Hidrolik Çatlatmanın Akışlar Üzerindeki Etkisini Mikrobiyal Moleküler İmzalar Kullanarak Değerlendirmek

Hidrolik çatlatma (HF) veya "çatlama", fosil yakıtlara olan talep artmaya devam ettikçe giderek yaygınlaşan bir doğal gaz çıkarma yöntemidir. Bu teknik, genellikle sıkışmış gazları serbest bırakmak için metan bakımından zengin şist yataklarına su, kum ve kimyasalların bir karışımını enjekte etmek için yüksek güçlü sondaj ekipmanları kullanmaktan oluşur¹.

Bu alışılmadık hasat teknikleri nispeten yeni olduğundan, bu tür uygulamaların yakındaki su yolları üzerindeki etkilerini araştırmak önemlidir. Fracking faaliyetleri, ekipman taşımacılığı ve kuyu ped yapımı için büyük arazi alanlarının temizlenmesini zorunlu kmaktadır. Her kuyu ped 2 için yaklaşık 1,2-1,7hektar arazi temizlenmelidir, sistemin kaçak ve su kalitesini potansiyel olarak etkiler³. Hangi biyositlerin kullanıldığı da dahil olmak üzere fracking sıvısının tam kimyasal bileşimini çevreleyen şeffaflık eksikliği vardır. Ek olarak, fracking atıksu yüksek tuzlu su olma eğilimindedir². Ayrıca, atık su metaller ve doğal olarak oluşan radyoaktif maddeler içerebilir². Bu nedenle, insan hatası veya ekipman arızası nedeniyle fracking sıvısının sızma ve dökülme olasılığı söz ile ilgilidir.

Akarsu ekosistemlerinin çevredeki manzaralardaki değişikliklere karşı çok hassas olduğu bilinmektedir⁴ ve biyoçeşitliliği korumak için önemlidir⁵ ve tüm su havzası içinde uygun besin döngüsü^6. Mikroplar tatlı su akışlarındaki en bol organizmalardır ve bu nedenle besin döngüsü, biyobozunurluk ve birincil üretim için gereklidir. Mikrobiyal topluluk kompozisyonu ve işlevi, perturbanceye duyarlılıkları nedeniyle ekosistem hakkında bilgi edinmek için harika araçlar olarak hizmet eder ve son araştırmalar, fracking aktivitesine yakınlığa dayanan gözlemlenen bakteri derlemelerinde belirgin kaymalar göstermiştir^7,8. Örneğin, Beijerinckia, Burkholderiave Methanobacterium fracking yakınındaki akarsularda zenginleştirilmiş olarak tanımlanırken, Pseudonocardia, Nitrospirave Rhodobacter fracking^7'yeyakın olmayan akarsularda zenginleştirilmiştir.

16S ribozomal RNA (rRNA) geninin yeni nesil dizilimi, tüm genom dizileme yaklaşımlarından daha hızlı ve daha ucuz olan bakteriyel topluluk bileşimini belirlemek için uygun fiyatlı bir yöntemdir⁹. Moleküler ekoloji alanında yaygın bir uygulama, 16S rRNA geninin son derece değişken V4 bölgesini, genellikle geniş bir tanımlama⁹kapsamına sahip cins seviyesine kadar sıralama çözünürlüğü için kullanmaktır , çünkü öngörülemeyen çevresel örnekler için idealdir. Bu teknik, yayınlanan çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır ve kırma işlemlerinin su ortamları üzerindeki etkisini belirlemek için başarıyla kullanılmıştır^7,8. Bununla birlikte, bakterilerin tespit edilen bolluklarını etkileyen 16S rRNA geninin değişen kopya numaralarına sahip olduğunu belirtmek gerekir¹⁰. Bunu hesaba katmak için birkaç araç var, ancak etkinliği şüpheli¹⁰. Yaygınlığı hızla büyüyen ve bu zayıflıktan yoksun olan bir başka uygulama, tüm RNA'ların sıralı olduğu metatranscriptomic dizilemedir ve araştırmacıların hem aktif bakterileri hem de gen ifadelerini tanımlamalarına izin verir.

Bu nedenle, daha önce yayınlanan 7 , 8^,11,12çalışmalarındaki yöntemlerin aksine, bu protokol mikrobiyal topluluk işlevini (metatranscriptomics) araştırmak için örnek toplama, koruma, işleme ve analizi de kapsamaktadır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan adımlar, araştırmacıların, eğer varsa, fracking'in antimikrobiyal direnç genleri de dahil olmak üzere akışlarındaki mikroplar tarafından ifade edilen genler ve yollar üzerinde nasıl bir etkisi olduğunu görmelerini sağlar. Ayrıca, numune toplama için sunulan ayrıntı düzeyi geliştirilmiştir. Adımların ve notların birkaçı deneyimli araştırmacılar için açık görünse de, araştırmaya yeni başlayanlar için paha biçilmez olabilir.

