Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

Summary

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Abstract

RNA'nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA'yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg'dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA'nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg'a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.

Introduction

Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir¹. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit² için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder ^3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA'yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir mi....

Protocol

Burada açıklanan araştırma hayvanlarını içeren tüm yöntemler, Harvard Tıp Fakültesi Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Burada açıklanan insan araştırma konularını içeren tüm yöntemler, Ortaklar İnsan Araştırma Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur.

1. Fekal numune toplama

1. Bir deneydeki her hayvan deneği için vidalı kapaklı steril ve nükleaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpünü otoklav yapın veya hazırlayın.
   1. İnsan denekler için, her denek için uygun, nükleaz içermeyen ve steril bir dışkı örneği toplama cihazı sağl....

Results

Temsili RNA'lar sırasıyla 50 mg fare dışkı örneğinden (2 fare dışkı peleti) ve 100 mg insan dışkısı örneklerinden izole edildi ve 50 μL nükleaz içermeyen suda salındı. Konsantrasyonun spektrofotometre analizi, sırasıyla toplam 49 μg ve 16 μg RNA miktarının izole edildiğini göstermektedir (Tablo 1). RNA saflığı, ~2.0'lık bir A260 / A280 oranı ve ~ 1.8'lik bir A260 / A230 oranı ile gösterildiği gibi yüksekti (Tablo 1). Bildirilen³ gibi, dışkıdaki RNA'ların çoğunluğu.......

Discussion

İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir⁷. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg'dan daha büyük bir başlangıç numune mat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Asit-Fenol: Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Eldiven
Mikrosantrifüj
mirVana miRNA İzolasyon Kiti	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nükleaz İçermeyen Mikrosantrifüj Tüpleri (1,5 mL, 2 mL)
Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile İşlem Görmemiş)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipetleyici ve Nükleaz İçermeyen Pipet uçları (filtreli)
PowerLyzer 24 Homojenizatör	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vorteks Çalkalayıcı