Yöntem makalesi

İn vitro Biyomühendislik Kalp Dokuları Olarak Kardiyak Sferoidler İnsan Kalp Patofizyolojisi Çalışma

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61962

⸱

23 Ocak 2021

 , 
1University of Newcastle, 2University of Sydney, 3Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, 4University of Technology, Sydney

Bu makalede

Özet

Bu protokol, 3Boyutlu kardiyak küresel oidleri (CSs) asılı damlalarda hücreleri bir arada oluşturarak imal etmeyi amaçlamaktadır. Kollajen gömülü CSs doksorubisin ile tedavi edilir (DOX, bir kardiyotoksik ajan) kalp yetmezliği modeli fizyolojik konsantrasyonlarda. DOX-treated CSs kullanılarak in vitro test kalp yetmezliği hastaları için yeni tedaviler belirlemek için kullanılabilir.

Özet

Kardiyak doku mühendisliğinde çeşitli gelişmelere rağmen, üstesinden gelmek için önemli zorluklardan biri biyomühendislik kalp dokuları içinde oksijen ve besin sağlamak için karmaşıklık çeşitli düzeylerde oluşan tam fonksiyonel bir vasküler ağ üretimi kalır. Laboratuvarımız insan kalbinin "kardiyak spheroid" veya "CS" olarak bilinen üç boyutlu in vitro modelini geliştirmiştir. Bu biyokimyasal sunar, fizyolojik, ve farmakolojik özellikleri insan kalbinin tipik ve ko-culturing tarafından oluşturulan üç ana hücre tipleri, kardiyak miyositler gibi, endotel hücreleri, ve fibroblastlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CMs veya iCM'ler) insan kardiyak fibroblastları (HcFs) ve insan koroner arter endotel hücreleri (HCAECs) ile invivo bulunan oranları yaklaşık oranlarda üç ila dört gün boyunca damla kültür plakaları asılı. Kardiyak Troponin T, CD31 ve vimentin (kardiyak miyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar için belirteçler) karşı antikorlarla boyanmış CSs'lerin konfokal analizi, CSS'lerin insan kalbinde bulunan yerli hücre ağına benzeyen karmaşık bir endotel hücre ağına benzediğini göstermektedir. Bu, bu konfokal görüntülerin 3Boyutlu görüntüleme analizi ile doğrulanır. CSs da kollajen tip IV, laminin ve fibronektin gibi insan kalbinin tipik ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri mevcut. Son olarak, CSs sadece iCMs içeren CSs ile karşılaştırıldığında insan kalbinin tipik bir daha yakın senkronize kontraktür olarak ölçülen bir kontraktil aktivite salar. Doksorubisin (DOX, lösemi, lenfoma ve meme kanseri tedavisinde kullanılan) gibi kardiyotoksik anti-kanser maddesi ile tedavi edildiğinde, DOX ile tedavi edilen CS'lerin canlılığı, HCF'lerde ve HCAEC'lerde DOX'un aşağı akım hedefi olan endotel nitrik oksit synthase'nin genetik ve kimyasal inhibisyonu ile önemli ölçüde azalır, CS'lerde toksisitesini azaltır. Bu benzersiz özellikleri göz önüne alındığında, CSs şu anda kalp biyokimyası, patofizyolojisi ve farmakoloji çalışma in vitro modelleri olarak kullanılır.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık (CvD) doku mühendisliği ve kök hücre teknolojileri1son gelişmelere rağmen dünya çapında ölüm ana nedeni olmaya devam ederken insan kalbi sınırlı bir rejeneratif kapasiteye sahiptir. Ya hasarlı bir kalp onarmak için moleküler ve hücresel yaklaşımlar da dahil olmak üzere yeni terapötik ihtiyacı ya da başarısız bir kalp önlemek için kalp hastalığı 2 muzdarip hastalar için önemli güncel klinik ihtiyaçlarından biridir2,3,4. Kardiyak doku mühendisliğinin temel amacı, vasküler ağ ve fizyolojik kontraktil fonksiyonu4,5,6dahil olmak üzere, bir insan kalbinin tipik moleküler, hücresel ve ekstrasellüler özellikleri sunan üç boyutlu (3D) kalp dokusu imal etmektir.