Burada, laboratuvarlarımızın birkaç yıllık deneyimine dayanarak fracking'in yakındaki akışlar üzerindeki etkisini araştırmak için bakteriyel genetik veriler üretmek için örnek toplama ve işleme yöntemlerini açıklıyoruz. Bu veriler, fracking durumuna karşılık gelen farklılıkları tanımlamak için aşağı akış uygulamalarında kullanılabilir.

1. Nükleik asit ekstraksiyonu için tortu örneklerinin toplanması

1. Steril bir 50 mL konik tüpü dere suyuna batırın. İstenmeyen insan kontaminasyonini önlemek için numune toplama sırasında eldiven giyin. Bu adımı kıyıdan veya sudaysa yukarı akışa bakacak şekilde gerçekleştirin.
2. Konik tüp suya batırılırken, kapağı çıkarın ve konik boruya 1 ila 3 cm derinlikten yaklaşık 3 mL tortu kepçelemek için kullanın.
3. Konik tüpü sudan çıkarın ve tortu örneğini (yaklaşık 1 mL) kaplayan ince bir tabaka hariç tüm suyu dökin.
4. 1000 μL pipet ve uygun pipet uçları kullanarak, toplanan örneğe 3 mL DNA/RNA koruyucu (koruyucu spesifikasyonlar için malzeme tablosuna bakın) ekleyin. Pipet uçlarını steril bir pipet uç kutusunda tutun ve sadece kullanmadan hemen önce takın ve kullanımdan sonra atın. Koruyucu ve numunenin iyice karıştırılmasını sağlamak için kapaklı konik tüpü 10 kez ters çevirin.
   NOT Adım 1.4 gerekli değildir, ancak RNA'nın daha sonra çökeltilerden çıkarılması şiddetle önerilir.
5. Numunelerin geri kalanı için numuneleri buza yerleştirin. Toplama işleminden döndükten sonra, numuneler 16S analizi (DNA) için kullanılacaksa -20 °C veya metatranscriptomics analizi (RNA) için kullanılacaksa -70 °C'de bir dondurucuda saklayın.

2. Nükleik asit ekstraksiyonu için filtre toplama

1. Steril bir 1 L şişenin kapağını çıkarın. Yukarı veya kıyıdan bakarken, şişeyi dere suyuyla doldurun ve sonra atın. Şişeyi koşullamak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Tüm şişeyi dördüncü kez doldurun ve kaplayın.
   NOT: 1 L şişeyi yeniden kullanıyorsanız, 2 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ile durulanarak sterilize edilebilir, ardından deiyonize su ile üç kez durulanabilir ve ardından% 70 etanol ile bir kez durulanabilir ve son olarak ayarlarla otomatik olarak kapatılabilir: 121.1 ° C'de 30 dk maruz kalma süresi ve 15 dakika kurutma süresi. Otomatik kapatma sırasında, şişenin işlem sırasında sıkıştırılmasını önlemek için şişenin üzerindeki kapak çok gevşek olmalıdır.
2. Sabit bir yüzeye çıktıktan sonra steril bir Luer kilit şırınnası kullanın ve tam bir hacim çizin. Daha sonra şırınnayı 0,22 μm gözenek boyutuna sahip steril ve DNA/RNA içermeyen 1,7 cm çapında poliethersülfon filtresine bağlayın ve pistonu tamamen aşağı bastırarak tüm hacmi filtreden geçirin. Şişede toplanan toplam hacim (1 L) filtreden itilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
   NOT: Şırınnanın hacmi değişken olabilir, eğer filtreden itilen toplam su miktarı izlenirse. Ancak genel olarak 60 mL tercih edilir. 1 L ideal olsa da, anekdotsal olarak, en az 200 mL'lik bir hacim muhtemelen DNA ve RNA'nın çıkarılması için yeterli biyokütle (mL başına ~ 20.000 hücre varsayılarak) toplayacaktır.
3. Şırındın içine kabaca 20 mL değerinde hava çekerek ve filtreden geçirerek filtreden fazla suyu çıkarın.
   NOT: Bu, adım 2.4 gerçekleştirilirse koruyucunun kaybını önlemeye yardımcı olacaktır.
4. P1000 mikropipette kullanarak, filtreyi yatay olarak tutarken filtrenin daha büyük açıklığı (şırıngaya bağlı olduğu yer) içinden boşaltarak 2 mL DNA/RNA koruyucu ekleyin. Koruyucunun filtreye girdiğinden emin olmak için pipet bastırıldığında pipet ucu filtrenin namlusunun içinde olmalıdır. Her kullanımdan sonra ucu değiştirin.
   NOT: Tortu toplamada olduğu gibi, bu adım gerekli değildir, ancak daha sonra özellikle RNA için nükleik asit veriminin artması şiddetle tavsiye edilir.
5. Bir kare parafin filmini soyun ve mühürlemek için filtrenin her bir açıklığının / ucunun etrafına sıkıca sarın. Parafin filmi sarılmış filtreyi steril bir numune torbasına yerleştirin ve toplama sırasında tüm torbayı buza yerleştirin.
   NOT: Filtreyi sarmak için kullanılan tarafın steril olduğundan, yani daha önce ortama maruz kalmadığından emin olun.
6. Örneklemeden döndükten sonra filtreleri 16S için -20 °C veya meta-transkriptomik için -70 °C'de saklayın.

