOT: Sadece nötron verilerini kullanan model oluşturma, eklem X-ışını/ nötron yapısının model oluşturmasından farklıdır, çünkü omurga ve daha ağır atomların koordinatlarının iyileştirilmesine katkıda bulunacak bir X-ışını verisi yoktur. Ortak bir arıtmada, elektron yoğunluk haritası başlangıçta protein omurgasını ve yan zincir koordinatlarını belirlemek için kullanılır. Bu model daha sonra H/D atomlarının yöneliminin ve doluluklarının nötron SLD haritasından türetildiği ortak bir X-ışını/nötron veri iyileştirmesinde kullanılır. Sadece nötronlu bir arıtmada, tüm yapı, H/D atomlarına ek olarak su moleküllerinin, omurganın, yan zincirlerin ve ligandların inşasını gerektiren nötron SLD haritalarının analizinden türetilmiştir (Şekil 6). Veri-parametre oranı sadece nötron verilerine karşı iyileştirmelerde düşüktür ve verilere aşırı sığmamak için dikkatli olunmalıdır.

Results

Neurospora crassa'dan (NcLPMO9D) bir litik polisakkarit monooksijenazın kristalleri üzerindeki nötron kırınım verileri, yukarıda açıklanan protokolün ardından kriyo koşulları altında oda sıcaklığında HFIR'da imagine'de ve SNS'de MaNDi'de toplanmıştır. _H2O bazlı tamponda yetişen ve hacmi 0,1 ^mm3'ten büyük olan hidrojenize proteinin kristalleri kullanılmıştır (büyük kristallerin açıklayıcı örneği Ek Şekil 4'te ve daha sonra şekillerde gösterilmiştir). Kristaller kuvars kılcal damarlarına monte edilmiş ve _D2O bazlı tampon ile buhar değişimi veri toplamadan önce üç hafta boyunca gerçeklenmiştir (Şekil 4).

IMAGINE kiriş hattında oda sıcaklığı veri toplama işlemi gerçek gerçekleştirildi (Şekil 1). Dört saatlik beyaz ışın testi, kristalin tam bir veri kümesinin toplanması için uygun boyutta ve kalitede olduğunu öne süren yüksek çözünürlüklü kırınıma yol açtı. Kristalin kırınım kalitesi hakkında ön bilgi sağlamanın yanı sıra, ilk geniş bandpass maruziyeti kırınım desenini indeks etmek ve kristal oryantasyon matrisini belirlemek için kullanılabilir. Kristalin _P21

Discussion

Nötron proteini kristalografisi, proteinlerde protonasyon durumlarını ve su molekülü yönelimini araştırmak için oldukça hassas bir tekniktir. Bu bilgi protein katalitik mekanizmalarına ışık tutar, çünkü protonasyon ve hidrojen bağlanma etkileşimlerindeki değişiklikler genellikle enzim kimyası için ^merkezidir10. Nötron proteini kristalografisi, bilgilendirici bir teknik olsa da, nötron kırınım deneyi yapmayı planlamadan önce dikkate alınması gereken bir dizi faktöre sahiptir, yani:

1. Veri toplama için büyük protein kristalleri gereksinimi.
2. Hidrojenin ve metal iyonları gibi diğer elementlerin saçılma özellikleri.
3. Kısırlaştırılmış örneklerle çalışırken yapı iyileştirme ve model oluşturma yazılımındaki sınırlamalar.

