Hücre morfolojisi, canlılık, yoğunluk, glutatyon ve UCP-2 seviyesini analiz eden retina pigment epitel hücrelerini H2O2ile tedavi ederek oksidatif stres modelinin geliştirilmesi ve kullanımı için bir protokol sunuyoruz. Transposon transfected hücreler tarafından salgılanan proteinlerin nöroretinal dejenerasyonu tedavi etmek için antioksidan etkisini araştırmak için yararlı bir modeldir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Oksidatif stres, dünya çapında ~30 milyon hastayı etkileyen bir patoloji olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) da dahil olmak üzere çeşitli dejeneratif hastalıklarda kritik bir rol oynamaktadır. Retina pigment epitelinde (RPE)- sentezlenmiş nöroprotektif faktörlerde, örneğin pigment epitel türevi faktör (PEDF) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktöründe (GM-CSF) azalmaya, ardından RPE hücrelerinin kaybına ve sonunda fotoreceptör ve retina ganglion hücre (RGC) ölümüne yol açar. PeDF ve GM-CSF'yi aşırı ifade eden transkreinal RPE hücrelerinin subretinal nakli ile nöroprotektif ve nörojenik retina ortamının yeniden kavrunun, oksidatif stresin etkilerini azaltarak, iltihabı inhibe ederek ve hücre sağkalımını destekleyerek retina dejenerasyonunu önleme potansiyeline sahip olduğunu hipotez ediyoruz. Uyuyan Güzel transposon sistemi (SB100X) insan RPE hücreleri PEDF ve GM-CSF genleri ile transfekte edilmiştir ve qPCR, batı lekesi, ELISA ve immünofluoresans kullanılarak kararlı gen entegrasyonu, uzun süreli gen ekspresyonu ve protein salgılanması gösterilmiştir. Transfected RPE hücreleri tarafından salgılanan PEDF ve GM-CSF'nin işlevselliğini ve gücünü doğrulamak için, kültürdeki RPE hücreleri üzerinde H2O2kaynaklı oksidatif stresin azaltılmasını ölçmek için bir in vitro test geliştirdik. Hücre koruması hücre morfolojisi, yoğunluğu, hücre içi glutatyon düzeyi, UCP2 gen ekspresyonu ve hücre canlılığı analiz ederek değerlendirildi. Her ikisi de, PEDF ve/veya GM-CSF'yi aşırı ifade eden transfected RPE hücreleri ve transknakte olmayan ancak PEDF ve/veya GM-CSF ile önceden tedavi edilen hücreler (ticari olarak mevcut veya transfected hücrelerden arındırılmış) tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla önemli antioksidan hücre koruması göstermiştir. Mevcut H2O2-modeli, AMD veya benzeri nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için etkili olabilecek faktörlerin antioksidan etkisini değerlendirmek için basit ve etkili bir yaklaşımdır.
Giriş
Burada açıklanan model, hücrelerdeki oksidatif stresi azaltmak içinbiyofarmasötik ajanların verimliliğini değerlendirmek için yararlı bir yaklaşım sunar. Modeli, PEDF ve GM-CSF'nin yüksek düzeyde O 2 ve görünür ışığa maruz kalan retina pigment epitel hücreleri üzerindeki H2O2aracılı oksidatif stres üzerindeki koruyucu etkilerini ve fotoreceptör dış segment membranlarının fagositozunu araştırmak için kullandık, önemli düzeyde reaktif oksijen türü (ROS)1, 2. Avasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonu (aAMD) 3 , 4 , 5 ,6,7,8patogenezine önemli bir katkıda bulunurlar. Ayrıca, RPE sentezlenmiş nöroprotektif faktörlerde bir azalma vardır, özellikle pigment epitel türevi faktör (PEDF), insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF'ler) ve granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) RPE hücrelerinin işlev bozukluğuna ve kaybına yol yorar, ardından fotoreceptör ve retinal ganglion hücre (RGC) ölümü3,4,5 . AMD metabolik, fonksiyonel, genetik ve çevresel faktörler arasındaki etkileşimden kaynaklanan karmaşık bir hastalıktır4. AAMD için tedavi eksikliği, sanayileşmiş ülkelerde 60 yaşından büyük hastalarda körlüğün başlıca nedenidir9,10. PEDF ve GM-CSF'yi aşırı ifade eden genetiği değiştirilmiş RPE hücrelerinin subretinal nakli ile nöroprotektif ve nörojenik retina ortamının yeniden birleşmesi, oksidatif stresin etkilerini azaltarak, iltihabı inhibe ederek ve hücre sağkalımını destekleyerek retina dejenerasyonunu önleme potansiyeline sahiptir11,12,13,14,15,16 . Genleri hücrelere ulaştırmak için çeşitli metodolojiler olsa da, pedf ve GM-CSF genlerini RPE hücrelerine ulaştırmak için viral olmayan hiperaktif Uyuyan Güzel transposon sistemini seçtik, çünkü güvenlik profili, genlerin konak hücrelerin genomuna entegrasyonu ve teslim edilen genleri transkripsiyonel olmayan aktif bölgelere entegre etme eğilimi nedeniyle17. 18,19.