3. Nükleik asit ekstraksiyonu ve nicelleştirme

1. Numune transfere başlamadan önce çalışma alanını %10 Çamaşır Suyu ve %70 Etanol ile temizleyin.
2. Tortu için (adım 1.5'ten itibaren), genellikle ~0.25 g örnek kullanın. Alev, metal bir aleti % 70 etanol kabına batırarak ve numuneler arasında etanol yakarak sterilize eder.
3. Filtreler için (adım 2.6'dan itibaren), filtre kağıdını ekstraksiyon için steril bir tüpe taşıyın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Alüminyum folyoyu katlayarak, kıvrımın iç kısmını dış ortama maruz kalmaması için steril, DNA ve RNA serbest yüzeyi oluşturun ve katlanmış parçayı ayarlarla otomatikleştirin: 121,1 °C ve 5 dakika kuruma süresi.
   2. %70 etanol ve açık alev ile mengene kavramayı sterilize edin. Ardından steril yüzeydeki filtre muhafazasını kırmak ve çekirdeği kasadan çıkarmak için mengene tutuşunu kullanın.
   3. Filtre kağıdını üst ve altta ve ardından dikiş boyunca dilimleyarak çekirdekten kesmek için steril bir neşter kullanın. Filtre kağıdını steril cımbız kullanarak katlayın ve ardından neşteri kullanarak filtreyi küçük parçalara bölün.
   4. Filtre parçalarını ekstraksiyon için bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre kağıdının sterilize edilmemiş veya nükleik asit bulunabilecek yüzeylerle temas etmediğinden emin olun, çünkü bu numunenin istenmeyen kirlenmesine yol açacaktır.
4. DNA yalıtımını daha önce açıklandığı gibi¹³ veya piyasada bulunan sütun tabanlı bir kit kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Listelenen ticari kit için adımlar aşağıda kısaca açıklanmıştır.
   1. Numune içindeki hücreleri bir boncuk tüpüne aktararak ve en az 5 dakika boyunca yüksek hızda bir hücre bozucuya maruz kalarak lyse. Santrifüj ve steril bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
   2. Üst noktaya (1:1 birim) lizis arabelleği ekleyin ve sağlanan filtreye (sarı) aktarın. Filtreyi santrifüjleyin.
   3. Filtreyi yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hazırlık tamponu (400 μL), santrifüj ekleyin ve akışı atın.
   4. Yıkama tamponu (700 μL), santrifüj ekleyin ve akışı atın. Ardından yıkama tamponu (400 μL), santrifüj ekleyin ve akışı tekrar atın.
   5. Filtreyi yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 50 μL DNase/RNase içermeyen su ile elute edin ve santrifüjlemeden önce oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
   6. Bu kübasyon döneminde, III-HRC filtresini bir toplama tüpüne yerleştirerek ve içine HRC hazırlık çözeltisini (600 μL) ekleyerek hazırlayın, ardından 8.000 x g'da3 dakikalık bir santrifüjleme adımı .
   7. Hazırlanan filtreyi steril bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Elde edilen DNA'yı adım 3.4.5'ten bu filtreye aktarın ve 3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışta çıkarılan DNA var.
5. DNA özlerini hem çökeltiler hem de filtreler için -20 °C'de saklayın.
   NOT: DNA özleri- 20 ° C'de yaklaşık 8 yıl boyunca saklanabilir, sabit sıcaklık, sınırlı ışığa maruz kalma ve zararlı kirleticiler olmadığı varsayılır¹⁴.
6. Üreticinin protokolüne göre RNA yalıtımı gerçekleştirin. RNA özlerini -80 °C'de saklayın.
   1. Numune içindeki hücreleri bir boncuk tüpüne aktararak ve en az beş dakika boyunca yüksek hızda bir hücre bozucuya maruz kalarak Lyse. Santrifüj ve steril bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
   2. Üst noktaya (1:1 birim) lizis arabelleği ekleyin ve sağlanan sütuna (sarı) aktarın. Sütunu santrifüjle.
   3. Akışa% 95-100 etanol eşit hacim ekleyin ve beş kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
   4. IICG Sütununu (yeşil) steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Karışık çözeltiyi sütuna ve santrifüje aktarın.
   5. Yıkama tamponu (400 μL), santrifüj ekleyin ve akışı atın.
   6. Kolona 5 μL DNase I ve 75 μL DNA sindirim tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   7. Hazırlık tamponu (400 μL), santrifüj ekleyin ve akışı atın.
   8. Yıkama tamponu (700 μL), santrifüj ekleyin ve akışı atın. Ardından yıkama tamponu (400 μL), santrifüj ekleyin ve akışı tekrar atın.
   9. Sütunu yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 50 μL DNase/RNase içermeyen su ile elute edin ve santrifüjlemeden önce 5 dakika bekletin.
   10. Bu kuluçka süresi boyunca, III-HRC filtresini bir toplama tüpüne yerleştirerek ve içine HRC hazırlık çözeltisini (600 μL) ekleyerek hazırlayın, ardından 8.000 x g'da3 dakikalık bir santrifüjleme adımı .
   11. Hazırlanan filtreyi steril bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Eluted RNA'yı adım 3.6.9'dan bu filtreye aktarın ve 3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akış ayıklanan RNA'yı içerir.
       NOT: RNA^{özleri, 15'i}bozmaya başlamadan önce yalnızca bir yıl saklanabilir. Hem DNA hem de RNA özleri tekrarlanan donma-çözülme ile bozulur. Bazı protokoller aynı örnekten hem DNA hem de RNA çıkarılmasına izin verir^16,17.
7. Çıkarılan DNA ve RNA örneklerini bir florometre veya spektrofotometre kullanarak ölçün. Florometre DNA konsantrasyon değerleri gibi Tablo 1'e bakın. Örnek bir spektrofotometre nicelleştirmeprotokolü için, bkz. Malzeme Tablosunda listelenen kit ile tortu DNA konsantrasyon değerleri genellikle 1 ila 40 ng/μL arasında değişirken, filtre DNA konsantrasyon değerleri 0,5 ila 10 ng/μL arasında değişir. tipik olarak 0,5 ila 5 ng/μL arasında değişen.