Nötron proteini kristalografisi akı sınırlı bir tekniktir. X-ışını kırınım veri kümelerinin aksine, nötron veri kümeleri için doğal sınırlamalar (akı sınırlı, yarı Laue, daha uzun dalga boyları) nedeniyle nötron veri kümeleri için daha yüksek R faktörleri ve daha düşük tamlık, artıklık ve sinyal-gürültü oranları beklenmektedir. Tek bir çerçevenin veri toplaması genellikle 12 - 18 saattir. Bir deneyin başarısı, genellikle minimum gereksinim olan 0,1 ^mm3 kristallerle numune boyutuna ve kalitesine oldukça ^bağlıdır3. Nötron kırınımı, 10 ila 800 μL arasında değişen kristalizasyon damlaları kurmak için büyük miktarlarda protein üretimi gerektirir. Yeterince büyük kristaller yetiştirmek için minimum hacim, kristal ve numune parametreleri (https://neutrons.ornl.gov/imagine) verilen bir Hacim Hesaplayıcısı kullanılarak tahmin edilebilir. Büyük kristallerin büyümesi en yaygın olarak buhar difüzyonu ^{ile gerçeklenmiştir3}. Asılı damla kristalizasyonu, kristallerin 10-25 μL arasında değişen büyük damlalarda büyümesine izin verirken, ~ 50 μL'ye kadar değişen daha büyük damlalar ticari olarak mevcut oturma damlası ^{ekipmanı14,54} kullanılarak ayarlanabilir. Silikonize dokuz kuyulu cam plakalar, 800 μL'ye kadar hacimlerle çok büyük damlalar kurmak için kullanılabilir. Bu cam tabaklar, Hampton Research'ün ticari olarak kullanabileceği "sandviç kutularına" yerleştirilir. Diğer kristalizasyon teknikleri, damla boyutunun sınırının gemi tarafından dikte edildiği toplu kristalizasyonu içerir. Toplu kristalizasyon deneyi kurulumu mikrolitrelerden mililitrelere kadar ^{değişebilir55}. Kristalizasyon, proteinin bir diyaliz zarı aracılığıyla çökelti ile denge edildiği diyaliz tekniği kullanılarak veya çökelti konsantrasyon gradyanı boyunca veya agarose56,57 gibi gözenekli bir tıkaç aracılığıyla karşı difüzyon ile de gerçekleştirilebilir. Tohumlama, istenen hacimde kristaller elde etmek için başka bir alternatif sunar. Mikro ve macroseeding, NcLPMO9D45'in büyük kristali de dahil olmak üzere büyük kristal büyümesi için başarıyla ^edilmiştir. Sıcaklığın çözünürlük üzerindeki etkisi de dahil olmak üzere protein faz diyagramı hakkında bazı bilgiler, büyük kristal büyümesine yardımcı oluyor.

Nötron kırınım deneyi planlarken, kırınım veri toplama sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için protein hazırlığının optimizasyonu ^esastır7. H atomlarının neden olduğu yoğunluk iptalini ve yüksek tutarsız saçılmaları atlatmak için nötron SLD haritaları, pozitif tutarlı saçılma uzunluğuna ve düşük tutarsız saçılma uzunluğuna sahip olan Izotop D'siyle H atomları değiş tokuş edilerek geliştirilebilir. Bunu başarmak için hidrojenize protein kristalinin döterlenmiş kristalleşme tamponuna karşı buhar değişimi gerçekleştirilir. Bu, çözücü moleküllerin ve labile, titrilebilir protein H atomlarının H/ D değişimini ^sağlar23. Buhar değişimi, hidrojenize kristalin _D2O bazlı, döterlenmiş kristalleşme tamponu "fişleri" ile bir kuvars kılcal damara monte edilmesiyle gerçekleştirilir ve en sık uygulanan etkili, nazik bir tekniği temsil eder14,23,35. Değişim birkaç hafta sürebilir ve tercihen maksimum H/D değişimini sağlamak için deuterated arabelleğin sık sık değiştirilmesini gerektirir. H/D değişimi, kristalin doğrudan sönmüş tampona batırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. _D2O maruziyeti nedeniyle kristalin stres altında kalmasını önlemek için, emme işlemi _D2O:H2O oranının artarak kademeli olarak gerçekleştirilmesi ^gerekir58. Buna ek olarak, hidrojenize proteinin kristalizasyonu labile H bölgelerinde H/D değişimi için döterlenmiş tamponda da ^{yapılabilir22,59}. Bununla birlikte, _D2O tabanlı tamponun bilinen _H2O tabanlı koşulların daha fazla ayarlandırılmasını gerektiren protein çözünürlüğü üzerinde bir etkisi olduğu belirtilmelidir3,59. _D2O bazlı tamponların da bazı durumlarda daha küçük kristallere yol açacağı gözlenmiştir59. Titretilebilir ve karbona bağlı H atomlarının D ile tam değişimi, perdeuterated bir örnek oluşturmak için kısırlaştırılmış ortamdaki proteinlerin ifade edilmesiyle elde ^edilebilir20. Perdeuterated numunenin elde edilen nötron SLD haritaları önemli ölçüde iyileştirilecek ve artık hidrojene numune muadili yoğunluk iptalini görüntülemeyecektir. Bu, bir protein veya kofaktörde değiş tokuş edilemeyen bölgelere bağlı H / D'yi karakterize ederken faydalıdır. Bununla birlikte, perdeuterated proteinin ekspresy ekspresy ifadesi hem maliyeti yüksektir hem de verimi ^{düşüktür60}. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL) Yapısal Moleküler Biyoloji Merkezi (CSMB), perdeuterated örnek (https://www.ornl.gov/facility/csmb) oluşturmak isteyen kullanıcılar için bir döterasyon olanağı sunmaktadır. Perdeuterated ekspresyon tipik olarak 1 L ölçeğinde bir biyoreaktörde gerçekleştirilir ve ~50 mg saflaştırılmış ^protein61 verir.

