Yöntem makalesi

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

DOI:

10.3791/62005

⸱

25 Ocak 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adiposit farklılaşması ve işlevinin altında kalan mekanizmaların anlaşılması, ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre çizgilerinin kullanımından büyük ölçüde yararlanmıştır. Ancak bu kültürlü hücre çizgilerinin sınırlamaları vardır. Şu anda beyaz yağ depolarında var olduğu bilinen heterojen adiposit popülasyonlarının çeşitli fonksiyonel spektrumlarını tam olarak yakalaymıyorlar. Beyaz yağ dokusunun karmaşıklığını incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili bir model sağlamak için, birincil beyaz ve kahverengi adiposit atalarının yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonunu, kültürdeki hızlı genişlemelerini ve in vitro'yu olgun, tamamen işlevsel adipositlere ayırmalarını sağlayacak bir protokol geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Birincil hücreleri yetişkin fareler yerine yenidoğandan izole etmenin birincil avantajı, yağ depolarının aktif olarak gelişmesi ve bu nedenle çoğalan preadipositlerin zengin bir kaynağı olmasıdır. Bu protokol kullanılarak izole edilen birincil preadipositler, birleşmeye ulaştıktan sonra hızla farklılaşır ve yenidoğan farelerde gelişmiş yağ pedlerinin görünümünü doğru bir şekilde yansıtan zamansal bir pencere olan 4-5 gün içinde tamamen olgunlaşır. Bu strateji kullanılarak hazırlanan birincil kültürler, yüksek tekrarlanabilirlik ile genişletilebilir ve incelenebilir, genetik ve fenotipik ekranlar için uygun hale getirilebilir ve genetik fare modellerinin hücre otonom adiposit fenotiplerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, yağ dokusu in vitro karmaşıklığını incelemek için basit, hızlı ve ucuz bir yaklaşım sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obezite, enerji alımı ve enerji harcaması arasındaki kronik dengesizlikten kaynaklanır. Obezite geliştikçe, beyaz adipositler hücre boyutunda mikroçevrimde hipoksi, hücre ölümü, iltihaplanma ve insülin direnci ile sonuçlanan büyük bir genişlemeye uğrar1. İşlevsel olmayan, hipertrofiked adipositler, insülin eylemini sönümledikleri diğer dokularda biriken fazla lipitleri düzgün bir şekildedepolayamazlar 2,3. Adiposit fonksiyonunu iyileştiren ve dokular arasında normal lipid bölünmesini geri kazandıran ajanların tip 2 diyabet gibi insülin direnci ile karakterize obezite ile ilişkili durumların tedavisi için faydalı olacağı öngörülmektedir. 3T3-L1, F442A ve 10T 1/2 gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanan adipositlerdeki fenotipik ekranlar, adipogenez düzenleyen genetik faktörleri tanımlamak ve anti-diyabetik özelliklere sahip anti-adipojenik molekülleri izole etmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, bu hücre çizgileri, hepsi sistemik homeostaz 8 ,9,10'akatkıda bulunan benzersiz özelliklere sahip beyaz, kahverengi, bej ve diğer adiposit alt tiplerini içeren yağ depolarında bulunan hücre tiplerinin heterojenliğini tam olarak yansıtmaz. Ayrıca, kültürlü hücre hatları genellikle dış uyaranlara karşı azalmış bir yanıt gösterir.

Buna karşılık, birincil adiposit kültürleri in vivo adipogenezin karmaşıklığını daha doğru bir şekilde rekapitüle eder ve birincil adipozitler sağlam işlevsel yanıtlar gösterir. Birincil preadipositler tipik olarak yetişkin farelerin yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir11,12,13,14. Bununla birlikte, yetişkin hayvanların yağ depoları öncelikle çok yavaş bir ciro oranına sahip tamamen olgun adipositlerden oluştuğundan15,16,17, bu yaklaşım düşük çoğalma oranına sahip sınırlı miktarda preadiposit verir. Bu nedenle, preadipositlerin yenidoğan farelerden izole edilmesi, in vitro olarak ayırt edilebilen büyük miktarlarda hızla büyüyen hücreler elde etmek için tercih edilir. Burada, in vitro'yu tamamen işlevsel birincil adipositlere genişletilebilen ve ayırt edilebilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositleri verimli bir şekilde izole etmek için Kahn ve ark.18'in birincil kahverengi adipositleri ile yapılan ilk çalışmalardan esinlenen bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1A). Yetişkin farelerin aksine, birincil hücreleri yenidoğandan izole etmenin avantajı, yağ depolarının hızla büyümesi ve böylece aktif olarak çoğalan zengin bir preadiposit kaynağıolmasıdır 17. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış hücreler, kültürlerin hızlı bir şekilde ölçeklendirilmesini sağlayan yüksek proliferatif kapasiteye sahiptir. Ek olarak, yenidoğan yavrularından gelen preadipositler, yetişkin atalardan daha yüksek farklılaşma potansiyeli gösterir, bu da farklılaşma derecesinde iyiden kuyuya değişkenliği azaltır ve böylece tekrarlanabilirliği arttırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Scripps Araştırma Enstitüsü ve Wisconsin Üniversitesi - Madison Tıp ve Halk Sağlığı Okulu'nun tüm IACUC yönergelerini takip eder.