4. 16S rRNA kütüphanesi oluşturma

1. Çalışma alanını %10 Çamaşır Suyu ve %70 Etanol ile temizleyin. Çalışma alanı, laminer akış koşulları (laminar akış davlumbaz) üretebilen kapalı bir alan olmalıdır.
2. DNA özlerini kullanın (adım 3.5'ten itibaren) ve 16S rRNA amplicon dizilimini standart bir PCR protokolü ile hazırlayın, örneğin Dünya Mikrobiyomunun web sitesinde açıklanan ve laminer akış koşulları altında 16S rRNA^19'un V4 hipervariable bölgesini yükselten.
3. Daha önce açıklandığı gibi% 2 agarose jel hazırlayın ve katılaştırmasına izin verin¹⁷. 7 μL PCR ürünü ve 13 μL DNase içermeyen suyu karıştırın. 1x'lik son konsantrasyona jel yükleme boyası ekleyin. Agarose katılaştıktan sonra, bu PCR ürünleri karışımını% 2 agarose jel üzerine yükleyin.
   NOT: Alternatif olarak, bu jeller daha hızlı koştukça ve önceden yapılmış olarak geldiği için bunun yerine bir ön döküm jel kullanılabilir.
4. Dünya Mikrobiyomunun protokolünü kullanarak 16S rRNA V4 amplicons için başarılı amplifikasyon olarak 386 bant boyutunu kontrol etmek için jeli 60-90 dakika boyunca 90 V'ta çalıştırın.