Biyomühendislik ve in vitro ve in vivo uygulamaları için insan kalbini taklit fonksiyonel bir insan kalp dokusu imal etmek için, çeşitli yaklaşımlar mühendislik kalp dokuları (EHTs), hücre sayfaları ve küresel kültürler7dahil olmak üzere araştırılmıştır 7,8. Ancak, bu dokular insan kalbinin tipik optimal 3D mikroortamda özetleme başarısız ve CVD hastalar için potansiyel kullanımı doğrudan başucu7tezgah tercüme edemez . Onlar in vivo kalp dokularının karmaşık biyoloji, morfoloji ve fizyolojisi özetlemek yok olmasıdır9. Kardiyak doku mühendisliğinde en büyük zorluklardan biri biyomühendislik kardiyak doku içinde hiyerarşik bir vasküler ağ geliştirilmesi içerir, çapı 200 μm daha büyük herhangi bir doku orta hücre ölümü gelişir gibi2,10. Bir insan kalp dokusunda düzgün bir şekilde oluşturulmuş vasküler ağ kalp hücrelerine kan, oksijen ve besin kaynağı için önemli bir rol oynar11. Embriyonik gelişim sırasında, koroner kılcal damarlar ve arterler damar ojiogenez (de novo kan damarı oluşumu) ve anjiyogenez (önceden var olanlardan kan damarlarının üretimi) endotel progenitorhücrelerinden8,12. Kardiyak fibroblastlar da optimal ekstrasellüler matriks (ECM) ve büyümekompozisyonu 13sağlayarak uygun vasküler ağ oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır 13,14.

Biyomühendislik kalp dokularının 3D vasküler ağ oksijen ve besin gradyanları ve parakrin sinyal oluşturarak hücre sağkalım ve fonksiyon kontrol eder, homotipik hücre etkileşimi gibi, heterotipik hücre etkileşimi, Salgılanan çözünür proteinler ve hücre yoluyla hücrelerin etkileşimi ECM etkileşimleri3,10,15,16,17,18. Bu doku ortasında hücre ölümünü önler ve biyomühendislik kalp dokularında hücre canlılığı ve fizyolojik fonksiyonu teşvik16,18,19.

Kök hücrelerden spheroid kültürler son zamanlarda insan kalbinin in vitro modelleri olarak keşfedilmiştir20. İn vitro kardiyak mikroortamı daha da iyileştirmek için, onlar kalp miyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi insan kalbinde bulunan tüm ana hücre tiplerinin kullanımını dahil edilmiştir. Sferoid kültürler, hücrelerin büyümesi ve çalışması için gerekli 3D yapısal desteği sunar ve bir vasküler ağ14,20,21,22biyomühendislik için kullanılabilir. Bu bağlamda laboratuvarımız, insan kalbinde bulunan oranlarda kardiyak miyositler, endotel hücreleri ve fibroblastları eş-culturing tarafından insan kardiyak küreseloidler (CSs) geliştirmiştir14. Bu model sıçan ventriküler kardiyak hücrelerin küresel modelbir genişleme, asılı damla kültürlerde co-culturing kardiyak hücreler tarafından oluşturulan, kardiyak fibrozis modeli için kullanılan21. İnsan CSs onları doksorubisin (DOX, lösemi, lenfoma ve meme kanseri tedavisinde kullanılan bir anti-kanser ajan), iyi kalp fibrozis ve kalp yetmezliği (HF) hatta 17 yıl sonra onun somministration14neden bilinen tedavi ederek toksisite tahlilleri olarak kullanılabilir .

Bu yazıda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CMs veya iCAM), insan kardiyak fibroblastlar (HHFs) ve insan koroner arter endotel hücreleri (HCAECs) asılı damla kültürlerde co-culturing insan CSs oluşturmak için nasıl açıklanmıştır. In vitro test için CSs kullanmak ve görüntü lemek için, bir kollajen jel gömülüdür. Endotel hücreleri için bir belirteç olan CD31'e karşı antikorlarla boyanmış CS'lerin konfokal analizi, bu hücrelerin in vivo gözlenene benzer bir ağ oluşturduğunu göstermiştir. HF'yi ikna etmek ve onu tedavi edebilecek veya önleyebilecek yeni ajanları test etmek için, BOS 10 μM DOX (ilacı alan kanser hastalarının kan dolaşımında bulunan bir konsantrasyon) ile tedavi edildi. Calcein-AM ve ethidium homodimer ile boyandığında (sırasıyla canlı ve ölü hücreleri boyama), DOX ile tedavi EDILEN CSs ilaç almadım CSs göre canlılık önemli bir azalma mevcut. CSs ayrıca 1 ile 3 Hz arasında alan potansiyeli stimülasyonunu kullanarak tempolu olduğunda homojen bir kontraktil aktivite sunar.

Protokol

NOT: Bu protokol için kullanılan hiPSC-CM'ler ticari olarak kullanılabilir. Gerekirse bu işe başlamadan önce lütfen kurumsal insan etik kurulunun onayını isteyin.

