Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 Şubat 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Bu makalede

Özet

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Özet

Giderek yaşlanan toplumumuz, nörodejeneratif hastalıkların artan insidansına yol açmaktadır. Şimdiye kadar, patolojik mekanizmalar yeterince anlaşılmamış, bu nedenle tanımlanmış tedavilerin kurulmasını engellemiştir. Koruyucu bir faktörün artan ekspresyonu için hücre bazlı katkı gen tedavileri, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için umut verici bir seçenek olarak kabul edilir. Sinir sisteminde nöroprotektif ve anti-anjiyojenik bir protein olarak karakterize edilen pigment epitel kaynaklı faktörü (PEDF) kodlayan genin, Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak primer insan pigment epitel (PE) hücrelerinin genomuna stabil ekspresyonu için bir yöntem geliştirdik. Primer PE hücreleri insan donör gözlerinden izole edildi ve kültürde tutuldu. Birleşmeye ulaştıktan sonra, 11 μL resüspansiyon tamponunda 1 x 104 hücre askıya alındı ve 30 ng hiperaktif SB (SB100X) transpozaz plazmidi ve 470 ng PEDF transpozon plazmidi içeren 2 μL saflaştırılmış bir çözelti ile birleştirildi. Genetik modifikasyon, aşağıdaki parametreler kullanılarak kılcal bir elektroporasyon sistemi ile gerçekleştirildi: 1.100 V voltajlı ve 20 ms genişliğinde iki darbe. Transfekte hücreler, fetal sığır serumu ile desteklenmiş ortam içeren kültür plakalarına aktarıldı; antibiyotikler ve antimikotikler ilk orta değişim ile eklendi. Başarılı transfeksiyon bağımsız olarak yapılan deneylerde gösterilmiştir. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), PEDF transgeninin artmış ekspresyonunu gösterdi. PEDF sekresyonu, immünoblotlama ile değerlendirildiği ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldüğü gibi anlamlı derecede yükselmiş ve stabil kalmıştır. SB100X aracılı transfer, PE hücrelerinin genomuna stabil bir PEDF gen entegrasyonuna izin verdi ve AMD veya diğer retinal dejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hücre bazlı bir gen ekleme tedavisinin geliştirilmesi için kritik olan PEDF'nin sürekli salgılanmasını sağladı. Dahası, PEDF transpozonunun insan PE hücrelerine entegrasyon profilinin analizi, neredeyse rastgele bir genomik dağılım olduğunu göstermiştir.

Giriş

İleri yaş, nörodejeneratif hastalıklar için ana risk olarak tanımlanmaktadır. 60 yaşından büyük hastalarda ciddi görme kaybına yol açan poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), körlük ve görme bozukluğunun en yaygın dört nedenine aittir1 ve 2040 yılında 288 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir2. Koryokapillaris ve retinal fotoreseptörler arasında sıkıca paketlenmiş hücrelerin tek bir tabakası olan retinal pigment epitelinin (RPE) disfonksiyonları, AMD'nin patogenezine katkıda bulunur. RPE, normal bir retina fonksiyonu3 için gerekli olan birçok görevi yerine getirir ve retinanın ve koryokapilarisin yapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan çeşitli büyüme faktörlerini ve faktörlerini salgılar, böylece fotoreseptör sağkalımını destekler ve dolaşım ve besin tedariki için bir temel sağlar.

Sağlıklı gözlerde, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF), vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) etkilerini dengelemekten sorumludur ve nöronları apoptoza karşı korur, endotel hücre proliferasyonunu önler ve kılcal endoteli stabilize eder. Değişmiş bir VEGF-PEDF oranı, hayvan modelleri 4,5'te ve AMD ve proliferatif diyabetik retinopatiye bağlı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) olan hastaların örneklerinde gözlenen oküler neovaskülarizasyon ile ilişkilidir 6,7,8,9,10 . Gelişmiş VEGF konsantrasyonu, mevcut standart tedavinin hedefidir. Anti-VEGF farmasötikler bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ve en son brolucizumab CNV hastalarının yaklaşık üçte birinde görme keskinliğini arttırır veya vakaların% 90'ında görmeyi stabilize eder11,12,13. Bununla birlikte, sıklıkla, genellikle aylık intravitreal enjeksiyonlar, advers olay riski taşır14, hasta uyumunu bozar ve sağlık sistemleri için önemli bir ekonomik yük oluşturur15. Ayrıca, hastaların belirli bir yüzdesi (% 2-% 20) anti-VEGF tedavisine cevap vermemekte veya sadece zayıf tepki vermektedir16,17,18,19. Bu negatif eşlik edenler, göz içi implantlar, hücre ve/veya gen terapötik yaklaşımlar gibi alternatif tedavilerin geliştirilmesini gerektirmektedir.