Nötron kırınım verilerinin toplanmasının ardından arıtma ve interaktif model oluşturma işlemi gerçekleştirilir. İyileştirme, phenix.refine, nCNS veya SHELXL28,31,32,33 dahil olmak üzere birden fazla yazılım paketi kullanılarak çalıştırılabilir^. Phenix paketi, modeli nötron SLD haritalarından manuel olarak oluşturmak için kullanılan Coot ile birlikte nötron kırınım verilerinin iyileştirilmesi için en yaygın kullanılan ^{yazılımdır34}. Hem Phenix hem de Coot nötron kırınım verilerinin işlenmesine izin verse de, nötron verileri ve kısırlaştırılmış örneklerle ilişkili özellikleri işlemek için gerekli bazı özelliklerden yoksun olabilirler. Örneğin, Coot, "Gerçek Uzay Rafine Etme" özelliği "patlayan" kalıntılarla sonuçladığı için model oluşturma sırasında komplikasyonlara yol açabilecek, kısırlaştırılmış kalıntılar için geometri optimizasyonu içermez (Ek Şekil 26)⁶². Bu, tüm kısırlaştırılmış kalıntılar için kısıtlama dosyaları oluşturularak çözülebilir. Ancak, bu yoğun bir işlemdir ve bu tür kitaplıklar şu anda herkese açık değildir. Phenix'te iyileştirmeler yapılırken, değiştirilebilir H/D siteleri başlangıçta H ve D için 0,50 doluluk olarak ayarlanacaktır. Arıtmalar yapıldıkça, H ve D'nin doluluğu nötron SLD haritalarına göre iyileştirilecektir. İnteraktif model oluşturma sırasında, fark yoğunluğu _Fo-Fc haritaları H / D doluluklarını değerlendirmede çok bilgilendiricidir. Haritalar, hangi sitelerin yüksek D doluluğuna sahip olduğunu belirlemek için kullanılabilir, bu da özellikle protonasyon durumlarının katalitik olarak ilgili olduğu aktif sitede ^{bilgilendiricidir63}. Belirsiz durumlar ortaya çıkar, ancak, H:D doluluk 0.70:0.30'a yakındır ve bu da nötron SLD haritalarında tam sinyal iptali ^{ile sonuçlanır64}. Ayrıca, yarı Laue nötron veri setlerinin genellikle X-ışını kırınım verileri için rutin olarak gözlenenden ≥% 98'den daha düşük olan% 80 civarında bütünlüğe sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Phenix nötron kırınım verileri iyileştirilirken, eksik gözlemlenen genlikler (_Fo) bu nedenle yansıma listesini tamamlamak için modelden hesaplanır, böylece model önyargısı ortaya çıkarır. Bu potansiyel önyargıyı hesaba katmak için "no_fill" haritaları , "doldurulmuş" haritaların aksine etkileşimli model oluşturma sırasında incelenmelidir.