1. İnsan kardiyak fibroblast ve endotel hücre kültürü kaplama ve büyüme

  1. 37 °C'de bir su banyosunda HCF ve HCAEC içeren cryovial'ları bir dakika lığına eritin.
  2. Steril laminar akış biyogüvenlik kabine sınıf 2 altında cryovials taşıyın.
  3. 1000 μL'lik pipet ucu kullanarak cryoviallerden 1 mL hücre süspansiyonu alın ve HCAEC'ler için 7 mL İnsan Kardiyak Fibroblast Orta ve HCAEC'ler için 7 mL Human Meso Endo Growth Medium içeren 15 mL'lik bir tüp ekleyebilirsiniz.
    NOT: Her cryovial'dan hücrelerin çoğunluğunu toplamak için, aynı 15 mL tüpten 1 mL kültür ortamı ile iki kez durulayın.
  4. Hücre süspansiyonlarını hafifçe karıştırın.
  5. Hücre süspansiyonlarını 10 mL serolojik pipet kullanarak T75 kültür şişelerini ayırmak için aktarın.
  6. 37 °C'de %5 CO2ile inküb hücreler.
  7. 18 saat sonra, her iki kültür şişelerinden orta aspire ve dondurucu orta ve ölü hücreleri kaldırmak için steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez durulayın.
  8. PBS'yi her kültür şişesine 7 mL uygun kültür ortamı ile değiştirin ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  9. Hücresel genişlemeyi ve canlılığı düzenli olarak inceleyin ve hücreler %80-90 biraraya gelene kadar her gün ortamı değiştirin.

2. iCM kültür kaplama ve büyüme

  1. 40 μg/mL fibronektin (FN) içeren 2 mL PBS ve 37 °C'de kuluçka, en az 4 saat boyunca %5 CO2 içeren iki Adet T25 kültür şişesi ön kat.
  2. 4 saat sonra, bir cryovial içeren iCMs toplamak ve 4 dakika için 37 °C'de bir su banyosu yerleştirin.
  3. Steril laminar akış biyogüvenlik kabine sınıf 2 altında cryovial taşıyın.
  4. ICM'leri 1 mL pipet ucu kullanarak cryovial'dan steril 50 mL santrifüj tüpe hafifçe aktarın.
  5. Boş iCMs cryovial 1 mL oda sıcaklığında kaplama orta ile herhangi bir artık hücreleri kurtarmak için durulayın. 90 sn'nin üzerindeki cryovial damla dan kaplama orta durulama 1 mL iCM hücre süspansiyon içeren 50 mL santrifüj tüp aktarın.
    NOT: Çözeltiyi tamamen karıştırmak ve çözülmüş hücrelerdeki ozmotik şoku azaltmak için ortayı eklerken tüpü yavaşça döndürün.
  6. 50 mL santrifüj tüpüne yavaşça 8 mL oda sıcaklığında Kaplama Medium ekleyin. 30 - 60 s üzerinde ilk 1 mL damla akıllıca ekleyin. Daha sonra, sonraki 30 s üzerinde kalan hacmi ekleyin. Kaplama ortamını eklerken santrifüj tüpünü hafifçe döndürün. 50 mL santrifüj tüpünün içeriğini 2 - 3 kez ters çevirerek (güçlü titreme veya girdaplardan kaçınarak) yavaşça karıştırın.
  7. Hemen bir hemositometre kullanarak hücre sayma gerçekleştirmek ve canlı hücre yoğunluğunu belirlemek (hücre / mL).
  8. FN ön kaplamalı T25 şişelerini alın ve şişelerin kurumasına izin vermeden FN-PBS çözeltisini aspire edin. Bu iCMs tohumlama hacmi eklemek için (1.6 x 106 8 mL oda sıcaklığında kaplama orta canlı iCMs).
  9. 37 °C'de 48 saat kuluçka makinesinde kültür iCM'leri, %5 CO2.
  10. Bakım Ortamını kullanımdan bir gün önce 4 °C'de bir gecede eritin.
  11. Bakım Ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda dengeleyin ve hemen kullanın.
  12. 2 gün sonra, iCMs T25 şişelerini biyogüvenlik kabininin altına taşıyın.
  13. Platin ortasını 5 kez hafifçe borulandırarak ölü hücreleri ve döküntüleri hafifçe yıkayın.
  14. Kaplama Ortamını aspire edin ve önceden ısıtılmış Bakım Ortamının 8 mL'si ile değiştirin. T25 şişelerini kuvöze geri yerleştirin. Bakım Ortamını her gün değiştirin ve birleşimi düzenli olarak inceleyin.