Gen terapisi, kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalıklar için umut verici bir tedavi olarak gelişmiştir ve fonksiyonel olmayan gen dizilerini restore etmeyi veya arızalı olanları bastırmayı amaçlamaktadır. Etken faktörlerin tanımlanması ve değiştirilmesinin pek mümkün olmadığı poligenik hastalıklar için, stratejiler koruyucu bir faktörün sürekli olarak verilmesini amaçlamaktadır. AMD durumunda, endostatin ve anjiyostatin20'nin kararlı ekspresyonu, VEGF antagonisti çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT-1) 21,22, farklılaşmanın tamamlayıcı düzenleyici protein kümesi 59 (CD59)23 veya PEDF24,25 gibi çeşitli katkı tedavileri geliştirilmiştir. . Göz ve özellikle retina, kapalı yapısı, iyi erişilebilirliği, küçük boyutu ve bağışıklık ayrıcalığı nedeniyle gen bazlı bir ilaç için mükemmel bir hedeftir, böylece düşük terapötik dozların lokalize bir şekilde verilmesine izin verir ve nakillerin reddedilmeye daha az duyarlı hale getirilmesine izin verir. Ayrıca, göz non-invaziv izlemeye olanak tanır ve retina farklı görüntüleme teknikleri ile incelenebilir.

Viral vektörler, yüksek transdüksiyon verimlilikleri nedeniyle, terapötik genleri hedef hücrelere iletmek için ana araçtır. Bununla birlikte, kullanılan viral vektöre bağlı olarak, immün ve inflamatuar yanıtlar26, mutajenik ve onkojenik etkiler 27,28 veya diğer dokularda yayılma29 gibi farklı advers reaksiyonlar tanımlanmıştır. Pratik sınırlamalar arasında sınırlı bir ambalaj boyutu30'un yanı sıra31,32 klinik sınıf lotlarının üretimi ile ilgili zorluklar ve maliyetler bulunmaktadır. Bu dezavantajlar, lipo / polipleksler, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılan viral olmayan, plazmid bazlı vektörlerin daha da geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bununla birlikte, transgenin konakçı genomuna genomik entegrasyonu genellikle plazmid vektörleri ile desteklenmez, böylece geçici bir ekspresyon ile sonuçlanır.

Transpozonlar, genom içindeki konumlarını değiştiren doğal olarak oluşan DNA fragmanlarıdır, bu da gen terapisi için benimsenmiş bir özelliktir. Aktif bir entegrasyon mekanizması nedeniyle, transpozon tabanlı vektör sistemleri, yerleştirilen transgenin sürekli ve sabit bir ifadesine izin verir. Uyuyan Güzel (SB) transpozonu, balık33'te bulunan eski bir Tc1 / denizci tipi transpozondan yeniden oluşturulmuş ve hiperaktif varyant SB100X34 ile sonuçlanan moleküler evrimle daha da geliştirilmiş, çeşitli birincil hücrelerde verimli transpozisyon sağlamıştır ve farklı hastalık modellerinde fenotipik düzeltme için kullanılmıştır35. Şu anda, SB transpozon sistemi kullanılarak 13 klinik çalışma başlatılmıştır. SB100X transpozon sistemi iki bileşenden oluşur: terminal ters çevrilmiş tekrarlar (TIR'lar) tarafından kuşatılan ilgi genini içeren transpozon ve transpozonu harekete geçiren transpozaz. Plazmid DNA'sının hücrelere verilmesini takiben, transpozaz TIR'ları bağlar ve transpozonun eksizyonunu ve hücrenin genomuna entegrasyonunu katalize eder.