1. Yağ depolarının toplanması ve sindirimi (gün 1)

  1. Her yavru için iki adet 1,5 mL tüp hazırlayın: biri kahverengi yağ dokusu (BAT) ve diğeri beyaz yağ dokusu (WAT) için. 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) + 200 μL 2x izolasyon tamponu (123 mM NaCl, Her tüpe 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2,5 mM glikoz, 100 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), penisilin-streptomisin ve % 4 yağ asidi içermeyen sığır serum albümin. Çözeltileri steril ve buz üzerinde tutun.
  2. Yavruları küçük odalara (örneğin, 6 kuyulu bir tabak kuyusu) yerleştirin ve hipotermik hale gelene kadar buza koyun. Yavrular ve buz arasında doğrudan temas olmadığından emin olun. Bilinç kaybını sağlamak için ucu olan bir pençe batırın ve keskin makas kullanarak kafa keserek yavruları ötenazi edin.
    NOT: Farklı genotiplerle çalışıyorsanız, genotipleme için kuyruk biyopsisi (3 mm kesim) toplamak için ek bir tüp hazırlayın. Genotipleme hemen yapılırsa, ötanazili yavruları yağ depolarını toplamak için diseksiyona kadar buzda tutun.
  3. Tüm depoları sindirmek için gereken kollajenaz miktarını hesaplayın ve tartın. Her tüpe 2x izolasyon tamponunda 50 μL 15 mg/mL kollajenaz tip I ekleyin. Tüm dokular toplanana kadar kollajenazı izolasyon tamponunda yeniden canlandırmayın.
  4. Deri altı WAT toplamak için, yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin (periton yırtılmalarından kaçının) ve cildi bacakların altına hafifçe çekin. Cildi almadan, kuadriseps'in içine veya üstüne bağlı açık (P1 veya daha genç) veya beyaz (P2 ve daha yaşlı), ince, uzun bir doku olarak görünecek yağ deposunu dikkatlice toplayın (Şekil 1B). Yağ deposunun PBS'de durulanması ve 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren tüplerden birine yerleştirin. Buzda kal.
    NOT: P0 ve P1 fareleri en iyi verimi verir. P0-1 yavrularında, deri altı WAT deposu neredeyse şeffaftır. P2 farelerinde ve daha yaşlılarda, deponun tanımlanması daha kolaydır, çünkü zaten beyazlaşıyor, bu da tamamen olgun, lipid yüklü, beyaz adipositlerin varlığını gösteriyor.
  5. Kesişen BAT toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin. BAT'ı - omuz bıçakları arasındaki derin kırmızı dokuyu - kaldırın ve vücuttan ayırmak için her yerinde dikkatlice kesiler yapın (Şekil 1B). Tutarlılık ve renk olup olmadığını kontrol edin; PBS ile durulayın; 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren diğer tüpe yerleştirin; ve buzda kal.
    NOT: P2 farelerinden ve daha büyüklerden BAT toplarken, BAT'ı çevreleyen beyaz yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Cilt ve OMUZ BıÇAKLARI ARASINDA DAHA DERIN OLAN BAT arasında bulunan ince, yumuşak, beyaz bir adiposit tabakasından oluşur.
  6. Tüm depolar toplandıktan sonra, her depoyu (4-6 kez) doğrudan tüplerin içinde küçük makas kullanarak hafifçe kıyın.
  7. 15 mg/mL'de 10x stok çözeltisi elde etmek için kollajenaz tip I'i uygun 2x izolasyon tampon hacminde yeniden depolar. Her tüpe 50 μL 10x kollajenaz ekleyin, tüm tüplere kollajenaz eklenene kadar tüpleri buzda tutun.
  8. Karıştırmak için tüpleri hızlı bir şekilde ters çevirin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın. Numuneleri bir çalkalayıcıda 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın (etkili numune karıştırma için 1.400 rpm frekans).

