Yöntem makalesi

Katı Kanserin Patolojik İlerlemesinin Yeniden Kapsüllenilmesi için Çip Üzerinde 3D Hücre Baskılı Hipoksik Kanser

DOI:

10.3791/61945

⸱

5 Ocak 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipoksi tümör mikroçevriminin ayırt edici özelliğidir ve kanserin ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Bu makalede, hipoksiye bağlı bir kanser patolojisini yeniden canlandırmak için 3D hücre baskı teknolojisine dayanan çip üzerinde hipoksik bir kanserin fabrikasyon süreci açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser mikroçevrişiminin hastalığın ilerlemesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Özellikle, hipoksi kanser sağkalım, istila ve chemoresistance anahtar sürücüdür. Hipoksi ile ilgili kanser patolojisini incelemek için çeşitli in vitro modeller geliştirilmiş olmasına rağmen, in vivo olarak gözlenen kanser mikroçevriciliğinin karmaşık etkileşimi, hassas mekansal kontrol eksikliği nedeniyle henüz çoğaltılamamıştır. Bunun yerine, kanser ekolojisinin daha iyi öykünmesi ve doğru antikanser tedavi değerlendirmesi için mikrofizyolojik sistemler oluşturmak için 3D biyofabrikasyon yaklaşımları önerilmiştir. Burada, çip üzerinde hipoksik bir kanser imal etmek için 3D hücre baskı yaklaşımı öneriyoruz. Çipteki hipoksiyi indükleyen bileşenler, oksijen dağılımının bilgisayar simülasyonundan yola çıkarak belirlendi. Kanser-stroma eşmerkezli halkaları, bir tür katı kanseri nüksetlemek için glioblastom hücreleri ve endotel hücreleri içeren biyoinksler kullanılarak basılmıştır. Elde edilen çip, temsili patofizyolojik belirteçlerin oluşumu ile kanserde merkezi hipoksi ve ağırlaştırılmış maligniteyi fark etti. Genel olarak, katı-kanser-mimetik mikrofizyolojik sistem oluşturmak için önerilen yaklaşımın, kanser araştırmaları için in vivo ve in vitro modeller arasındaki boşluğu kapatması beklenmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser mikroçevrişi, kanserin ilerlemesini yönlendiren kritik bir faktördür. Biyokimyasal, biyofiziksel ve hücresel ipuçları da dahil olmak üzere birden fazla bileşen kanserin patolojik özelliklerini belirler. Bunlar arasında hipoksi kanser sağkalım, çoğalma ve istila1ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Kanser hücrelerinin sınırsız büyümesi ve bölünmesi nedeniyle, besinler ve oksijen sürekli tükenir ve hipoksik bir gradyan üretilir. Düşük oksijen koşullarında, hücreler hipoksi indüklendirilebilir transkripsiyon faktörünü (HIF) aktive eder moleküler basamak. Bu işlem nekrotik bir çekirdeğe neden olur, metabolik değişiklikleri tetikler ve kan damarı hiperplazisini ve metastazı2,3'ü başlatır. Daha sonra, kanser hücrelerindeki hipoksi komşu normal dokuların tahrip olmasına neden olur. Ayrıca, hipoksi, katı tümörlerin multifaktöriyel olarak terapötik direnci ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Hipoksi radyoterapiyi ciddi şekilde engelleyebilir, çünkü radyosensitivite reaktif oksijen türleri nedeniyle sınırlıdır1,4. Ek olarak, ilaç birikimini azaltan kanser mikroçevranlıklarının pH seviyelerini azaltır1. Bu nedenle hipoksi in vitro ile ilgili patolojik özelliklerin yeniden üretilmesi bilimsel ve klinik öncesi bulgular için umut verici bir stratejidir.

Kanserin belirli bir mikroçevriciliğini modellemek, kanser gelişimini anlamak ve uygun tedavileri keşfetmek için gereklidir. Hayvan modelleri güçlü fizyolojik alakaları nedeniyle yaygın olarak kullanılsa da, tür farklılıkları ve etik problemler ile ilgili konularmevcuttur 5. Ayrıca, geleneksel 2D ve 3D modeller derinlemesine bir analiz için kanser hücrelerinin manipülasyonu ve gerçek zamanlı görüntülenmesine izin verse de, mimari ve hücresel karmaşıklıkları tam olarak yeniden elde edilemez. Örneğin, bir küreseldeki kanser hücresi toplaması çekirdekte doğal olarak hipoksi üretebildiği için kanser sferoid modelleri yaygın olarak kullanılmıştır. Ayrıca, plastik veya silikon bazlı çok kuyulu sistemler kullanılarak çok sayıda tekdüze boyutta hücresel sferoid üretilmiştir6,7. Bununla birlikte, kanserli dokuların tam heterojen yapısını geleneksel platformlarla yakalama konusunda daha düşük esneklik, kanser araştırmalarını geliştirmek için son derece biyomimetik bir platform oluşturmak için gelişmiş bir biyofabrikasyon teknolojisinin kurulmasını gerektirmektedir8.