3. Hücre izolasyonu ve sayma

  1. 3.2-3.12 adımlarını izleyerek önce HCAEC'leri ve HCF'leri ve ardından iKM'leri toplayarak başlayın.
  2. 10 mL iCMs Bakım Ortamı, 5 mL İnsan Kardiyak Fibroblast Orta ve 5 mL Meso Endo Büyüme Ortamı karıştırılarak CS kültür ortamı hazırlayın.
  3. HcF'ler ve HCAEC'ler içeren her doku şişesinden kültür ortamını çıkarın ve T75 şişeleri için 5 mL PBS ile bir kez durulanın. PBS'yi kaldırın.
  4. Her T75 şişesine %0,25 tripsin EDTA çözeltisi 5 mL ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika, %5 CO2'deinkübül.
  5. Hücreler bir kez detach, hemen kültür orta 5 mL ile tripsin EDTA çözeltisi nötralize.
  6. Hücre süspansiyonlarını 15 mL'lik bir tüpe ve santrifüj hücrelerine 300 x g'da 4 dk aktarın.
  7. Supernatant'ı her tüpten dikkatlice çıkarın. Her hücre peletine 1 mL CS orta ekleyin ve yeniden askıya alın. Tüp buz üzerinde tutun ve Trypan Mavi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.
  8. Bakım Ortamını iC'ler içeren doku şişelerinden çıkarın ve 3 mL PBS ile bir kez durula.
  9. Her T75 şişesine %0,25 tripsin EDTA çözeltisi 1 mL ekleyin ve 37 °C,%5 CO2'dekuluçkaya yatırın. Ayrılana kadar her dakika hücreleri kontrol edin.
  10. Hücreler bir kez detach, hemen kültür orta 4 mL ile tripsin EDTA çözeltisi nötralize.
  11. Hücre süspansiyonlarını 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dk boyunca 300 x g'da santrifüj edin.
  12. Supernatant'ı her tüpten dikkatlice çıkarın. Hücre peletine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve yeniden askıya alın. Tüp buz üzerinde tutun ve Trypan Mavi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.

4.CS üretimi ve büyümesi

  1. 20 μL CS orta içeren asma damla kültürü başına 10.000 iCM, 5.000 HCF ve 5.000 HCAEC kaplama ile 2:1:1 oranında iCM'leri, HHC'leri ve HCAEC'leri karıştırın. Toplam CS sayısı için son ses birimine ayarlayın.
  2. Pipet 20 μL hücre süspansiyonu 384 iyi HDC plakanın her bir kuyununiçine manuel olarak veya otomatik sıvı işleme için robotik çok kanallı pipet kullanarak.
  3. Pipet 1.5 mL steril PBS CSs. Incubate HDC plaka 37 °C kurutmaönlemek için Asılı Bırakma Plakası etrafında kanalın her iki tarafında.
  4. Kuyuların çoğunda tam olarak oluşan bir küresel gözlemlenene kadar GÜNLÜK OLARAK CSs oluşumunu inceleyin. Bir CS oluşana kadar her iki günde bir kuyuya 7,5°L CS orta ekleyin.

5.CS kollajen jellere gömme

  1. 1 mL pipet ucu ile CSs toplayın.
    NOT: Pipetin ucunu steril keskin bir yüzeyle (neşter veya makas) kullanmadan önce kenardan yaklaşık 0,2 cm kesmek gerekir.
  2. CS süspansiyonu buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
  3. 5 dk için 300 x g tüp santrifüj.
    NOT: Elde edilen pelet kullanıma kadar buz üzerinde tutulmalıdır.
  4. Fare kuyruk kollajeni ve CS orta kullanarak buz üzerinde 3:7 oranında bir kollajen jel çözeltisi (100 μL/iyi 96 kuyu 30 kuyu için) hazırlayın.
  5. CSs içeren tüpten supernatant çıkarın.
  6. Kollajen jel çözeltisi içinde peletli CSs karıştırın.
  7. CS-kollajen jel süspansiyonuna 1 μL/mL 5 mM sodyum hidroksit ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  8. 100 μL CS-kollajen jeli net düz bir alt 96 iyi siyah polistiren mikroplakave 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

6. DOX ile tedavi edilen CS'lerin canlılık ve toksisite ölçümleri

  1. 30 dk sonra kuvözden 96 kuyu plakasını toplayın
  2. 10 μM DOX hazırlayın (CSs14'tehücre ölümü için önceden belirlenmiş protokole göre).
    NOT: BOS'larda HF'ye karşı koruyabilecek diğer aracıları test etmek için DOX + Agent A, B, vb. içeren çözümler üretin.
  3. Her kuyuya DOX ve/veya diğer ajanlar içeren 100 μL'lik çözümler ekleyin. Kontrol kültürleri herhangi bir DOX olmadan medya içerir.
  4. 37 °C'de 18 saat kuluçka plakası, %5 CO2.
  5. Ertesi gün, Live/Dead boyama reaktifi stok çözeltilerini toplayın ve biyogüvenlik kabininde karanlıkta buz üzerinde erimelerine izin verin.
  6. Hoechst lekesi, 4 μM ethidyum homodimer ve 2 μM calcein-AM içeren bir çözelti hazırlayın.
  7. Her kuyuya 100 μL Hoechst lekesi, kalcein-AM/ethidium homodimer çözeltisi ekleyin.
  8. Floresan'ı her kuyuya ethidium homodimer için 645 nm ve çok modlu mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla calcein-AM için 530 nm olarak ölçün.
  9. Floresan ölçümlerini Graphpad PRISM'e (veya istatistiksel analiz için eşdeğer bir yazılıma) aktarın.
  10. Veri analizi ve istatistikleri için GraphPad Prizma yazılımLarını kullanın.
  11. Kalite kontrol için, calcein-AM ve ethidyum homodimer ile birlikte çekirdek boyama için bir epifloresan mikroskobu altında kontrol edin.