2. Kaplama preadipositleri (gün 1)

  1. Dokuları sindirdikten sonra tüpleri tekrar buza yerleştirin.
    NOT: Bu adımdan itibaren tüm çalışmalar biyogüvenlik kabininde steril koşullarda gerçekleştirilir.
  2. Sindirilen dokuları 100 μm hücre süzgeçlerinden yeni 50 mL tüplere süzün. Yalnızca WT fareleriyle çalışıyorsanız veya genotipler biliniyorsa, ilgili, ayrışmış BAT'leri bir araya getirin; WAT'ler için bunu tekrarlayın. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için, her tüpü 1 mL izolasyon ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) + %20 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM HEPES, %1 penisilin-streptomisin) ile durulayın ve hücre süzgecinden geçirin. Bilinmeyen genotiplerle çalışıyorsanız, 2.4.
    NOT: FBS, hem preadiposit çoğalmasının hem de farklılaşmanın önemli bir belirleyicisidir. Lotlar arasında yüksek performans ve tutarlılık sağlamak için farklı FBS'leri titizlikle test edin.
  3. BAT ve WAT süspansiyonlarını, her BAT örneği için 6 kuyulu bir plakanın 2-3 kuyularını ve her WAT örneği için 6 kuyulu bir plakanın 4-6 kuyularını plakalamak için seyreltin. Örneğin, 6 BCT ve 6 WAT bir araya getirilmişse, BAT hücre süspansiyonu 24-36 mL'ye kadar ve WAT hücre süspansiyonu 48-72 mL'ye kadar seyreltilir. Kuyu başına hücre süspansiyonlarının plakası 2 mL.
  4. Genotipleri bilinmeyen örnekler için her örneği ayrı tutun; 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunun üzerine 100 μm hücre süzgeci yerleştirin ve kuyu başına bir numune filtreleyin. Tüpü 1,5 mL izolasyon ortamı ile durulayın ve süzgeçten geçirerek son hacmi kuyu başına 2 mL'ye kadar yükseltin. Hücre süzgecini atın, kapağı plakaya yerleştirin ve plakayı inkübatöre aktarın.
    NOT: Kuyulardaki ortam, yüzen kan hücreleri, hücre kalıntıları ve lislenmiş hücrelerden gelen lipitler nedeniyle bulanık görünmelidir.
  5. Kaplamadan sonra 1-1,5 saat, medyayı aspire edin ve serumsuz 2 mL DMEM ile yıkayın. Kan hücrelerini kuyuların dibinden ayırmak için plakayı hafifçe çalkalayın. 3 yıkamadan sonra, 2 mL taze izolasyon ortamı ekleyin ve hücreleri inkübatöre aktarın (37 °C, % 5 CO2).
    NOT: Mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Yüzen malzeme (kan hücreleri, hücresel döküntüler) minimum olmalıdır. Kahverengi preadipositler yarı saydam olmayan küçük hücreler olarak görünürken, beyaz preadipositler daha uzun bir form gösterecektir. Hem kahverengi hem de beyaz preadipositler plakaya sıkıca tutturulmalıdır.

3. Preadiposit kültürünün genişlemesi (2. günden 5. güne)

  1. Ertesi gün, ortamı aspire edin, hücreleri serumsuz 2 mL DMEM ile yıkayın ve izolasyon ortamının 2 mL'lik kısmını geri ekleyin.
  2. Hücreler % 80-90 birleştiğinde 3.1 adımını 2 günde bir tekrarlayın.
    NOT: Birincil kahverengi preadipositler için% 80-90 izdihama ulaşmak 4-5 gün sürebilir. Birincil beyaz preadipositler için genellikle 2-3 gün sürer. Preadipositler% 60 izdihama ulaştığında, nakavt veya aşırı ifade deneyleri için viral parçacıklarla verimli bir şekilde enfekte olabilirler. Preadipositleri 8 saate kadar uygun bir viral yük ile enfekte edin. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için katyonik polimerlerin kullanımı, genellikle toksisite ve enfekte preadipositlerin adipojenik potansiyelinin önemli ölçüde azalmasıyla sonuç verdiği için önerilmez.
  3. Hücreleri bölmek için, %0,1 w/v jelatin steril bir çözelti kullanarak yeni hedef plakaları kaplayın (damıtılmış suda çözünür; herhangi bir ısı kullanmayın). Kuyunun/yemeğin altını kaplayacak kadar ses seviyesi kullanın. Hücreler tohuma hazır olana kadar (en az 10 dk) 37 °C'de plakaları kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Hücre kültürü plakalarının kaplanması verim veya farklılaşma potansiyelini etkilemez, ancak farklılaşan adipositlerin bakımını ve işlenmesini önemli ölçüde kolaylaştırır.
  4. Hücreler alt birleştiğinde (%85-95) ortamı aspire edin, PBS ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için 3 dakika boyunca tripsin ekleyin. İzolasyon ortamının 2,5x trypsin hacmini ekleyerek tripsin aktivitesini engelleyin. Hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak ve yeni bir tüpe aktarmak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı boru. Kuyuları 1 mL izolasyon ortamı ile yıkayın ve ilk koleksiyona ekleyin.
  5. Hücreleri 800-1200 g'da 5 dakika santrifüj × ,süpernatantı aspire edin ve izolasyon ortamının 3-5 mL'sinde hücreleri yeniden biriktirin. Hücreleri sayın ve istediğiniz son yoğunluğa seyreltin.
    NOT: Örneğin, 50.000-80.000 hücre/mL (sırasıyla 6, 12 ve 24 kuyu plakaları için 2,5, 1 ve 0,5 mL) 72-96 saat içinde tamamen birleştiği kuyulara neden olacaktır.
  6. 3.3. adımda kaplama çözeltisini epire edin ve fazla jelatinleri PBS ile yıkayın. Hücreleri tohumlayın ve plakaları tamamen bir araya gelene kadar inkübatöre geri verin.