3D mikrofizyolojik sistemler (MPS'ler) kanser hücrelerinin karmaşık geometrisini ve patolojik ilerlemesini yeniden sağlamak için yararlı araçlardır9. Kanser hücreleri büyüme faktörlerinin ve kemokinlerin biyokimyasal gradyanını ve sistem üzerinde yeniden üretilen mekanik heterojenliği algıladıkça, kanser gelişiminin önemli özellikleri in vitro olarak araştırılabilir. Örneğin, değişen oksijen konsantrasyonlarına bağlı olarak kanser canlılığı, metastatik malignite ve ilaç direnci MPSs10,11kullanılarak çalışılmıştır. Son gelişmelere rağmen, in vitro modellerin hipoksik koşullarının oluşturulması, fiziksel gaz pompaları ile bağlantı da dahil olmak üzere karmaşık imalat prosedürlerine dayanmaktadır. Bu nedenle, kansere özgü mikroçevrimler oluşturmak için basit ve esnek yöntemlere ihtiyaç vardır.

3D hücre baskı teknolojisi, yerel biyolojik mimarileri yeniden canlandırmak için biyomalzemelerin mekansal düzenini hassas bir şekilde kontrol etmesi nedeniyle önemli ölçüde dikkat çekmektedir12. Özellikle, bu teknoloji, kanser mikroçevriciliğinin mekansal özelliklerini oluşturmak için yüksek kontrol edilebilirliği ve fizibilitesi nedeniyle 3D hipoksi modellerinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmektedir. 3D baskı ayrıca katman katman bir süreçle bilgisayar destekli üretimi kolaylaştırır, böylece gerçek doku mimarilerini taklit etmek için karmaşık geometrilerin hızlı, doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde inşasını sağlar. 3D MPS'ler için mevcut üretim stratejilerinin avantajlarına ek olarak, kanser ilerlemesinin patofizyolojik özellikleri biyokimyasal, hücresel ve biyofiziksel bileşenlerin desenlenerek çoğaltılabilir13,14.

Burada, katı bir kanserin heterojenliğini yeniden yakalamak için çip üzerinde hipoksik bir kanser için 3D hücre baskı stratejisi sunuyoruz (Şekil 1)15. İmalat parametreleri, sistemdeki merkezi hipoksi oluşumunun hesaplamalı simülasyoni ile belirlendi. Kanser-stroma eşmerkezli halkalar, bir tür katı kanser olan glioblastom patofizyolojisini taklit etmek için glioblastom hücreleri ve endotel hücreleri içeren kollajen biyoinksler kullanılarak basıldı. Radyal oksijen gradyanı oluşumu kanser malignitesini ağırlaştırarak saldırganlığın güçlendiğini gösterir. Ayrıca, çipin hastaya özgü preklinik modellere uygulamaları için gelecekteki perspektifleri belirtiyoruz. Katı-kanser-mimetik mikrofizyolojik sistem oluşturmak için önerilen yaklaşımın in vivo ve in vitro kanser modelleri arasındaki boşluğu kapatması beklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oksijen gradyan oluşumunun bilgisayar simülasyonları