7.CS kontraktil fonksiyon değerlendirmesi

  1. Adım 5.8'de hazırlanan mikroplakayı toplayın.
  2. Video tabanlı kenar algılama, Floresan Yardım Arabirimi ve MyoPacer Alan Uyarıcısı için IonOptix yazılımını içeren bilgisayarı açın.
  3. Doku tutucu platforma yeni bir kapak fişi yerleştirin ve elektrotlarla su banyosu monte edin.
  4. Kollajen jellerden, kenardan 0,5 mm kesilmiş 1 mL pipet ucu kullanarak CS'leri yavaşça toplayın ve bir şahin tüpüne aktarın. CSs. Transfer CS (birer birer birer) IonOptix sisteminin aşamasında medya birkaç μL ile kuruma önlemek için CS üzerine medya ekleyin.
  5. IonOptix yazılımını kullanarak CS'nin sol ve sağ tarafındaki zirveleri ayarlayarak analiz edilecek CS'yi seçin.
  6. CS kenarlarının hareketini izlemek için bilgisayar tabanlı hareket çözümleyicisini kullanın.
    NOT: Normalde kontraktür % hücre kısaltması veya % kesirli kısaltma ile ölçülür. Bu durumda% sheroid kısalması ölçtük.
  7. Bilgisayardan eşik ve kenar seçeneklerini ayarlayarak hem tepe noktalarını stabilize edin.
  8. Myopacer Alan Uyarıcısını kullanarak CSs'leri farklı frekanslara (0.3, 0.6, 1, 2 ve 3 Hz) ve gerilimlere (1, 2, 3 ve 5 V) maruz bırakın.
  9. DOX ile tedavi edilen ve işlenmemiş CS'lerin CS uzunluğu değişiklikleri olarak spheroid kısalma kaydedin.

8. CSs mikroskobu: fiksasyon ve immünetiketleme

  1. 30 dakika sonra 96 iyi plaka toplamak (adım 5.8 olarak hazırlanan) ve oda sıcaklığında 1 saat için% 4 paraformaldehit (PFA) CSs düzeltmek.
  2. PfA'yı çıkarın ve %0.01 sodyum azit (PBSA) içeren PBS ile üç kez durulayın.
  3. PBSA'yı kaldırın.
  4. Bir shaker üzerinde 30 dakika boyunca her kuyuya %0,02 Triton-X-100 içeren 200 μL PBSA ekleyin.
    NOT: Bu adım daha iyi antikor infiltrasyonu için CSs permeabilize.
  5. Oda sıcaklığında 60 dakika PBSA çözeltisi içinde % 3 sığır serum albumin 200 μL ekleyin.
    NOT: Bu adım, CSs'de spesifik olmayan antikor bağlanmasını engeller.
  6. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş CD31'e karşı 10 μg/mL birincil fare anti-insan antikorları içeren bir çözelti hazırlayın.
  7. Her kuyuya 100 μL primer antikor çözeltisi ekleyin ve bir shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  8. Bir sallanan plaka üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika pbsa ile üç kez plaka durulayın.
  9. Hoechst DNA lekesi ve bloke çözeltisinde seyreltilmiş Cy3 konjuge ikincil eşek anti-fare antikorunun 10 μg/mL'sini içeren bir çözelti hazırlayın.
  10. Her kuyuya Hoechst lekesi içeren 100 μL ikincil antikor solüsyonu ekleyin ve bir shaker üzerinde 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu noktadan itibaren plakayı alüminyum folyo ile kapatın.
  11. Bir sallanan plaka üzerinde oda sıcaklığında PBSA ile 20 dakika boyunca plaka üç kez durulayın.
  12. Her kuyuya 100 μL Vectashield montaj ortamı ekleyin.
  13. Bir lazer tarama konfokal mikroskop altında Görüntü CSs. Z ekseni boyunca optik kesit gerçekleştirin ve ImageJ yazılımını kullanarak görüntüleri tek bir odak düzlemine daraltın.