4. Beyaz ve kahverengi preadipositlerin farklılaşması (gün 7 - 12)

  1. Preadipositler birleştiğinde, ortamı aspire edin ve DMEM'de 170 nM insülin, 1 μM deksametazon ve 0,5 mM 3-izobutil-1-metilklasin içeren% 10 FBS'den oluşan farklılaşma ortamı ile değiştirin. BAT preadipositlerini ayırt ediyorsanız, 1 nM triiyodotiron (T3) ekleyin. Adipojenik farklılaşmanın indüklenme gününü farklılaşmanın 0.
    NOT: Hem beyaz hem de kahverengi preadipositler izdihama ulaştıktan sonra kendiliğinden farklılaşabilir. Bununla birlikte, adipozit farklılığını en üst düzeye çıkarmak için, yukarıda açıklanan geleneksel pro-adipojenik kokteyl (ayrıca BAT preadipositleri için T3) kullanılmalıdır.
  2. 48 saat (farklılaşmanın 2. günü) sonra, ortamı DMEM'de% 10 FBS ve 170 nM insülinden (ayrıca BAT için 1 nM T3) oluşan bakım ortamı ile yenileyin.
    NOT: 2. günde mikroskop altındaki hücrelerde biriken küçük lipit damlacıkları standart parlak alan kullanılarak gözlemlenebilir.
  3. Deneyler için hücreler kullanılana kadar 4.2 adımlarını her 2 günde bir yineleyin.
    NOT: Farklılaşmanın 4 veya 5. gününde hücrelerin çoğunluğu lipit yüklü olarak görünecektir. Ölümcül olarak farklılaşan adipositler kültürde daha uzun süre tutulabilir veya bu aşamada deneyler için kullanılabilir.

5. Biyoenergetik deneyler için yeniden kaplama

NOT: Amaç biyoenergetik çalışmalarını 96 kuyu formatında olgun adipositlerde yapmaksa aşağıdaki adımların atılması gerekmektedir. İdeal olarak, tamamen farklılaşmış hücreler (4 veya 5. gün) kullanılmalıdır. Aşağıda açıklanan prosedür 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusundan başlar.