Kullanıcılar, yapılarının ortak bir X-ışını/nötron veri iyileştirmesini veya yalnızca nötron verilerinin iyileştirilmesini gerçekleştirmeyi seçebilir. Nötron SLD haritalarını özellikle daha düşük çözünürlükte görselleştirmek, özellikle H/D buhar değişimine rağmen H'nin hala değişemeyen yerlerde bulunduğu hidrojenize bir protein için başlangıçta rahatsız edici olabilir. Bu, nötron yoğunluğu haritası iptalleriyle sonuçlanır ve süreksiz haritalar ^{izlenimi verir65,66}. karşılık gelen bir X-ray veri kümesinin toplanması, bu iptalleri ortak bir iyileştirmede avantajlı bir şekilde tamamlar (Şekil 13A ve Şekil 13B). Ortak iyileştirme stratejisi tipik olarak protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesini içerirken, nötron kırınım verileri değiştirilebilir sahalarda H/D atomlarının konumunu ve doluluğunu iyileştirmek için ^{kullanılır28}. Değiştirilebilir sahalarda ortak H/D doluluğunun getirilmesi rafine edilen parametrelerin sayısını artırdığından, X-ray verileriyle ortak bir iyileştirme de veri-parametre oranını artırır. Bir eklem iyileştirmesi, karşılık gelen bir X-ışını veri kümesinin aynı kristal veya aynı koşullar altında yetiştirilen bir kristal üzerinde aynı sıcaklıkta toplanmasını gerektirir. Oda sıcaklığında (300K) toplanan nötron kırınım verileri için, ilgili X-ışını veri kümesi, radyasyon hasarını sınırlamak için düşük doz veri toplama stratejisi kullanılarak oda sıcaklığında toplanmalıdır. Perdeuterated numuneler, aksine, aynı büyüklükte H/D sinyal iptali olmadığı için geliştirilmiş ve sürekli nötron SLD haritaları sağlar. Bununla birlikte, metaller ve kükürt de dahil olmak üzere belirli elementlerin nötron saçılma uzunluğu, protein perdeuterated olsa bile nötron SLD haritalarında zayıf görünür hale getirir (Şekil 13C-F)¹⁸. Bir metalin karakterize edilmesi gerekiyorsa, bir eklem iyileştirmesinde X-ışını kırınımını kullanmak veya kırınım deneylerini tamamlamak için spektroskopik teknikler uygulamak en iyisidir. Nötron veri kümesi yüksek çözünürlüğe sahip olduğunda veya perdeuterated protein kullanıldığında genellikle yalnızca nötron veri iyileştirmeleri gerçekleştirilir. Ek olarak, sadece nötron veri rafinajı, radyasyon hasarına karşı oldukça hassas bir protein üzerinde çalışılıyorsa özellikle yararlıdır, çünkü X-ışını türevi bir yapı radyasyon kaynaklı eserlere sahip olabilir. Yalnızca nötron verisi iyileştirmesi yapılacaksa, karşılık gelen nötron veri kümesinin yeterli eksiksizliğe ve çözünürlüğe sahip olup olmadığı tespit edilmelidir.

ORNL, nötron kırınım verilerinin toplanması için iki olanak sunar: HFIR'daki IMAGINE beamline ve ^{SNS36,67'deki} MaNDi kiriş hattı. Her iki cihaz da benzer ilkeleri kullanan bir nötron kırınım veri kümesi toplamak için etkili araçlar sağlarken, her enstrüman ışın süresi için başvururken dikkate alınması gereken benzersiz özelliklere sahiptir. IMAGINE, quasi-Laue verilerini toplar ve ~100 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristallerde oda sıcaklığı verisi toplanması için optimize edilmiştir. MaNDi, ~ 300 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristaller üzerinde TOF-Laue toplamayı kullanan oda sıcaklığı ve kriyo sıcaklığı verilerinin toplanması için kullanılabilir. Tam bir veri kümesini toplamadan önce, kristalin nötron ışınlarına tek bir kare için maruz kaldığı elde edilen kırınım deseninin kalitesini değerlendirmek için kristal üzerinde bir test yapılır. Kristal yeterli kalitedeyse, X-ray veri işlemeye benzer bir işlemde tam bir nötron kırınım veri kümesi toplanacak, dizine eklenecek, entegre edilecek, ölçeklendirilecek ve birleştirilecektir. IMAGINE Lauegen ve Lscale'den yararlanır ve MaNDi Mantid paketini kullanır ve üç boyutlu profil uydurması kullanır48,50,51,68,69,70. Bu tesislerden herhangi birine kullanıcı olan bilim insanlarına daha fazla analiz için MTZ veya HKL formatında bir veri kümesi sağlanacaktır.