5. DNA 16S rRNA kütüphanesi saflaştırma

1. Parlak bantlar veren numuneler için 10 μL, uygun büyüklükte steril mikrosantrifüj tüpünde soluk bantlar veren numuneler için 13 μL PCR ürünleri havuzu.
2. Bir florometre veya spektrofotometre kullanarak elde eden havuzun konsantrasyonunu kontrol edin ve daha önce olduğu gibi% 2 agarose jel hazırlayın. İdeal olarak, havuz en az 10 ng / μL konsantrasyona sahip olmalıdır ve çoğu numune yaklaşık 25 ng / μL konsantrasyona sahip olmalıdır.
3. Konsantrasyon ve hacim izin veriyor, % 2 agarose jel kuyusunda yaklaşık 150-200 ng yükleyin.
4. Jeli 90 voltta 60-90 dakika çalıştırın.
5. %2'lik bir agarose jel çalıştırarak havuzalanmış kütüphaneyi arındırın.
   1. Jelden 386 bp DNA bandını kesin ve daha önce açıklandığı gibi ticari olarak mevcut bir kit kullanarak havuza alınan kütüphaneyi arındırın²⁰. Saflaştırılmış DNA'ya 30 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8.5) sürün. Jelin kesilmesi PCR ampliconlarını hem deneyciye hem de çevreye yayacağından, gelecekteki kirlenmeyi önlemek için DNA veya RNA ekstraksiyonundan farklı bir alanda bu adımı gerçekleştirin.
6. Florometre veya spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış havuzun konsantrasyonunu kontrol edin. Arınma iyi giderse, konsantrasyonu teşvik edilmemiş havuzun en az yarısı olmalıdır. Genellikle, son konsantrasyon 5 ila 20 ng / μL arasında değişmelidir.
7. Yeni nesil sıralama için saflaştırılmış kitaplıkları gönderin. Nakliye kabına kuru buz dahil larak nakliye sırasında soğuk tutulmalarını sağlayın.

6. RNA kütüphanesi oluşturma ve temizleme

1. RNA kütüphaneleri oluşturmak için çeşitli ticari kitler kullanılabilir. Hangisi kullanılırsa kullanılsın, steril bir laminer akış ortamında çalışırken yazıldığı gibi üreticinin protokolünü izleyin. Malzeme Tablosunda kit protokolünün çok özetlenmiş bir versiyonu^21'inaltında sunulmuştur.
   1. İlk iplikçik cDNA sentez ana karışımını (8 μL çekirdeksiz su ve 2 μL first strand sentez enyzme mix) yapın ve örneğe ekleyin. Numuneyi protokolde belirtilen koşullarla termostaste yerleştirin.
   2. İkinci iplikçik cDNA sentez ana karışımını (8 μL İkinci Iplikçik Sentez Reaksiyon Tamponu, 4 μL İkinci Iplikçik Sentez Enzim Karışımı ve 48 μL çekirdeksiz su) buz üzerinde yapın ve örneğe ekleyin. Bir saat boyunca 16 °C'ye ayarlanmış bir termosikleyiciye yerleştirin.
   3. Sağlanan boncukları (144 μL) ekleyerek ve iki adet %80 etanol yıkama (200 μL) gerçekleştirerek reaksiyonun saflaştırılması.
   4. Sağlanan TE tamponu (53 μL) ile elute edin ve süpernatant 50 μL'yi temiz bir PCR tüpüne aktarın. PCR tüpünü buza yerleştirin.
   5. Buz üzerinde son hazırlık ana karışımını (7 μL Uç Hazırlık Reaksiyon Tamponu ve 3 μL Uç Hazırlık Enzim Karışımı) yapın ve PCR tüpüne ekleyin. PCR tüpünü protokolde belirtilen koşullara sahip bir termostale yerleştirin.
   6. Seyreltilmiş Adaptör (2,5 μL), Ligasyon Ana Karışımı (30 μL) ve Ligasyon Arttırıcı (1 μL) çözeltilerini buz üzerinde karıştırın. Karışık çözeltileri numuneye ekleyin ve 20 °C'de 15 dakika boyunca bir termoskope yerleştirin.
   7. Sağlanan boncukları (87 μL) ekleyerek ve daha önce olduğu gibi etanol yıkama (200 μL) ve elüasyon yaparak reaksiyondan arındırın, ancak sadece 17 μL TE ekleyin.
   8. Endeksleri (10 μL) ve Q5 Master Mix (25 μL) çözeltisini ekleyin ve protokolde açıklanan koşullarla bir termosiklete yerleştirin.
   9. Sağlanan boncukları (45 μL) ekleyerek ve ilave iki etanol yıkama (200 μL) ve 23 μL TE ile elüt yaparak reaksiyonun arındırın. 20 μL'yi temiz bir PCR tüpüne aktarın.
2. Biyoanalyzer, florometre veya spektrofotometre kullanarak kütüphanelerde tespit edilebilir RNA konsantrasyonları olup olmadığını kontrol edin.
3. Metatranscriptomic kitaplıkları kabaca eşitlikçi bir oranda bire birler.
4. 250 ile 400 bp arasındaki tüketim parçaları dışında, 16S kitaplık saflaştırması için aynı protokolü izleyen kitaplığı arındırın. 16S kütüphanesinin güçlendirilmiş bölgeyi temsil eden ayrı bir bandı varken, buradaki sonuç bir lekedir.
5. Arınmış kütüphanenin konsantrasyonlarını daha önce olduğu gibi kontrol edin.
6. Arıtılmış kütüphaneyi kuru buzla bir sıralama tesisine gönder.
   NOT: Alternatif olarak, RNA özleri kütüphane hazırlama ve sıralama için bir üniversiteye veya özel şirkete gönderilebilir.

