Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,²,³,^4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin^{6, 7,8}ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz^9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar¹¹. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.

Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi^16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlar^halinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar^18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir^20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri²², bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispeten^{ucuzdurlar 23,24}. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir²³, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlar^sağlar.

Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,^memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,^27,28, kuşlar²⁹ ve amfibiler³⁰. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor^31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir^33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir^31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.

Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)³⁵, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)³⁶, dogfish (Scyliorhinus canicula)³⁷ ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)^38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)^40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyük^{balıklar 40} için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.

Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir²⁵ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi⁴¹. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir⁴². Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesini^{tamamlayacaktır 43}, hipofiz bölümleri⁴⁴ ve beyin nöronları⁴⁵ve birincil hücre kültürü⁴⁶. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,^42,47'de açıklandığı gibi, dorsal ve anal yüzgecin büyüklüğü ve şekli gibi ikincil cinsel özellikleri ayırt ederek belirlendi.

1. Enstrümanlar ve çözüm hazırlama

1. Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (%0,6 Trikain).
   1. 0,6 g Tricaine (MS-222) 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) 100 mL seyreltin.
   2. Tricaine stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını birkaç 1,5 mL plastik boruya dağıtın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
2. 2 L akvaryum suyuna 18 g NaCl ekleyerek geri kazanım suyu (%0,9 NaCl çözeltisi) hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
3. Keskin bir nokta elde etmek için bir jilet çapraz kırarak kesi aletlerini hazırlayın (Şekil 1A).
4. 25 μL sodyum heparini 500 μL 1x PBS'ye seyrelterek kan pıhtı önleyici çözelti (0,05 U/μL sodyum heparin) hazırlayın. Pıhtı önleyici çözeltiyi kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
5. Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çekerek(Şekil 1B)cam kılcal damar çekerek 90 mm uzunluğundaki cam kılcal damardan iki cam iğne hazırlayın.
   NOT: Cam iğnenin dış çapı 1 mm, iç çapı ise 0,6 mm'dir.
6. Kapağı keserek 1,5 mL plastik boru kapağı hazırlayın ve iğne dış çapına uygun bir delik açın (Şekil 1C). Deliği açmak için, 9 mm'lik cam kılcal damarın bir ucunun ısıtın ve ısıtılmış cam kılcal damarı kapaktan bıçaklayın. Alternatif olarak, deliğin çapı 9 mm'lik cam kılcal damara sığana kadar kapağı saplamak için bir iğne kullanın.