Nötron kırınımı, biyolojik makromoleküllerin protonasyon durumunu ve hidrojen bağı etkileşimlerini yok etmek için tahribatsız, son derece hassas bir tekniktir. Özellikle fotoğrafa duyarlı proteinler ve metalloproteinler için faydalıdır. Bir deney yapmadan önce teknik ve verilerin işlenmesi ile ilgili çeşitli hususlar dikkate alınmalıdır, ancak sonuç, ilgi proteininin katalitik mekanizması hakkında değerli bilgiler verebilecek sonuçlar verir. Nötron proteini kristalografisi hesaplamalı, yapısal, biyokimyasal ve spektroskopik çalışmaları tamamlayarak biyoloğun biyolojik makromolekülleri karakterize etmek için kullanılan teknikler araç kutusunda değerli bir araç haline getirir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Emici Kağıt Noktaları Boyut # 30 - # 40, 60 mm uzunluk	DiaDent / DiaVet	218-292
Kılcal balmumu	Hampton	HR4-328
CCP4		Sürüm 7.0.077
Konik Santrifüj Tüpleri (15 mL)	Corning	CLS430790
Konik Santrifüj Tüpleri (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Sürüm 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Eğri Uçlu Forseps	Mitegen	TW-CTF-1
Döteryum klorür çözeltisi, ağırlıkça %35 D2O, ≥ 99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Döteryum oksit 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Çift Kalınlık MicroLoops 1000 & mikro; m	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH metre F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Köpük Dewars Standart Kap 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Dört Renkli Montaj Kili	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, moleküler biyoloji için, & ge; %99,5 (T),	Sigma-Aldrich	54457
EIGER 4M dedektörlü yüksek akı dönen anot X-ışını difraktometresi	Rigaku, Oxford Cryostream ve	Dectris XtaLAB Synergy-R	Ev kaynaklı X-ışını difraktometresi
Manyetik Değnek Düz	Mitegen	M-R-1013198
Mikro yükleyici, Femtotips ve diğer cam mikro kılcal damarları doldurmak için uç (yalnızca araştırma amaçlı kullanım için), 0,5 – 20 ve mikro; U, 100 mm, açık gri, 192 adet. (2 raf ve kez; 96 adet)	Eppendorf	930001007
Mikrotüpler hacim 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Şeffaf Kapaklı Petri Kapları 100 mm çap	Fischerbrand	FB0875713
Phoenix		Versiyon 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipet Hacmi 0.1-2.5 μ L	Eppendorf Research	Z683779
Pipet Hacmi 100-1000 μ L	Eppendorf Research	Z683825
Pipet hacmi 10-100 μ L	Eppendorf Research	Z683809
Pipet Hacmi 20-200 μ L	Eppendorf Araştırma	Z683817
Poli (etilen glikol) BioXtra, ortalama mol ağırlık 3.350, toz	Sigma-Aldrich	P4338
Kuvars Kılcal, 1.00 mm iç çap, 80 mm uzunluk	Hampton	HR6-146	İnce duvarlı kılcal
Araştırma Stereomikroskop Sistemi	Olympus	SZX16
Yeniden Kullanılabilir B3 (SSRL/SAM Stili) Gonyometre Tabanları	Mitegen	GB-B3-R
Yuvarlak - Minyatür İçi Boş Cam Boru (VitroTubes) Şeffaf Erimiş Kuvars / 1.00 mm iç çap, 100 mm uzunluk	VitroCom	CV1012	Kapaklı Kalın Cidarlı Kılcal
Sandviç Kutu	Hampton	HR3-132
Silikonize 9 Kuyulu Cam Plaka	Hampton	HR3-134
Oturan Damla Kristalizasyon Plakası (24 Büyük Kuyu)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodyum döteroksit çözeltisi, ağırlıkça %40 D2O içinde, %99 atom D	Sigma-Aldrich	176788
Kalın Silikonlu daire kapak kızakları (22 mm x 0,96 mm)	Hampton	HR3-247
Üniversal Pipet Uçları, 0,1 - 10 & mikro; L	VWR	76322-528
Üniversal Pipet Uçları, 1 - 100 &mikro; L	VWR	76322-136
Üniversal Pipet Uçları, 100 - 1000 & mikro; L	VWR	76322-154
Üniversal Pipet Uçları, 20 - 200 & mikro; L	VWR	76322-150
Üniversal Pipet Uçları, 1 - 20 & mikro; L	VWR	76322-134
Balmumu kalem	Hampton	HR4-342