7. Mikrobiyal topluluk analizi

1. Sıralama tamamlandıktan sonra örnek verilere erişin. Kullanılabilir bir bilgisayara indirin.
   NOT: İdeal olarak, cihazda en az 16 gigabayt RAM olmalıdır. Bilgi işlem gereksinimlerinin (Qiime2 için) tartışılması için https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808 bakın.
2. 16S rRNA verilerini çözümlemek için mothur, QIIME2 ve R gibi yazılımları kullanın. Örnek bir QIIME2 16S analiz öğreticisi için https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ buraya bakın.
3. Metatranscriptomics (RNA) verileri için, örneklerde hangi genlerin ve yolların bulunduğunu belirlemek için HUMAnN2 ve ATLAS kullanın.
   NOT: Ek Bilgi dosyasında çeşitlilik ve rastgele orman analizi ile sonuçlanan bir örnek metatranscriptomics ardışık düzeni sunulmuştur. Tüm komutlar komut satırı üzerinden çalıştırılır, örneğin Mac için Terminal kullanıcıları.

DNA ve RNA ekstraksiyonlarının başarısı çeşitli ekipman ve protokoller kullanılarak değerlendirilebilir. Genel olarak, herhangi birinin tespit edilebilir konsantrasyonu, ekstraksiyonun başarılı olduğu sonucuna varmak için yeterli kabul edilir. Tablo 1 incelendiğinde, biri hariç tüm ekstraksiyonlar başarılı olarak adlandırılacaktır. Bu adımdaki başarısızlık genellikle düşük başlangıç biyokütlesi, zayıf numune koruması veya ekstraksiyon sırasında insan hatasından kaynaklanır. Filtreler söz konusu olduğunda, konsantrasyon algılamanın altında olsa bile ekstraksiyon başarılı olmuş olabilir. Bu özler PCR için bantlar (16S yapıyorsanız) veya kütüphane hazırlığından sonra tespit edilebilir bir konsantrasyon (metatranscriptomics) vermezse, muhtemelen gerçekten başarısız oldular.

16S protokolüne uyulmuşsa, Şekil 1'deki4 ve 6 kuyularında görüldüğü gibi PCR amplifikasyonu izleyen parlak bantlar başarıyı gösterirken, üst sıradaki diğer kuyularda görüldüğü gibi bant eksikliği başarısızlığı gösterir. Ayrıca, jel şeridinde negatif PCR kontrolü içeren parlak bir bant da bir arızaya işaret edecektir, çünkü negatif kontrolleri etkileyen kontaminasyonun numuneleri etkilemediğini varsaymak riskli olacaktır.

Hem 16S hem de metatranscriptomics için, sıralamanın başarısı elde edilen sıra sayısına bakılarak değerlendirilebilir (Şekil 2). 16S örnekleri en az 1.000 diziye sahip olmalı ve en az 5.000 ideal olmalıdır (Şekil 2A). Aynı şekilde, metatranscriptomics örnekleri en az 500.000 diziye sahip olmalı ve en az 2.000.000 ideal olmalıdır (Şekil 2B). Bu minimumlardan daha az diziye sahip numuneler, bakteri topluluklarını doğru bir şekilde temsil etmeyebileceğinden analizler için kullanılmamalıdır. Bununla birlikte, minimum ve ideal arasında kalan örnekler hala kullanılabilir, ancak birçok örnek bu aralıkta düşerse sonuçlar daha dikkatli yorumlanmalıdır.