Sonuçlar

Bu el yazmasında açıklanan protokol, mevcut modellere göre gelişmiş hücre canlılığı ve fonksiyonu ile biyomühendislik lenmiş bir kardiyak doku içinde karmaşık kardiyak endotel hücre ağı geliştirmek için alternatif bir yaklaşım temsil eder(Şekil 1). CSs içinde 3D in vivo kalp mikroortamının recapitulation kanser hastalarının kan dolaşımında bulunan konsantrasyonda DOX yanıtlarını teşvik (arasında 5 ve 10 μM, Şekil 2). DOX tedavi CSs 24 saat içinde kontrol ile karşılaştırıldığında hücre canlılığı istatistiksel olarak anlamlı bir azalma sundu (Hiçbir DOX) CSs(Şekil 2),ilaç ile tedavi den sonra bile 17 yıl sonra insan kanser hastalarında gözlenen toksik bir etki.

figure-results-1
Şekil 1. CS Oluşumu ve Vaskülarizasyon Analizi. (A) ICAM'ler, HCAEC'ler ve HHC'lerin ortak kültüründen bir CS oluşumuna yönelik adımları gösteren protokol. Sağ tarafta brightfield görüntüleri asılı damla tek hücrelerden ilerleyici küresel oluşumunu göstermektedir. (B) Kardiyak Troponin T (cTNT), PECAM ve vimentin, kardiyak miyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar boyama karşı antikorlar ile boyanmış bir CS konfokal görüntüleri Çökmüş Z-yığınları, sırasıyla. Bu rakam14'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. CSs canlılık ve toksisite. Kalsin-AM (A) ve ethidyum homodimer(B)floresansının istatistiksel analizleri sadece ortam (DOX 0 μM) veya doksorubisin (10 μM) varlığında tedavi edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Gelişimsel olarak, uygun vasküler ağ oluşumu fonksiyonel dokuların üretimi için önemlidir, insan kalbi de dahil olmak üzere10,12,23,24,25,26. 3D dokuların uygun vaskülarite için göz, oksijen değişimi sağlar, büyüme faktörleri, sinyalmolekülleri ve besin, herhangi bir doku içinde hücre nekroz gelişimini engelleyen kalın200μm 6,10,12,17,24,25,26,27,28. Şu anda mevcut in vitro 3D kalp modelleri bir vasküler ağ mevcut öncelikle kılcal boyutlu, düzensiz vasküler ağlar sunan ve in vivogözlenenhiyerarşik karmaşık dallı vaskülarizasyon eksikliği 6,8,29. Bu el yazmasında açıklanan kompleks kardiyak endotel hücre ağı geliştirmek için alternatif yaklaşım mevcut modellere göre gelişmiş hücre canlılığı ve fonksiyonu sunar (Şekil 1)14,22. 3D in vitro CSs modeli daha iyi in vivo mikroortamda recapitulating tarafından insan kalbi, moleküler dahil, hücresel ve hücre dışı bileşenleri14,22. Askı damlalarında kök hücre kaynaklı hücrelerden CS üretimi, tanımlanmış koşullarda (örn. hücre tipleri ve oranı, uygun doku oluşumu) kendi kültürlerini sağlar. CSs içinde HCFs ve HCAECs ile birlikte iKY'lerin co-kültürleri, hastanın kan dolaşımında bulunan konsantrasyonlarda kontraktil fonksiyonu ve ilaçlara yanıt da dahil olmak üzere kalp patofizyolojisi düzenleyen moleküler ve hücresel crosstalk tanımlar14. Bu benzersiz özellikleri nedeniyle, CSs modeli kardiyak fibrozis için kullanılmıştır, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği ciddi bir sonucu21. Önceki çalışmalarımız, hem endotel hücrelerinin hem de fibroblastların varlığının insan kalbindeki vasküler mikroortamın yeniden kapitülasyonu için nasıl kritik öneme sahip olduğunu gösterdi, laminin, fibronektin ve kollajen tip IV gibi fibroblast kaynaklı ECM proteinlerinin optimal birikimine izin vererek, gelişmekte olan endotel hücre ağının yakınında lokalize14,21.

DOX kanser hastalarında kalp yetmezliği gelişebilir iyi bilinen bir kardiyotoksik ilaçtır bile 17 yıl onların tedavisinden sonra30. Yine de, bu kadınlarda pediyatrik hastalarda lösemi ve lenfoma tedavisi için tercih edilen bir ilaç kalır ve kadınlarda meme kanseri30. CSs DOX tedavisi daha sonra kalp yetmezliği modeli için kullanılmıştır (HF) in vitro kardiyak miyositt, endotel hücreleri ve fibroblastlar toksisiteyi düzenleyen mekanizmaları hem de çalışmaiçin 14 ve model HF kaynaklı kardiyak fibrozis21. Kanser hastalarının kan dolaşımında bulunan konsantrasyonda ilaca maruz kaldığında (5 ila 10 μM arasında)14 (Şekil 2)DOX'ta tedavi edilen CSs'lerde hücre canlılığı istatistiksel olarak azaltıldı. Laboratuvarımızda daha önce yapılan çalışmalarda dox'un hem kardiyak endotel hücreleri hem de fibroblastlar üzerindeki toksik etkileri endotel nitrik oksit sintaz (eNOS) ile bu sinyal yolunun hem genetik hem de kimyasal inhibitörleri kullanılarak gösterilmiştir14. DOX'un aşağı hedefi olarak eNOS sinyal yolunun genetik (NOS3 shRNA) ve kimyasal (N5-(1-iminoetiyet)-L-ornitin, dihidroklorür veya L-NIO) antagonistlerinin kullanımı hem kardiyak endotel hücrelerinde hem de fibroblastlarda toksik etkilerini önledi14.