Neovasküler AMD tedavisi için viral olmayan hücre bazlı bir katkı maddesi tedavisi geliştirdik. Yaklaşım, PEDF geninin SB100X transpozon sistemi 36,37,38 aracılığıyla primer pigment epitel (PE) hücrelerine elektroporasyon bazlı yerleştirilmesini içerir. Transpozaz ve PEDF'nin genetik bilgisi ayrı plazmidler üzerinde sağlanır, böylece ideal SB100X-PEDF transpozon oranının ayarlanmasını sağlar. Elektroporasyon, yüzey alanlarını en aza indirirken elektrotlar arasında maksimum boşluk boyutu ile karakterize edilen pipet bazlı bir kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Cihazın çok çeşitli memeli hücrelerinde mükemmel transfeksiyon oranları elde ettiği gösterilmiştir 39,40,41. Küçük elektrot yüzey alanı düzgün bir elektrik alanı sağlar ve elektroliz42'nin çeşitli yan etkilerini azaltır.

Transfekte pigment epitel hücreleri tarafından salgılanan PEDF'nin anti-anjiyojenik işlevselliği, insan göbek damarı endotel hücrelerinin filizlenme, göç ve apoptozunu analiz eden çeşitli in vitro deneylerde gösterilmiştir43. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonunun tavşan modelinde PEDF-transfekte hücrelerin transplantasyonu44 ve CNV 43,45,46'nın sıçan modelinde neovaskülarizasyonun azaldığını göstermiştir.

Burada, kılcal transfeksiyon sistemi kullanarak SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Transfekte edilen hücreler 21 gün boyunca kültürde tutuldu ve daha sonra kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile PEDF gen ekspresyonu ve immünoblotasyon ve enzime bağlı immünosorbent testi ile PEDF protein sekresyonu açısından analiz edildi (ELISA, Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan donör gözleri, Helsinki protokolleri Deklarasyonu'na uygun olarak bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra Oftalmoloji Bölümü Aachen Cornea Bankası'ndan (RWTH Aachen Üniversite Hastanesi) alınmıştır. İnsan örneklerinin toplanması ve kullanılmasına ilişkin prosedürler kurumsal etik kurul tarafından onaylanmıştır.

1. Birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonu

  1. Steril koruyucu giysiler ve eldivenler yerleştirin. Laminer bir akışın altına steril bir örtü yerleştirin.
  2. Steril hazırlama aletlerini ve diğer gerekli steril ekipmanları laminer akışın altına yerleştirin.
  3. Göz kürelerinin alınışını, preparatın başlangıcını ve olası anormallikleri kaydedin. Donörün yaşını, cinsiyetini, ölüm nedenini ve ölüm zamanı ile gözün çıkarılması arasındaki süreyi kaydedin.
  4. Göz küresini steril bir gazlı bez sıkıştırmasına yerleştirin ve bir elinizde tutun.
  5. Ön segmenti arka segmentten bir neşter ve ekstra ince sivri uçlu bir göz makası kullanarak limbusa yaklaşık 3,5 mm posterior çevresel bir kesimle ayırın.
  6. Arka segmenti aşağı doğru yatırdıktan sonra, kolibri forseps kullanarak vitreus ve retinayı dikkatlice çıkarın.
  7. Çökmüş RPE / choroidea kompleksini düz iris forseps kullanarak gizlice yeniden düzenleyin ve daha sonra kavisli iris forseps ile pozisyonda tutun.
  8. Arka göz kapağını, %10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U/mL penisilin ve 80 μg/mL streptomisin (Pen/Strep) ve 2,5 μg/mL amfoterisin B (AmfoB) ile desteklenmiş 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Ham'ın F-12 Besin Karışımı (DMEM/F12) ile doldurun.
    NOT: Birincil RPE hücrelerinin domuz veya sığır gözlerindenizolasyonunun aksine, 36,37, arka göz kapağının tripsin ile doldurulması ve inkübe edilmesi gerekmez.
  9. Retinal pigment epitelini optik sinirden limbüse doğru ateşle parlatılmış kavisli bir cam Pasteur pipetle nazikçe fırçalayarak RPE / choroidea kompleksini kolibri forseps kullanarak limbusta sabitleyerek RPE hücrelerini toplayın. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabına aktarın.
  10. 1.8 ve 1.9 adımlarını tekrarlayın ve Petri kabındaki tüm hücreleri toplayın. Tek kanallı pipet (100-1.000 μL) kullanarak yukarı ve aşağı pipet yaparak hücre süspansiyonunu dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın.
  11. Her bir göz küresinin RPE hücre süspansiyonunu 24 delikli bir hücre kültürü plakasının üç kuyucuğuna tohumlayın ve FBS, Pen / Strep ve AmfoB ile desteklenmiş DMEM / F12 ile 1 mL'ye kadar doldurun.
  12. RPE hücre kültürlerini, birleşime ulaşana kadar% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de tutun. Hücre kültürü ortamını haftada iki kez değiştirin.

2. Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu

  1. SB100X transpozaz/PEDF transpozon plazmid karışımının hazırlanması
    1. SB100X transpozaz ve PEDF transpozon plazmid DNA'sını, üreticinin protokolüne göre transfeksiyon gibi uygulamalarda kullanıma uygun olduğu belirlenen geleneksel plazmid saflaştırma kitlerini kullanarak saflaştırın.
    2. Plazmid DNA içeriğini bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak ölçün ve bunları 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) ile 250 ng / μL konsantrasyonuna ayarlayın.
    3. 250 ng/μL SB100X transpozaz plazmid DNA'sının (örneğin, 2.5 μL) bir kısmını, 16 porsiyon 250 ng/μL PEDF transpozon plazmid DNA'sı (örneğin, 40 μL) ile karıştırın. Kalıntı plazmid karışımı -20 °C'de saklanabilir.
      NOT: Plazmid karışımının tekrarlanan çoklu dondurma ve çözme döngülerinden kaçınılmalıdır.
    4. 29,4 ng SB100X transpozaz plazmidi ve 470,6 ng PEDF transpozon plazmidi içeren SB100X transpozon plazmid karışımının 2 μL'sini steril 1,5 mL güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hücrelerle karışana kadar buz üzerinde tutun.
  2. Kılcal transfeksiyon sisteminin kurulması
    NOT: Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu, üreticinin protokolüne göre 10 μL kiti kullanılarak kılcal transfeksiyon sistemi aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. Sistem transfeksiyon cihazını, transfeksiyon pipetini ve pipet istasyonunu içerir. Kit 10 μL transfeksiyon uçları, tampon tüpler, elektrolitik tampon E (tampon E) ve resüsitasyon tamponu R (tampon R) içerir.
    1. Pipet istasyonunu transfeksiyon cihazına bağlayın.
    2. Bir tampon tüpünü 3 mL tampon E ile doldurun ve bir tıklama sesi duyulana kadar pipet istasyonuna takın.
      NOT: Tampon tüpünün yan elektrodunun pipet istasyonunun yan bilyalı pistonuna bağlı olduğundan emin olun.
    3. Birincil insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu için, transfeksiyon cihazında aşağıdaki darbe koşullarını ayarlayın: 1.100 V (darbe voltajı), 20 ms (darbe genişliği), iki darbe (darbe sayısı).
  3. Ekili birincil insan RPE hücrelerinin hazırlanması
    1. Faz kontrast mikroskobu ile primer RPE hücre kültürlerinin şeklini ve morfolojisini belgeleyin. RPE hücrelerinin birleşik ve entegre bir tek katmana büyümesini göstermek için düşük büyütmeli mikrografların yanı sıra RPE hücrelerinin tipik parke taşı morfolojisine işaret etmek için daha yüksek büyütmeli mikrograflar alın.
    2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri 1 mL tamponlu fosfat salin (PBS, pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
    3. Primer insan RPE hücrelerini, 7-15 dakika (maksimum) boyunca% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de% 0.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsinize edin. Hücre ayrılmasını mikroskobik olarak kontrol edin.