2. Gonadektomi prosedürü

1. 30 mL akvaryum suyunda bir tüp Tricaine stoğunu (%0,6) seyrelterek anestezik çözeltinin% 0,02'sini hazırlayın.
2. Adım 1.3'te açıklandığı gibi bir ultra ince ve iki ince forseps (biri nispeten geniş uçlu), küçük makas, naylon iplik ve jilet dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın.
3. Balığı 30-60 saniye boyunca% 0.02 anestezik çözeltiye koyarak uyuşturun.
   NOT: Anestezi süresi balığın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlıdır ve uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, balık gövdesi kümesler kullanılarak hafifçe sıkıştırılabilir. Balık tepki vermezse, gonadektomi başlatılabilir.
4. Balıkları anestezik çözeltiden çıkar ve balığı yatay olarak yan tarafına, sudan diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.
5. Kadınlarda ovaerektomi (OVX)
   1. Varsa yumurtlama yumurtalarını (dişi vücudun dışına sarkan yumurtalar) çıkarın ve kesi alanındaki pulları kazıyın (Şekil 2A).
   2. Kaburgalar arasında, pelvik ve anal yüzgeçler arasında ( Şekil 2A ), jilet kullanarak yaklaşık2-2,5mm uzunluğunda bir kesi yapın. Daha sonra, geniş uçlu ince tokmakla yumurtalıkları azar azar çıkarırken balık karnını hafifçe çimdikleyin.
   3. İnce önlük kullanarak yumurtalıkların ucını kesin ve yumurtalıkları bir kenara yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: Mümkünse yumurtalık kesesini kırmamaya özenin. Yumurtalık kesesi kırılırsa, yumurtlanmamış yumurta bile bırakmadan gonad izlerini mümkün olduğunca tamamen çıkarın.
6. Erkeklerde orkidektomi
   1. Anüs üzerindeki kaburgalar arasında hafifçe bir kesi yapın (Şekil 2A) ve ince tokmakla kesiği yavaşça açın.
   2. İnce toksları kullanarak testisleri yavaşça alın ve testisleri yavaşça dışarı alın. Daha sonra testisleri tamamen çıkarmak için testislerin ucunun kesilmesi (Şekil 2B). Erkek orkidektomi için, kesi kısmına kadar tüm preparatlar kadınlarda benzerdir. Testisleri tutarken, bazen testislere benzeyen yağ elde edilir. Bununla birlikte, yağı geri yükledikten sonra testisleri tekrar bulmaya çalışmak mümkündür (Şekil 2B).
      NOT: Hem erkekler hem de kadınlar için, mortaliteye yol açabilecek aşırı hasarı önlemek için karındaki kesi boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bazen bağırsaklar da gonadlarla birlikte kesiden ortaya çıkabilir, bu nedenle kapanmadan önce kesi içinde düzgün bir şekilde geri döndüklerinden emin olun. Medaka karın bölgesinde yumurtalıklar ve testisler hakkında önceden bilgi sahibi olmak esastır.
7. Kesiği erkeklerde ve kadınlarda benzer şekilde dikin (Şekil 3).
   1. Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ince önlüklerle ipliği içeri almak için ultra ince önlük kullanarak derini kesiğin sağ tarafından iç vücut boşluğundan bıçaklayın (Şekil 3; 1-2).
   2. İpliği çıkarmak için kesiğin sol tarafındaki deriyi dış vücut boşluğundan bıçaklayın ( Şekil 3; 3-4).
   3. Kesi açıklığını kapatın ve iki düğüm yapın ve aşırı ipliği kesin (Şekil 3; 4-6).
      NOT: Dikiş yeterince sıkı olmalı ve balık üzerindeki kalan iplik dikişin gevşemesini önleyecek kadar uzun olmalıdır. Anesteziden dikişe kadar tüm işlem genellikle 6 dakika kadar sürer. Daha uzun süre ölüm oranına yol açabilir.
   4. Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin.
      NOT: Gonadektomi balıklar genellikle geri kazanım suyunda 1-2 saat sonra normal davranış gösterir. Bu nedenle, deney amacına bağlı olarak, bu zaman aralığından sonra balıkları örnekleyebilirsiniz.

3. Kan örnekleme prosedürü

1. Aletleri hazırlayın: bir cam iğne, silikon kılcal damar, delikli plastik bir tüp, boş bir 1,5 mL plastik tüp, bir minicentrifuge ve bant.
2. 2.1. adımda açıklandığı gibi% 0.02 anestezik çözelti kullanarak balığı uyuşturun ve balıkları dikey bir konumda diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 4A). Kaudal delinme damarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için balığı parlak bir yüzeye yerleştirin.
3. Silikon kılcal damara cam iğne takarak kan çekmecesini takın (Şekil 4B). İğnenin ucunu geniş uçlu forsepslerle kırın ve iğnenin içini emiş ve üfleyerek pıhtı önleyici çözelti ile kaplayın.
   NOT: Emme sırasında kanın doğrudan temasını önlemek için güvenlik önlemleri için enayi ve en az 50 cm uzunluğunda silikon kılcal damar kullanılması önerilir. Ek olarak, iğne ucunun açıklığının kanın çizilmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun.
4. İğneyi balığın peduncle bölgesine doğru yönlendirin, kaudal peduncle damarını hedefleyin (Şekil 5A) ve iğnenin toplam hacmi en az dörtte biri dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin (Şekil 5B).
   NOT: İğneyi balık vücudundan çıkarmadan önce emmeyi durdurmak önemlidir.
5. İğneyi bırakın ve iğnenin keskin tarafının yakınlık kısmına bir bant parçası koyun. Kapağı bir toplama tüpüne bir delik ile yerleştirin ve iğneyi tüpün içine, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten geçirin (Şekil 5C).
6. Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin.
   NOT: Aynı balıktan ikinci bir kan örneği almak için, ilk kan örneklemesi yapıldıktan bir hafta sonra kanı örneklemek.
7. Flash, tüpteki kanı toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g ile toplanan kanı 1-2 saniye boyunca aşağı çevirin.
8. Doğrudan aşağı akış uygulamalarına geçin veya kullanıma kadar kanı -20 °C'de saklayın.
   NOT: Tüm kandan seks steroid ekstraksiyonu için önceki çalışmaya bakın⁴⁸.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.