CSs içinde kontraktil aktivite de alan potansiyeli stimülasyon maruz kaldığında kardiyak hücrelerin elektriksel kaplin sayesinde ölçüldü. Kontrol ortamı (DOX 0 μM) ile kültürlenen CSs'lerin, 1 ve 3 Hz'de alan uyarımı ile tempolanabilen, sağlıklı bir insan kalbiyle karşılaştırılabilir bir atfederek kendiliğinden ve homojen bir şekilde küçültüldüğünü bulduk. Öte yandan, DOX ile tedavi edilen CSs onlar sözleşme olamaz gibi elektrikstimülasyon takip etmez. Calcein-AM ve ethidium homodimer kullanarak hücre canlılığı ve toksisite ölçümleri ile birlikte, CS kontraktil fonksiyonu için bu fonksiyonel test, şu anda diğer modeller ile ulaşılabilir değil, in vitro insan kalbinin tipik karmaşık senaryo nun değerlendirilmesi sağlar. Aynı sistemi kullanan tek kardiyak hücrelerin kontraktil aktivite ölçümlerine kıyasla, CSs'deki sarkomreyi görselleştirip ölçemeyiz. Bu nedenle, zaman içinde % küresel kısalma ölçümleri ile sınırlıdır, bizim laboratuvar içinde geliştirmek zorunda bir test. Biz hücre sayısını kontrol ederken, her CS ve bu nedenle her CS boyutu co-kültür, biz gerçekten homojen kontraktil fonksiyonu mevcut benzer boyutta CSs kullanır. Ancak, farklı boyutlarda CSs ürettiğimiz durumlarda bile, kontraktil aktiviteleri değişmedi.

CSs'nin çok hücreli yapısının, süper aşılsalar bile, Ion-Optix sistemindeki kapak kapağının alt kısmında yerelleştirilebilecek kadar ağır hale geldiğini bildirmek de önemlidir. CSs belirli bir pozisyonda kendi başlarına oturup gerçeğine dayanarak, biz onları coverlip uymak yapmak gerekmez, çoğu laboratuvarlarda tek kardiyak hücreler ile yapılan aksine.

Kardiyak troponin T, CD31/PECAM ve PECAM 'a karşı antikorlarla boyanmış CS'lerin mikroskobik analizi (sırasıyla ICAM, HCAEC ve HCF'ler için belirteç olarak) endotel hücre ağının oluşumunu göstermiştir(Şekil 1, mavi). CS'lerin iç kısmında nekrozun tamamen dışlanabilmesi için laboratuvarımızda kalcein-AM/ethidium homodimer lekeli CSs'lerin konfokal analizi ile hücre canlılığının mekansal değerlendirmesi yapılmıştır (veriler gösterilmemiştir). Ancak, biyofabrikasyon alanında gelecekteki gelişmeler daha iyi vivo insan kalbinin tipik diğer karmaşık özellikleri özetlemek için kabul etmek önemlidir, şu anda mevcut modelde mevcut değil. Bunlar: i) erişkin kardiyomiyositlerin tipik kontraktil fonksiyonu; ii) kan akışı ve basınç kuvvetleri; iii) parakrin sinyalizasyon; iv) bağışıklık yanıtı, bu ve diğer in vitro kardiyak modelleri geliştirmek için kritik olacak6. Diğer herhangi bir model sağlıklı bir doku ya da hastalık durumunun temel özelliklerini yeniden özetlemeyi amaçladığı için, bu makalede açıklanan CS'nin üretimi ve kullanımına yönelik protokol, araştırmacının bu yaklaşımla ayrıntılı olmayan belirli soruları ele almalarına yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Örneğin, CSs üretimi için hasta kaynaklı hücrelerin potansiyel kullanımı kişiselleştirilmiş tıp için araçlar sağlayacak, şu anda kardiyovasküler araştırma için yaygın olarak kullanılabilir yüksek iş letiyet tahlilleri kullanarak mevcut değil.

Sonuç olarak, kalp hücreleri kullanarak insan kalbi mikroçevresini daha iyi yeniden özetlemek için basit bir yol gösterdik. Kardiyak spheroidler, insan kalbinde bulunan bir hücre ağını, kardiyak hücrelerin monokatmanlı kültürlerine göre daha iyi özetleyen bir endotel hücre ağı sunarlar. Benzersiz özellikleri göz önüne alındığında, onlar kardiyovasküler araştırma için in vitro test için gelişmiş araçları temsil. Hasta kaynaklı hücreleri kullanarak gelecekteki çalışmalar kardiyovasküler hastalığı önlemek ve daha iyi tedavi etmek için kişiselleştirilmiş tıp ve yeni tedaviler için seçenekler sağlayabilir.