    4. FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM / F12 ile tripsinizasyonu durdurun. Bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için 20 μL aliquot alın. RPE hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj yapın.
    5. 20 μL aliquot'u 20 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Pipet, hemositometrenin her yarısında 10 μL ve hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında sayar.
    6. Santrifüjlemeden sonra, RPE hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
    7. Transfeksiyon reaksiyonu başına 10.000-100.000 RPE hücresi alın ve bunları 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj edin.
      NOT: Elektrik alan uygulaması ve plazmid DNA'sının eklenmesi ile transfeksiyon reaksiyonlarının yanı sıra, her yaklaşım iki farklı kontrol kültürü içerir: (1) elektrik alan uygulaması olmadan ve plazmid DNA'sı olmadan; (2) elektrik alan uygulaması ile, ancak plazmid DNA'sı olmadan.
    8. Hücre peletini 11 μL tampon R'de yeniden askıya alın ve SB100X transpozaz/PEDF transpozon plazmid karışımının 2 μL'si ile birleştirin (bkz. adım 2.1.4).
      NOT: R tamponunda yeniden süspansiyondan sonra, hücre canlılığında ve transfeksiyon verimliliğinde bir azalmayı önlemek için hücreler 15 dakika içinde işlenmelidir.
    9. Transfeksiyon pipetinin kafasını, kelepçe pistonun montaj sapını tamamen alana kadar 10 μL transfeksiyon ucuna yerleştirin. Hücre/plazmid çözeltisini transfeksiyon ucuna çekin.
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşmasından ve bunların transfeksiyon ucuna aspirasyonunu önleyin.
    10. FBS ile desteklenmiş, ancak Pen / Strep olmadan ve AmfoB olmadan, 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının gerekli sayıda kuyucuğuna 1 mL DMEM / F12 sağlayın.
  4. Elektroporasyon işlemi
    1. Transfeksiyon pipetini, bir tıklama sesi duyulana kadar pipet istasyonuna yerleştirilen tampon tüpüne yerleştirin (bkz. adım 2.2.2).
      NOT: Transfeksiyon pipetinin metal kafasının, pipet istasyonunun içindeki bilyalı pistona ve tampon tüpüne bağlı olduğundan emin olun.
    2. Transfeksiyon cihazının dokunmatik ekranında Başlat'a basın. Elektrik darbesinin uygulanmasından önce, cihaz tampon tüpünün ve transfeksiyon pipetinin düzgün bir şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini otomatik olarak kontrol eder. Elektrik darbeleri teslim edildikten sonra, dokunmatik ekranda Tamamlandı görüntülenir.
    3. Transfeksiyon pipetini pipet istasyonundan dikkatlice çıkarın ve hücre/plazmid çözeltisini hücre kültürü plakasının hazırlanan kuyucuklarına pipetleyerek elektroporated hücreleri derhal 10 μL transfeksiyon ucundan serbest bırakın (bkz. adım 2.3.10).
    4. Transfekte RPE hücre kültürlerini 37 ° C'de% 95 hava ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde tutun. Elektroporasyondan 3 gün sonra ilk orta değişim ile Pen / Strep ve AmphoB ekleyin.