  1. Çip üzerinde hipoksik kanser baskısı için 3D geometri modelinin üretimi
    1. Bir 3D CAD yazılımı çalıştırın.
    2. Çip üzerinde hipoksik kanserin geometri modelini çizin. Çizim'e tıklayın ve geometriyi çizmek için istediğiniz düzlemi seçin. Her parçanın ayrıntı ölçeği için çizime (Şekil 2A) bakın.
    3. Özellik Çıkıntı patronu/tabanı 'na tıklayarak geometrinin kalınlığını ayarlayın. Boş kutuya istediğiniz kalınlığı girin (Şekil 2A'yabakın) ve 3B geometriyi oluşturmak için yeşil onay simgesini seçin.
      NOT: Çip üzerindeki kanser boyutu, istenen ortam ve hidrojel hacimlerine göre tanımlanır. Mevcut deneyde, ekstrüzyon bazlı biyobaskı çözümü için önceki pratik deneyimlere dayanarak, istenen medya ve hidrojel hacimleri sırasıyla yaklaşık 1.500 μL ve 500 μL'ydi.
    4. Geometri dosyasını 3B CAD dosya biçimi (.prt veya .stl) olarak kaydedin.
  2. Hipoksik çekirdeğin indüksiyonu için hücresel yoğunluğun belirlenmesi
    1. Fiziksel bir difüzyon simülasyon programı çalıştırın.
    2. LiveLink'e tıklayın ve kullanılan CAD programını seçin. Simülasyon programındaki hipoksik kanser-on-a-chip geometrisini içe aktarmak için Senkronize'ye tıklayın. Odanın iç alanı gerçek bir deneysel ortamda bir kültür ortamı ile doldurulacağından, oksijen odanın iç boşluğuna ve hücre yüklü hidrojellerden oluşacak hücresel yapıya yayılacaktır.
      NOT: Fiziksel parametreler hakkında ayrıntılı bilgi için önceki çalışmaya bakın15.
    3. İthal edilen 3B geometriyi oksijenin dağınık olduğu ve hücrelerin oksijen tükettiği alanın kontrol hacmi olarak tanımlayın (Şekil 2B).
    4. Bir kullanım kılavuzu ve önceden belirlenmiş yöntemler16,17'yi izleyerek gaz difüzyon analizi için bir bilgisayar analizi çalıştırın.
    5. Bilgisayar analiz sonuçlarından, tahmini oksijen konsantrasyonu verilerini, kullanım kılavuzunu izleyen her zaman noktasında kesit A-A' üzerinden dışa aktarabilirsiniz. Yönetim denklemi, Eq. (1) (Şekil 2C)olarak ifade edildiği gibi Fick'in ilk yasasına dayanmaktadır.
      figure-protocol-1
      burada c konsantrasyondur, D oksijen difüzyon katsayısıdır, Nhücresi hücrelerin figure-protocol-2 yoğunluğudur, maksimum oksijen alma oranıdır ve Km Michaelis-Menten sabitidir. Sabitler önceki bir yayında açıklandığı gibi uygulanmıştır15.
      NOT: Her zaman noktası, zaman içinde oksijen difüzyon değişimini gözlemlemek için bir adım noktası anlamına gelir.
    6. Minimum oksijen seviyesinin hipoksi eşiğine ulaşıp ulaşmadığını değerlendirin ve hücresel yoğunluğun artarak veya azalarak bilgisayar analiz sürecini tekrarlayın.

























Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çip üzerindeki hipoksik kanser, hipoksi ve kanserle ilgili patolojiyi yeniden canlandırmak için bilgisayar destekli 3D hücre baskı teknolojisi kullanılarak geliştirilmiştir (Şekil 1). Oksijen taşıma ve tüketimi 3D geometri modeli kullanılarak simüle edildi. Çip, kanser dokularında radyal oksijen difüzyonunu ve tükenmesini taklit etmek için eşmerkezli halkalar şeklinde tasarlanmıştır (Şekil 2A). Oksijenin dağınık olduğu ve hücrele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, 3D hücre baskı teknolojisine dayanan çip üzerinde hipoksik bir kanserin üretim sürecini açıklıyoruz. Tasarlanan çipte hipoksik gradyanın oluşumu bilgisayar simülasyonları ile tahmin edildi. Heterojen hipoksik gradyanı indükleyen ortam, 3D baskılı gaz geçirgen bariyeri ve cam kapağı birleştiren basit bir strateji ile yeniden üretildi. Glioblastomanın psödomopalisade ve küçük bir kanser kök hücre popülasyonu da dahil olmak üzere hipoksiye bağlı patolojik özellikleri, çipin hipoksik gradyan koşulları altında y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbir açıklaması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Eğitim Bakanlığı (No. 2020R1A6A1A03047902 ve NRF-2018H1A2A1062091) ve Kore hükümeti (MSIT) (No. NRF-2019R1C1C1009606 ve NRF-2019R1A3A3005437).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler< / güçlü>
İnsan göbek damarı endotel hücreleriPromocellC-12200
U-87 MG hücreleriATCCATCC HTB-14
< güçlü > tek kullanımlık< / güçlü >
0.2 & mu; m şırınga filtresiSartorius16534-K
10 mL tek kullanımlık şırıngaJung Rim10ml 21G32
10 mL cam şişeHubenaA0039
10 mL Serolojik pipet ucuSPL lifescience91010
15 mL konik tüpSPL lifescience50015
18G plastik iğneMusashi mühendislikPN-18G-B
20G plastik konik dağıtım ucuMusashi mühendislikTPND-20G-U
22x50 cam kapakMARIENFIELD0101142
25 mL Serolojik pipet ucuSPL lifescience90125
3 mL tek kullanımlık şırıngalarHENKE-JET4020-X00V0
40 & mikro; m hücreli süzgeçFalcon352360
5 mL Serolojik pipet ucuSPL lifescience91005
50 mL konik tüpSPL lifescience50050
50 mL Serolojik pipet ucuSPL lifescience90150
50N hassas nozulMusashi mühendislikHN-0.5ND
Alüminyum folyoSINKWANG
Kılcal uçlarGilsonCP1000
Hücre sıyırıcıSPL yaşam bilimi90030
Konfokal çanakSPL yaşam bilimi200350
ParafilmBemisPM996
Ön kaplamalı histoloji slaydıMATSUNAMIMAS-11
RezervuarSPL yaşam bilimi23050
T-75 hücre kültürü şişesiSPL yaşam bilimleri70075
Ekipman
3DX yazıcıT & R Biofab
OtoklavJEIOTECHAC-12
SantrifüjCyrozen1580MGR
Konfokal lazer mikroskobuOlympus Life ScienceFV 1000
Floresan mikroskobuFISHER SCEINTIFIC O221S366
ForcepKorea Ace ScientificHC.203-30
El çetelesi sayaçKTRIO
HemositometreMARIENFIELD0650030
İnkübatörPanasonicMCO-170AIC
Laminer akış kabiniDAECHUNG SCIENCECB-BMMS C-001
Metal şırıngaIWASHITA mühendislikSUS BARREL 10CC
Çalıştırma MakasıHiroseHC.13-122
FırınJEIOTECHOF-12, H070023
Pozitif deplasmanlı pipetGILSONNJ05652
BuzdolabıSAMSUNGCRFD-1141
Volteks MikserDAIHAN scientificVM-10
Su banyosuDAIHAN SCIENTIFICWB-11
Su arıtma cihazıWASSER LABDI-GR
Malzemeler< / güçlü>
70 EtanolDaejung4018-4410
Anti-HIF-1 alfa antikoruAbcamab16066
Anti-SHMT2/SHMT antikoruAbcamab88664
Anti-SOX2 antikoruAbcamab75485
Sığır Serum AlbüminiThermo scientificJ10857-22
Domuz derisinden kollajenDalim tissenPC-001-1g
DAPI (4',6- Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür)ThermofisherD1306
Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2PromocellC22011
Fetal sığır serumuGibco12483-020
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488TheromofisherA-11001
Keçi anti-tavşan IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil Antikor, Alexa Fluor 594TheromofisherA-11012
Yüksek glikozlu Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta (DMEM)HidroksinSH30243-0
Hidroklorik asitSigma-Aldrich311413-100ML
Canlı / ölü tahlil kitiInvitrogenL3224
Fare IgG1, kappa monoklonal [15-6E10A7] - İzotip KontrolüAbcamab170190
Penisilin / streptomisinGibco15140-122
Fenol kırmızısı çözümSigma-AldrichP0290-100ML
Poli (etilen-vinil asetat)  Poli bilim06108-500
PolidimetilsiloksanDowhitechsylgard 184
Tavşan IgG, poliklonal - İzotip KontrolüAbcamab37415
Sodyum hidroksit çözeltisiSamchunS0610
Triton X-100BiosesangTRI020-500-50
Tripan MaviSigma-AldrichT8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5aCOMSOL AB
IMS beamerşirket içi yazılım
SolidWorks PaketiDassault Systems SolidWorks Corporation
% 0.25 Tripsin-EDTA Gibco 25200-072 10x PBS Intron IBS-BP007a% 4 Paraformaldehit Biosesang% Anti-CD31 antikoru Abcam ab28364

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157(2019).
  2. Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4(2019).
  3. Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
  4. Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
  5. Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16(2018).
  6. Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665(2013).
  8. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  9. Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  10. Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107(2020).
  11. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382(2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  13. Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
  14. Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10(2017).
  15. Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
  16. Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
  17. Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
  18. Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
  19. Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014(2012).
  20. Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003(2020).
  21. Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B H cre Yazd rmaKanser Stromas Konsantrik HalkalarGaz Ge irgen BariyerN tralize Kolajen Pre jelPDMS Bariyer D k mFedai PEVA Kal pHIF1 Alfa EkspresyonuSHMT2 Pozitif H crelerSOX2 Pozitif H creler

İlgili makaleler