Sonraki aşağı akış analizinin başarısı, yalnızca beklenen çıktı dosyalarının elde edilip edilmediğine bağlı olarak belirlenebilir. Her halükarda, QIIME2 ve R (Şekil 3) gibi programlar, bakteri toplulukları arasındaki potansiyel önemli farklılıkların fracking'e dayalı olarak değerlendirilmesine izin vermelidir. Şekil 3 verileri, 16S ve metatranscriptomics analizi için on üç farklı akışta yirmi bir farklı bölgeden tortu örnekleri toplanarak elde edildi. Bu yirmi bir siteden on ikisi fracking aktivitesinin aşağı akışıydı ve HF + olarak sınıflandırıldı ve dokuzu ya fracking aktivitesinin yukarı akışında ya da fracking'in gerçekleşmediği bir su havzasındaydı; bu akışlar HF- olarak sınıflandırıldı. Fracking aktivitesinin varlığının yanı sıra, akarsular başka türlü karşılaştırılabilirdi.

Bu farklılıklar, fracking durumuna göre tutarlı kompozisyon kaymaları şeklinde olabilir. Bu durumda, HF+ ve HF- örneklerinin Şekil 3A ve Şekil 3B'de olduğu gibi bir PCoA grafiğinde birbirinden ayrı kümelenmesi beklenir. Bu belirgin kaymaların sadece ordinatasyon yönteminin bir eseri olmadığını doğrulamak için daha fazla istatistiksel analize ihtiyaç vardır. Örneğin, Şekil 3A ve Şekil 3B'nin dayandığı mesafe matrisi üzerinde yapılan permanova 22 testi, fracking durumuna göre önemli kümelenmeyi ortaya çıkardı, yani arsada gözlenen ayrım, bir ordinatlama eseri yerine örneklerin bakteri toplulukları arasındaki farklılıklarla tutarlıdır. Önemli bir PERMANOVA veya ANOSIM sonucu, HF+ ve HF- numuneleri arasındaki tutarlı farklılıkların güçlü bir göstergesidir, bu da HF+ örneklerinin kırılmadan etkilendiğini gösterirken, yüksek p değeri numunelerin etkilenmediğini gösterir. Metatranscriptomic veriler de aynı yöntemler kullanılarak görselleştirilebilir ve değerlendirilebilir.

Diferansiyel özelliklerin (mikroplar veya işlevler) incelenmesi, örneklerin de etkilendiğine dair kanıtlar ortaya çıkabilir. Diferansiyel özellikleri belirlemenin bir yöntemi rastgele bir orman modeli oluşturmaktır. Rastgele orman modeli, örneklerin fracking durumunun ne kadar iyi sınıflandırılabileceğini görmek için kullanılabilir. Model şans eseri beklenenden daha iyi performans gösterirse, bu, fracking durumuna bağlı farklılıkların ek kanıtı olacaktır. Ayrıca, en önemli tahminciler, örnekleri doğru bir şekilde ayırt etmek için hangi özelliklerin en önemli olduğunu ortaya çıkarır (Şekil 3C). Bu özellikler de o zaman fracking durumuna göre sürekli olarak farklı değerlere sahip olurdu. Bu diferansiyel özellikler belirlendikten sonra, literatür daha önce fracking ile ilişkili olup olmadıklarını görmek için gözden geçirilebilir. Bununla birlikte, çoğu sadece 16S rRNA kompozisyon verilerini kullandığı için diferansiyel fonksiyonları belirleyen çalışmalar bulmak zor olabilir. Bu nedenle, diferansiyel fonksiyonların etkilerini değerlendirmek için, olası bir yöntem, daha önce fracking sıvısında yaygın olarak kullanılan biyositlere karşı potansiyel dirençle ilişkili olup olmadıklarını veya yüksek tuzlu koşulların tolere edilmesine yardımcı olup olmadıklarını görmek olacaktır. Ayrıca, bir ilgi taksonunun işlevsel profilini incelemek fracking'in etkisinin kanıtlarını ortaya çıkarabilir (Şekil 3D). Örneğin, bir takson rastgele orman modeli tarafından diferansiyel olarak tanımlanırsa, HF+ örneklerindeki antimikrobiyal direnç profili HF örneklerindeki profiliyle karşılaştırılabilir ve büyük ölçüde farklılık gösterirse, bu, biyosit içeren fracking sıvısının akışa girdiğini gösterebilir.

Tablo 1: Florometre 1x DS DNA yüksek hassasiyetli teste dayalı örnek DNA konsantrasyonları. 14 hariç tüm bu örneklerin ekstraksiyonları, tespit edilebilir miktarda DNA'ya sahip olması nedeniyle başarılı olarak kabul edilecektir.