3. Transfekte primer insan RPE hücrelerinin analizleri

  1. Numune hazırlama
    1. 3 haftalık bir yetiştirme süresinden sonra, RPE hücre kültürlerini FBS, Pen / Strep ve AmfoB ile desteklenmiş 1.0 mL DMEM / F12'lik tanımlanmış bir hacimde 24 saatlik tanımlanmış bir süre boyunca inkübe edin.
    2. Hücre kültürü süpernatantlarını alın ve daha yakın bir zamana kadar -20 ° C'de veya termal olarak kararsız numuneler ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
    3. Transfekte RPE hücre kültürlerini 37 °C'de 0,5 mL% 0,05 tripsin-EDTA ile, nemlendirilmiş bir atmosferde% 95 hava ve% 5 CO2 ile 10 dakika boyunca tripsinize edin.
    4. FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM / F12 ile tripsinizasyonu durdurun. Bir hemositometre kullanarak hücre sayımı için küçük alikotlar alın (bkz. adım 2.3.5). RPE hücre süspansiyonlarını 10 dakika boyunca 106 x g'de santrifüj edin.
    5. RPE hücre peletlerini bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.
  2. PEDF sekresyonunun western blotlama ile değerlendirilmesi
    NOT: Kalitatif bir değerlendirme için, hücre kültürü süpernatantları (bkz. adım 3.1.2), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve müteakip batı lekelenmesi yoluyla analiz edilir. Bağımlı olarak PEDF transpozon plazmid DNA'sı kullanıldığında, süpernatantların farklı şekilde işlenmesi gerekir.
    1. His-etiketli PEDF füzyon proteinlerinin hücre kültürü süpernatantlarından saflaştırılması
      1. Konik kesilmiş bir uç kullanarak numune başına 30 μL nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) bulamacı alın ve Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin (30 s için 2.660 x g).
      2. Ni-NTA reçinesini 200 μL 1x inkübasyon tamponu (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) ile dikkatlice yeniden askıya alın ve santrifüjleme yoluyla (30 s için 2.660 x g) pelet edin.
      3. Önceki adımı tekrarlayın.
      4. Ni-NTA reçinesini, numune başına 40 μL 4x inkübasyon tamponu (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) ile dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın.
      5. 900 μL hücre kültürü süpernatantını 260 μL 4x inkübasyon tamponu ve 55 μL ön işlemden geçirilmiş Ni-NTA bulamacı ile karıştırın (bkz. adım 3.2.1.4).
      6. Karışımı 60 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      7. Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet (60 s için 2660 x g).
      8. Ni-NTA reçinesini 175 μL 1x inkübasyon tamponu ve santrifüjleme yoluyla pelet reçinesi (60 s için 2.660 x g) ile dikkatlice yeniden askıya alın.
      9. Önceki adımı tekrarlayın.
      10. Ni-NTA reçinesini 30 μL elüsyon tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) ile dikkatlice yeniden askıya alın ve karışımı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
      11. Ni-NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin (30 s için 2.660 x g).
      12. Süpernatantı dikkatlice alın ve 2x SDS numune tamponu47 ile karıştırın.
      13. Karışımı 95 ° C'de 5 dakika ısıtın ve Ni-NTA saflaştırılmış proteinleri %10'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayırın.
      14. Daha önce tarif edildiği gibi anti-Penta-His antikorları (fare monoklonal, 1:500) ve yaban turpu peroksidaz (HRP)-konjuge anti-fare antikorları (tavşan poliklonal, 1:1,000) kullanarak batı lekelemesi yapın36,37.
    2. Etiketlenmemiş PEDF proteinlerinin doğrudan analizi
      1. 15 μL hücre kültürü süpernatantı alın ve 2x SDS numune tamponu47 ile karıştırın.
      2. Karışımı 95 ° C'de 5 dakika ısıtın ve proteinleri% 10'luk bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayırın.
      3. Daha önce tarif edildiği gibi anti-insan PEDF antikorları (tavşan poliklonal, 1: 4.000) ve HRP konjuge anti-tavşan antikorları (keçi poliklonal, 1: 2.000) kullanarak batı lekelemesi yapın38.
    3. ELISA ile PEDF sekresyonunun nicelleştirilmesi
      1. Üreticinin protokolüne göre bir insan PEDF ELISA kiti kullanarak hücre kültürü süpernatantlarını analiz edin (bkz. adım 3.1.2).
      2. Salgılanan PEDF miktarını, her transfeksiyon reaksiyonu için belirlenen zamana ve hücre sayısına bağlayın (bkz. adım 3.1.4).
    4. Transfekte RPE hücrelerinde PEDF gen ekspresyonunun analizi
      1. Toplam RNA'yı RPE hücre peletlerinden izole edin (bkz. adım 3.1.5), üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak.
      2. RNA içeriğini bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak ölçün.
      3. Üreticinin protokolüne göre bir ters transkripsiyon sistemi kullanarak 0.1 μg RNA üzerinde ters transkripsiyon gerçekleştirin.
      4. Daha önce açıklandığı gibi gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirin38.
    5. Transfekte RPE hücrelerinde transgen yerleştirme bölgelerinin analizi
      1. Genomik DNA'yı RPE hücre peletlerinden izole edin (bkz. adım 3.1.5), üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak.
      2. Bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak DNA içeriğini ölçün.
      3. Daha önce açıklandığı gibi hesaplama destekli hemi'ye özgü PCR şeması kullanarak ekleme sitesi kitaplıkları oluşturun38.
      4. Daha önce açıklandığı gibi hesaplamalı analiz yapın38.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Birincil insan RPE hücrelerinin yetiştirilmesi ve elektroporasyonu
Yeterli sayıda hayvansal kökenli birincil RPE hücresinin tohumlanmasının, pigmentli, altıgen şekilli hücrelerin entegre bir tek katmanlı 36,37,48'e yetiştirilmesine ve büyümesine izin verdiğini gösterdik. Sıkı kavşaklar oluşturma, fagositik aktivite gösterme ve spesifik belirteç genlerini in vitro