  1. Tripsin sindirimden önce, 96 kuyu plakaları için kaplama hazırlayın. Her kuyuya 50 μL% 0.1 jelatin ekleyin. Hücreler tohuma hazır olana kadar plakayı bir doku kültürü inkübatörde bırakın.
  2. 4 veya 5 günlük farklılaşmada, ortamı aspire edin, 1 mL PBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu için) 300 μL ekleyin. Trypsin'in kuyunun altını tamamen kapladığından emin olmak için plakayı hafifçe eğin; oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır. 700 μL bakım ortamı ile tripsin eylemini engelleyin, hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için pipet yukarı ve aşağı ve hücre süspansiyonunu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  3. Hücreleri 5 dakika boyunca 1200 × g'da santrifüj edin. Üstnatant çıkarın, peletin 1 mL bakım ortamında yeniden biriktirin ve hücreleri sayın.
    NOT: 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusu yaklaşık 1,5-1,8 milyon hücre vermelidir.
  4. Kahverengi adipositler için 60.000 ila 80.000 hücre/mL ve beyaz adipositler için 100.000 ila 120.000 hücre/mL nihai konsantrasyona sahip olacak şekilde hücreleri seyreltin. Jelatin kaplı 96 kuyu plakalarında kuyu başına hücre süspansiyonunun plakası 100 μL.
    NOT: 6 kuyulu bir plakanın bir kuyusu, iki adede kadar 96 kuyu plakası için yeterli hücre sağlar. Biyoenergetik deneyler için, oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlamak ve test sırasında kuyularda oksijen tükenmesini önlemek için düşük yoğunluklu kaplamaya (%30-40 izdiham) ihtiyaç vardır.
  5. Hücrelerin plakanın altına en az 48 saat yapışmasına izin verin. Hücreler plakada 48 saatten fazla tutulursa, 2 gün sonra ortamı yenileyin.
  6. Tahlil günü, ortamı aspire edin ve tahlil ortamı ile değiştirin. CO 2 kontrollü olmayan bir inkübatörde 37 °C'de1saat kuluçkaya yatırın ve üreticinin talimatlarına göre tahlil işlemi gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün Bölüm 1'i, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilen hücrelerin heterojen bir süspansiyonu sağlayacaktır. Sindirilmiş dokuların hücre süzgeci ile filtrelanması (bölüm 2) sindirilmemiş dokuyu uzaklaştıracaktır. Bununla birlikte, bazı hücresel döküntüler, kan hücreleri ve olgun adipozitler geçecektir (Şekil 1C). Kaplamadan sonra nazik yıkamalar 1 saat, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili olmayan hücreleri uzaklaştırır (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu sistemik insülin duyarlılığı ve glikoz homeostaz için kritiktir20. Obeziteye bağlı adiposit disfonksiyonu tip 2 diyabetin başlangıcı ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Bu nedenle, yağ dokusunun temel biyolojisinin ve fizyolojisinin daha iyi anlaşılması metabolik bozukluklar için yeni tedavilerin tasarlanmasını sağlayabilir. Yağ depolarından izole olgun adipositlerin doğrudan fonksiyonel ve transkripsiyonel analizinin tamamlayıcısı olarak21,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Madrid, İspanya'daki Centro Nacional de Biotecnología'daki Cristina Godio'ya, Scripps Araştırma Enstitüsü'nden Mari Gantner'e, La Jolla'ya ve Baltimore Johns Hopkins Üniversitesi'nden Anastasia Kralli'ye, Kahn ve ark.18'inilk çalışmalarına dayanarak bu protokolün optimize edilmesine yardımcı oldukları için minnettarlar. Bu çalışma NIH tarafından FINANSE EdİlDİ DK114785 ve DK121196 E.S.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX)Sigma-AldrichI7018
6 oyuklu plakalarCorning353046
AdipoRed (Nil Kırmızısı)LonzaPT-7009
Antimisin ASigma-AldrichA8674
BenchMark Fetal Sığır Serumuİkizler Biyoürünleri LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Hücre süzgeciFisher Scientific22363549
Kollajenaz, Tip 1   Worthington Biyokimya A.Ş. LS004196
ddH 2< / sub>OSigma-Aldrich6442
DeksametazonSigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030Biyoenerjetik çalışmaları için
DMEM, Yüksek Glikoz, GlutamaxGibco10569010
DPBS, kalsiyum yok, magnezyumyokGibco14190144
Yağ Asidi İçermeyen BSASigma-AldrichA8806
FCCPSigma-AldrichC2920
JelatinSigma-AldrichG1890
GlikozSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
İnsülinSigma-AldrichI6634
KClSigma-AldrichP9333
NaClSigma-AldrichS7653
NorepinefrinCayman Kimyasal16673
OligomisinSigma-Aldrich75351
Kalem / StrepGibco15140122
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
RotenoneSigma-Aldrich557368
Denizatı XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Biyoenerjetik çalışmaları için
Cerrahi forsepsROBOZ Cerrahi Alet CoRS-5158
Cerrahi MakasROBOZ Cerrahi Alet CoRS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
triiyodotironin (T3)Sigma-Aldrich642511

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
  3. Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
  4. Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
  5. Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
  6. Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
  7. Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
  8. Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
  9. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958(2018).
  10. Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
  11. Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  12. Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
  13. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
  14. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
  15. Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
  16. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  17. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  18. Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
  19. Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
  20. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  21. Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936(2019).
  22. Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
  23. Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
  24. Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
  25. Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
  26. Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Preadipocyte IsolationAdipocyte DifferentiationWhite Adipose TissueBrown Adipose TissueNewborn MicePrimary PreadipocytesCell CultureCollagenase DigestionLipid Droplet AccumulationMitochondrial Stress Test

İlgili makaleler