Teşekkürler

Kayıt ve video düzenleme için Nat Johnston için özel bir teşekkür.

Poonam Sharma, Newcastle Üniversitesi tarafından UNIPRS ve UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) burslarıyla desteklendi. Carmine Gentile bir UTS Tohum Fonu, Yetişkin Kök Hücre Araştırma için Sydney Grant Katolik Başpiskoposluk ve Sydney Tıp Fakültesi Vakfı Kardiyotorasik Cerrahi Araştırma Grant tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA1933
Eşek anti-fare İkincil AntikorlarıJackson İmmünolojik Araştırma Laboratuvarları, Inc.715-165-150Siyanin Cy3-konjuge ikincil antikor
Doksorubisin hidroklorürSigma-AldrichD1515
FibronektinSigma-AldrichF1141-1MGSığır Plazmasından
İnsan kardiyak fibroblastları (HCF'ler)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, ABD306AK-05a5x10^5 Hücreler (Yetişkin), Orta ve Subkültür Reaktifleri
İnsan koroner arter endotel hücreleri (HCAEC'ler)Cell Applications, Inc., San Diego, CA, ABD300K-05a5x10^5 Hücreler (Yetişkin), Orta ve Alt Kültür Reaktifleri
İnsan iPSC'den türetilmiş kardiyomiyositler (iCM'ler)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Kardiyomiyosit Kiti, 01434
HCF Büyüme ortamıHücre Uygulamaları, Inc., San Diego, CA, ABD316-500
İnsan MesoEndo Hücre Büyüme OrtamıHücre Uygulamaları, Inc., San Diego, CA, ABD212-500
CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite KitiInvitrogen, Carlsbad, CA, ABDL3224
Bakım Ortamı (iCells)Fujifilm Cellular Dinamikler A.Ş.R1057iCell Kardiyomiyosit Kiti, 01434
Fare Monoklonal anti-insan CD31 / PECAMBD Pharmingen, San Diego, CA, ABD566177
NucBlue Live ReadyProbe Reaktifi (Hoechst 33342)Invitrogen, Carlsbad, CA, ABDR37605
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148
Fosfat Tamponlu SalinSigma-AldrichD8537
Kaplama Ortamı (iCells)Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.R1057iCell Kardiyomiyositler Kiti, 01434
Sıçan Kuyruğu KollajenSigma-AldrichC3867
Sodyum AzidSigma-AldrichS2002
Tripsin ve ndash; EDTA, %0,25Gibco, Thermofisher Scientific25200072
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Gibco, Thermofisher Scientific15250061
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
Doku kültürü şişeleri (T25)Thermofisher Scientific156367
96 oyuklu Düz Şeffaf Tabanlı Siyah Polistiren TC ile tedavi edilmiş MikroplakalarCorning, New York, ABD3603
384 Kuyulu Asma Damla Plakası3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, ABDHDP1385

Kaynaklar

  1. Dzobo, K., et al. Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine. Stem Cells International. 2018, 2495848(2018).
  2. Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. Myocardial tissue engineering for cardiac repair. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).
  3. Sekiya, S., Shimizu, T. Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue. Inflammation and Regeneration. 37, 25(2017).
  4. Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation. Einstein. 16 (3), Sao Paulo. 4538(2018).
  5. Pena, B., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079(2018).
  6. Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).
  7. Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts. Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).
  8. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature. Advanced Functional Materials. (1910811), 23(2020).
  9. O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95(2019).
  10. Gentile, C. Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology. Current Stem Cell Research & Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).
  11. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  12. Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation. Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).
  13. Sweeney, M., Foldes, G. It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154(2018).
  14. Polonchuk, L., et al. Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment. Scientific Reports. 7 (1), 7005(2017).
  15. Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy. Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).
  16. Langhans, S. A. Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. 3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).
  18. Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147(2018).
  19. Grounds, M. D. Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).
  20. Campbell, M., et al. Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Reis, R. L. , Academic Press. Oxford. 387-393 (2019).
  21. Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis. Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).
  22. Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).
  23. Pagliari, S., et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 5, 210(2014).
  24. Gentile, C., et al. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).
  25. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).
  26. Fleming, P. A., et al. Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels. Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).
  27. Traore, M. A., George, S. C. Tissue Engineering the Vascular Tree. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  28. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  29. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).
  30. Kalyanaraman, B. Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree. Redox Biology. 29, 101394(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Kalp ModeliKo k lt r Tekni iAs l Damla K lt rKonfokal MikroskopiKontraktil Aktivite l mDoksorubisin Toksisite AnaliziEndotel H cre AH cre D Matriks ProteinleriKardiyomiyosit zolasyonu

İlgili makaleler