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Projemizde, transfekte edilen hücrelerin koruyucu bir ortamın kurulması ve sürdürülmesi için uzun süreli terapötik olarak kullanılması amacıyla sürekli olarak aşırı eksprese edilen ve etkili bir faktör salgılayan genetiği değiştirilmiş primer RPE hücrelerinin viral olmayan üretimini hedefliyoruz. Anti-anjiyojenik ve nöroprotektif fonksiyonlara sahip, her yerde eksprese edilen çok fonksiyonlu bir protein olan PEDF'yi kodlayan genin tanıtımını yaptık. Burada açıklanan protokol, SB100X transpozon sistemini kullanar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Zoltán Ivics ve Zsuzsanna Izsvák, SB transpozon teknolojisi üzerine çeşitli patentlerin mucitleridir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin araştırma, teknolojik geliştirme ve gösterim için Yedinci Çerçeve Programı, 305134 no'lu hibe anlaşması ile desteklenmiştir. Zsuzsanna Izsvák, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) tarafından finanse edildi. Yazarlar, mükemmel teknik destek için Anna Dobias ve Antje Schiefer'e (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) ve insan donör gözlerini sağladıkları için Aachen Cornea Bank'a (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonu
24 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıEppendorf, Hamburg, Almanya0030722019
Amfoterisin B [250 & mikro; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlmanyaA2942
Colibri ForsepsGeuder, Heidelberg, AlmanyaG-18950
Kavisli İris Forseps Geuder, Heidelberg, AlmanyaG-18856
Tek Kullanımlık Neşter (No. 11)Tüy, Osaka, Japonya
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Jambon' s F-12 Besin Karışımı (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP04-41150
Ekstra İnce Sivri Göz Makası Geuder, Heidelberg, AlmanyaG-19405
Fetal Sığır Serumu [0.2 & mikro; m Steril Filtreli] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP40-37500
Cam Pastör PipetleriMarkası, Wertheim, Almanya747715
Penisilin [10.000 ünite/mL] ve Streptomisin [10 mg/mL] (Kalem/Strep)Merck, Darmstadt, AlmanyaP0781
Pipet Uçları (1000 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (100-1000 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Steril ÖrtüLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Almanya
Steril Gazlı Bez Kompres Fink-Walter, Merchweiler, Almanya321063
Steril EldivenlerSempermed, Wien, Avusturya
Steril Petri Kabı (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Steril Cerrahi ÖnlükHalyard Health, Alpharetta, GA
Düz İris Forseps Geuder, Heidelberg, AlmanyaG-18855
Primer insan RPE hücrelerinin elektroporasyonu
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12 Kuyulu Hücre KültürüPlakası Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıEppendorf, Hamburg, Almanya
Amfoterisin B [250 & mikro; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlmanyaA2942
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Jambon' s F-12 Besin Karışımı (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP04-41150
Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 mL)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Fetal Sığır Serumu [0.2 ve mikro; m Steril Filtreli] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP40-37500
Ters MikroskopLeica Mikrosysteme, Wetzlar, AlmanyaLeica DMi8
Mikrohacim Spektrofotometresi (NanoDrop Spektrofotometresi)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Kılcal Transfeksiyon Sistemi (Neon Transfeksiyon Sistemi)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Neon Transfeksiyon Sistemi 10 & L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemositometre (Neubauer Odası)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Almanya0640110
PBS Dulbecco, Ca2+ Mg2+Biochrom olmadan, Berlin, AlmanyaL182-50
Penisilin [10.000 ünite/mL] ve Streptomisin [10 mg/mL] (Kalem/Strep)Merck, Darmstadt, AlmanyaP0781
Pipet Uçları (10 ve mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Pipet Uçları (1000 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Pipet Uçları (200 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Plazmid Maxi KitQiagen, Hilden, Almanya12163