Hücresel oksidatif stres, hidrojen peroksit (H 2O2),4-hidroinonenal (HNE), tertbutilhidroksit (tBH), yüksek oksijen gerginlikleri ve görünür ışık (tam spektrum veya UV ışınlama)20,21dahil olmak üzere çeşitli oksidatif ajanlar tarafından in vitro kültürlenen hücrelerde indüklenebilir. Yüksek oksijen gerilimleri ve ışık, diğer sistemlere aktarilebilirliği sınırlayan özel ekipman ve koşullar gerektirir. H 2 O2,HNE ve tBH gibi ajanlar üst üste binen oksidatif stres moleküler ve hücresel değişikliklere neden olarak. PEDF ve GM-CSF'nin antioksidan aktivitesini test etmek içinH2 O2'yi seçtik, çünkü RPE hücreleri tarafından fotoreceptör dış segment fagositoz22 sırasında reaktif oksijen ara olarak üretildiği ve in vivo23oküler dokularda bulunduğu için uygun ve biyolojik olarak alakalıdır. Glutatyonun oksidasyonu gözdeki H 2 O2üretiminden kısmen sorumlu olabileceğinden, çalışmalarımızda H 2 O2 kaynaklı oksidatif stres ve 21,22hücrelerinin rejeneratifkapasitesi ile bağlantılı GSH / glutatyon seviyelerini analizettik. Glutatyon seviyelerinin analizi özellikle gözdeki anti-oksidatif koruyucu mekanizmalara katıldığı içinönemlidir 24. H 2 O2'yemaruz kalma, RPE hücrelerinin 1 , 25 ,26,27 , 28, 29,30oksidatifstres duyarlılığını ve antioksidan aktivitesini incelemek için bir model olarak sıklıkla kullanılır ve ayrıca, "fizyolojik" bir oksidatif stres kaynağı olan ışık kaynaklı oksidatif stres hasarı ile benzerlikler gösterir21.
Nöroprotektif faktörlerin işlevselliğini ve etkinliğini değerlendirmek için, analizin PEDF ve GM-CSF'yi aşırı ifade etmek için genetiği değiştirilmiş hücreler tarafından ifade edilen büyüme faktörlerinin anti-oksidatif etkisini ölçmesini sağlayan bir in vitro model geliştirdik. Burada, PEDF ve GM-CSF genleri ile transfected RPE hücrelerinin H 2 O2'ninzararlı etkilerine transfected olmayan kontrol hücrelerinden daha dirençli olduğunu gösteriyoruz, hücre morfolojisi, yoğunluğu, canlılığı, hücre içi glutatyon seviyesi ve reaktif oksijen türlerini azalttığı gösterilen mitokondriyal ayrıştırma proteini 2'yi kodlayan UCP2 geninin ekspresyonu ile kanıtlandı (ROS)31.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan gözlerinin toplanması ve kullanımına ilişkin prosedürler Kanton Etik Araştırma Komisyonu (no. 2016-01726) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre izolasyonu ve kültür koşulları
- İnsan ARPE-19 hücre hattı
- Kültür 5 x 105 ARPE-19 hücreleri, bir insan RPE hücre hattı, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta / Besin Karışımı F-12 Jambon (DMEM / Ham'ın F-12) % 10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U / mL penisilin ile desteklenmiş, 80 μg/mL streptomisin ve 37 °C'de 2,5 μg/mL amfoterisin B (komple orta) bir T75 şişesinde %5 CO2
 | ||||||||
 | ||||||||
 | ||||||||
 | ||||||||
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnsan Retina Pigment Epitel hücrelerinde oksidatif stresin indüksiyonu
ARPE-19 ve primer hRPE hücreleri24saat boyunca değişen H 2 O2 konsantrasyonları ile tedavi edildi ve antioksidan glutatyonun hücre içi seviyesi ölçüldü (Şekil 2A,B). H2O2 50 μM ve 100 μM glutatyon üretimini etkilemezken, 350 μM'de ARPE-19 ve primer hRPE hücrelerinde glutatyonda önemli bir azalma oldu. Sitotoks...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan protokol, herhangi bir putatif faydalı genle transkârlaşmış hücrelere uygulanabilen transfected hücreler tarafından üretilen PEDF ve GM-CSF'nin anti-oksidatif ve koruyucu işlevini analiz etmek için bir yaklaşım sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş hücreleri naklederek proteinleri dokuya ulaştırma amacına sahip gen terapötik stratejilerinde, protein ekspresyon seviyesi, ifadenin uzun ömürlülüğü ve hastalığın bir modelinde ifade edilen proteinin etkinliği hakkında bilgi edinmek kritik öneme sahiptir. Laboratu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Gregg Sealy ve Alain Conti'ye ve Berlin'deki Max-Delbrück Merkezi'nden Prof. Zsuzsanna Izsvák'a pSB100X ve pT2-CAGGS-Venus plazmidlerini nazikça sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilimler Vakfı ve Avrupa Komisyonu tarafından Yedinci Çerçeve Programı kapsamında desteklendi. Z.I, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 oyuklu plakalar | Corning | 353047 | |
| 6 oyuklu plakalar | Greiner | 7657160 | |
| 96 oyuklu kültür plakası berrak düz dipli beyaz | Costar | 3610 | Lüminesansı ölçmeden önce hücrelerin kontrol edilmesini sağlar (GSH-Glo Testi) |
| 96 oyuklu plakalar | Corning | ||
| Akrilamid% 40 | Biorad | 161-0144 | |
| Amfoterisin B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| Antikor anti-GMCSF | ThermoFisher Scientific | PA5-24184 | |
| Antikor anti-fare IgG / IgA / IgM ve nbsp; | Agilent | P0260 | |
| Antikor anti-PEDF | Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş | sc-390172 | |
| Antikor anti-penta-His | Qiagen | 34660 | |
| Antikor anti-fosfo-Akt | Hücre Sinyal Teknolojisi | 9271 | |
| Antikor anti-tavşan IgG H & L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| Antikor eşek anti-tavşan Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Bilimsel | A11034 | |
| Antikor keçi anti-fare Alexa 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | |
| ARPE-19 hücre hattı | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| oda kültürü cam slaytları | Corning | 354118 | |
| CytoTox-Glo Sitotoksisite Testi | Promega | G9291 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| DMEM / Jambon F12 ve nbsp; | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| İkili Set ELISA kiti | R& D Sistemleri | DY215-05 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 78440 | |
| ELISAquant kiti | BioProducts MD | PED613-10-İnsan | |
| Gözleri (insan) | Aslanlar Görme Hediyesi Göz Bankası (Saint Paul, MN) | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Fluoromount Sulu Montaj Ortamı | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega plaka okuyucu ve nbsp; | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prizma yazılımı (sürüm 8.0) | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo Glutatyon Testi | Promega | V6912 | |
| hidrojen peroksit (H2< / sub>O2< / sub>) | Merck | 107209 | |
| ImageJ yazılımı (görüntü işleme programı) | WS Rasband, NIH, Bethesda, MD, ABD; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997– 2014 | ||
| Imidazol | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B mikroskobu | Leica Microsystems | ||
| LightCycler 480 Cihaz II | Roche Moleküler Sistemler | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 yazılımı | Roche Moleküler Sistemler | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2< / sub>PO4< / sub> | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon Transfeksiyon Sistemi | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfeksiyon Sistemi 10 & mikro; L Kiti | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neubauer haznesi | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Ni-NTA süper akış | Qiagen | 30410 | |
| Nitroselüloz ve nbsp; | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G Jel Görüntüleme Sistemi | Aplegen Yaşam Bilimleri | ||
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penisilin / Streptomisin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfectCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA ve nbsp; | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Astarlar | Canlandırıcı | Ek Malzemeler'deki Tablo 1'e bakınız | |
| pSB100X (250 ng/&mikro; L) | Má té S ve diğerleri, 2009. Prof. Zsuzsanna Izsvak tarafından sağlanan | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plazmid DNA'sı (250 ng/&mikro; L) | Johnen, S. ve ark. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796'da bildirilen mevcut pT2-CMV-PEDF-EGFP plazmidi kullanılarak oluşturulmuştur. | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plazmid DNA'sı (250 ng/&mikro; L) | Johnen, S. ve ark. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796'da bildirilen mevcut pT2-CMV-PEDF-EGFP plazmidi kullanılarak oluşturulmuştur. | ||
| QIAamp DNA Mini Kiti | QIAGEN | 51304 | |
| rekombinant hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| rekombinant hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA Hücresi Miniprep Sistemi | Promega | Z6011 | |
| RIPA tamponu | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNaz içermeyen DNase Seti | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Uygulaması | A2572 | |
| Yarı kuru transfer Dünya Bankası için sistem | Bio-Rad | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| Tris-tamponlu salin (TBS) | ThermoFisher Scientific | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Tripsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| Üre | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP substrat | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman nitroselüloz membran | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
Kaynaklar
- Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
- Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
- Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
- Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
- Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
- Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
- National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
- He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
- Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
- Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
- Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
- Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
- Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
- Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
- Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
- Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
- Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
- Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
- Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
- Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
- Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
- Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
- Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
- Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
- Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
- Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
- Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
- Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