Şekil 1: PCR ürünleri ile örnek e-jel. Jel önceden boyanmış ve UV ışığı altında görselleştirilmiş ve üzerinde herhangi bir DNA bulunmasına neden olmuş. PCR, ilk sıradaki 4 ve 6 numaralı kuyulardaki numuneler için çalıştı, çünkü her ikisi de beklenen boyutta tek bir parlak banda sahipti (merdivene göre). Diğer altı kuyudaki numuneler için PCR başarısız oldu, çünkü herhangi bir bant üretmediler. Pozitif kontrol (birinci kuyu, ikinci sıra) PCR'nin düzgün yapıldığını gösteren parlak bir banta sahipti ve negatif kontroller (kuyular 6 ve 7, ikinci sıra) herhangi bir bant yoktu, bu da örneklerin kontamine olmadığını gösteriyordu. Negatif bir bant numuneler kadar parlak olsaydı, PCR bir başarısızlık olarak kabul edilirdi, çünkü numunelerin sadece kontaminasyonun sonucu olmayan ampliconlara sahip olduğunu varsaymak riskli olurdu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek sıra sayıları. (A) 16S örnek sıra sayıları. Bu 16S örneklerin neredeyse hepsi 1.000'den fazla diziye sahipti. 1.000'den az diziye sahip olan çok az sayıdaki dizi, bakteri topluluklarını doğru bir şekilde temsil etmek için yetersiz dizilere sahip oldukları için aşağı akış analizlerinin dışında tutulmalıdır. Birkaç dizi 1.000 ila 5.000 diziye sahipti; ideal olmasa da, çıplak minimumu aştıkları için hala kullanılabilirler ve örneklerin çoğu ideal minimum 5.000'i de aşıyor. (B) Metatranscriptomics örnek sayılır. Tüm örnekler hem minimum (500.000) hem de ideal minimum (2.000.000) dizi sayısını aştı. Bu nedenle, sıralama hepsi için başarılı oldu ve hepsi aşağı akış analizinde kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Örnek analiz. (A) QIIME2 aracılığıyla oluşturulan ve görselleştirilen Ağırlıklı Unifrac mesafe matrisi ile hesaplanan koordinatlara dayalı PCoA çizimi. (B) QIIME2'den dışa aktarılan Ağırlıklı Unifrac mesafe matrisi ile hesaplanan koordinatlara dayalı PCoA çizimi. Koordinatlar Phyloseq kullanılarak görselleştirildi ve R. Meta veri vektörlerindeki ggplot2 paketleri Vegan paketi kullanılarak arsaya takıldı. Her nokta, daha benzer topluluk kompozisyonlarını gösteren daha yakın noktalar ile bir örneğin bakteri topluluğunu temsil eder. Bu 16S tortu örnekleri için fracking durumuna göre kümelenme gözlendi (PERMANOVA, p=0.001). Ayrıca, vektörler HF+ örneklerinin, HF örneklerine kıyasla farklı bakteri topluluk kompozisyonuna karşılık gelen daha yüksek Baryum, Bromür, Nikel ve Çinko seviyelerine sahip olma eğiliminde olduğunu ortaya koymaktadır. (C) Numuneler arasında fracking durumunu tahmin etmek için bakteriyel bollukların nerede kullanılabileceğini test eden rastgele bir orman modeli için en iyi tahmincilerin grafiği. Rasgele orman modeli, randomForest paketi kullanılarak R aracılığıyla oluşturuldu. İlk 20 tahminci, numuneleri ayırmak için kullanıldığında Gini Endeksi'nde Ortalama Düşüş şeklinde safsızlıktaki (HF+ ve HF- numune sayısının birlikte gruplandırıldığı ölçü) düşüşlerin yanı sıra gösterilmiştir. (D) Metatranscriptomic verilere dayalı Burkholderiales profilinin antimikrobiyal direnç profilini gösteren pasta grafik. Diziler ilk olarak Kraken2 ile hangi taksona ait olduklarını belirlemek için açıklamalı olarak belirlendi. BLAST daha sonra hangi antimikrobiyal direnç genlerinin ("MEG_#" şeklinde) aktif olarak ifade edildiğini belirlemek için bu açıklamalı diziler ve MEGARes 2.0 veritabanı ile kullanıldı. Burkholderiales üyeleri tarafından ifade edilen antimikrobiyal direnç genleri daha sonra bu takson arasında en yaygın olanları görmek için çıkarıldı. Metatranscriptomics, daha maliyetli ve zaman alıcı olsa da, 16S verileriyle yapılamayan bu gibi işlevsel analizlere izin verir. Özellikle, kraken2 bu örnek analiz için kullanıldı, YERINE HUMAnN2. Kraken2, HUMAnN2'den daha hızlıdır; bununla birlikte, humann2 gibi kompozisyon, katkı ve işlevler (genler) ve yollar yerine yalnızca kompozisyon bilgilerini verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Dosya: Örnek bir metatranscriptomics ardışık düzeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.