Tek Kanallı Pipet (0.1-10 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (100-1000 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (10-200 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tripan Mavisi ÇözeltisiMerck, Darmstadt, AlmanyaT8154
Tripsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Transfekte edilmiş primer insan RPE hücrelerinin analizleri
10% SDS-Poliakrilamid Jel
1x İnkübasyon Tamponu (50 mM NaH2< / sub>PO4< / sub>, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0)
2x SDS Numune Tamponu
4x İnkübasyon Tamponu (200 mM NaH2< / sub>PO4< / sub>, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0)
Amersham Protran Destekli 0.2 & mikro; m  Nitroselüloz Lekeleme MembranıCytiva, Marlborough, MA10600015
Amfoterisin B [250 & mikro; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlmanyaA2942
Anti-PEDF Antikorları (Tavşan Poliklonal)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anti-Penta-His Antikorları (Fare Monoklonal)Qiagen, Hilden, Almanya34660
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Jambon' s F-12 Besin Karışımı (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP04-41150
Elüsyon Tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) 
Fetal Sığır Serumu [0.2 & mikro; m Steril Filtreli] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlmanyaP40-37500
Hemositometre (Neubauer Odası)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Almanya0640110
Yaban turpu Peroksidaz konjuge anti-fare antikorları (tavşan poliklonal)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Yaban turpu peroksidaz konjuge anti-tavşan antikorları (keçi poliklonal)Abcam, Cambridge, Birleşik Krallıkab6721
İnsan PEDF ELISA Kiti BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Görüntüleme SistemiFujifilm, Minato, Japonya
LightCycler 1.2 EnstrümanRoche Yaşam Bilimleri, Penzberg, Almanya
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Almanya12239264001
LightCycler  Kılcal damarlar (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Almanya4929292001
Mikrohacimli Spektrofotometre (NanoDrop Spektrofotometresi)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Tetra Hücre Döküm ModülüBio-Rad Laboratuvarları, Feldkirchen, Almanya1658015
Mini-PROTEAN  Mini Prekast Jeller için Tetra Dikey Elektroforez Hücresi, 4 jelliBio-Rad Laboratuvarları, Feldkirchen, Almanya1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Almanya30410
PageRuler Önceden Boyanmış Protein MerdiveniThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penisilin [10.000 birim / mL] ve Streptomisin [10 mg / mL] (Pen / Strep)Merck, Darmstadt, AlmanyaP0781
Pipet Uçları (10 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Pipet Uçları (1000 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
Pipet Uçları (200 & mikro; L)Starlab, Hamburg, Almanya
PowerPac Temel Güç Kaynağı Bio-RadLaboratuvarları, Feldkirchen, Almanya1645050
QIAamp DNA Mini KitiQiagen, Hilden, Almanya51304
Ters Transkripsiyon Sistemi Promega, Madison, WIA3500
RNaz İçermeyen DNaz SetiQiagen, Hilden, Almanya79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Almanya74104
Sallanan ÇalkalayıcıCole-Parmer, Staffordshire, Birleşik KrallıkSSM3
Güvenli Kilitli Mikrosantrifüj Tüpleri (1,5 mL)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Güvenli Kilitli Mikrosantrifüj Tüpleri (2,0 mL)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (0,1-10 ve mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (100-1000 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Tek Kanallı Pipet (10-200 & mikro; L)Eppendorf, Hamburg, Almanya
Trans-Blot Turbo Transfer SistemiBio-Rad Laboratuvarları, Feldkirchen, Almanya1704150
Tripan Mavi ÇözeltisiMerck, Darmstadt, AlmanyaT8154
Tripsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019MPK5000

Kaynaklar

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PEDF Gen EkspresyonuKapiler ElektroporasyonPlazmit DNA HazırlamaWestern Blot AnaliziELISA KantifikasyonuNikel NTA PurifikasyonuStabil Transgen İntegrasyonu
Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.