Bu protokol, ultrason kontrast ajanları tarafından indüklenen sonoporasyon yoluyla hücrelere hızlı moleküler teslimat için düşük maliyetli bir akostofluidik cihazın montajını ve çalışmasını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Moleküler Bileşiklerin Hücrelere Daha İyi Teslimi İçin Akostofluidik Bir Cihazın Montajı ve çalışması
Bu makalede
Özet
Özet
Çok çeşitli biyomedikal araştırmalar ve hücre bazlı terapötik uygulamalar için biyomoleküllerin verimli hücre içi teslimatı gereklidir. Ultrason aracılı sonoporasyon, biyomoleküllerin hızlı hücre içi doğumu için ortaya çıkan bir tekniktir. Sonoporasyon, gaz dolu mikrobubbles kavitasyon yakındaki hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturduğunda ortaya çıkar, bu da biyomoleküllerin çevredeki sıvıdan hızlı bir şekilde alınmasını sağlar. Süspansiyondaki hücrelerin in vitro sonoporasyonu için mevcut teknikler yavaş verim, her hücre için ultrason maruz kalma koşullarında değişkenlik ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, ultrason kontrast ajanları ile birlikte kanallardan akarken hücrelerin tutarlı sonoporasyonunu teşvik etmek için PDMS tabanlı akışkan bir cihaza ultrason dönüştürücüsü entegre eden düşük maliyetli bir akostofluidik cihaz geliştirilmiştir. Cihaz, PDMS tabanlı akışkan çipi üretmek için standart fotolithografi teknikleri kullanılarak üretilmiştir. Bir ultrason piezo disk dönüştürücü cihaza takılır ve bir mikrodenetleyici tarafından tahrik edilir. Montaj, daha fazla koruma için 3D baskılı bir kasaya entegre edilebilir. Hücreler ve mikrobubbles bir şırınga pompası veya PVC boruya bağlı peristaltik bir pompa kullanılarak cihazdan itilir. Biyomoleküllerin insan T hücrelerine ve akciğer kanseri hücrelerine gelişmiş teslimatı bu akostofluidik sistemle gösterilmiştir. Toplu tedavi yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, bu akostofluidik sistem verimi arttırır ve değişkenliği azaltır, bu da biyomedikal araştırma uygulamaları ve hücre bazlı terapötiklerin üretimi için hücre işleme yöntemlerini geliştirebilir.
Giriş
Hücrelere moleküler teslimatı geliştirmek için viral ve viral olmayan platformlar kullanılmıştır. Viral doğum (transdüksiyon), genomik modifikasyon gerektiren hücre bazlı tedavilerde kullanılan yaygın bir tekniktir. Viral doğumla ilgili sınırlamalar potansiyel eklemeli mutajensis, sınırlı transgenik kapasite ve istenmeyen enfeksiyon çokluğu1,2'yiiçerir. Bu nedenle, çok çeşitli biyomedikal ve araştırma uygulamaları için viral olmayan moleküler iletim teknikleri geliştirilmektedir. Yaygın teknikler arasında mekanik, elektriksel, hidrodinamik veya biyomoleküllerin hücrelere alımını artırmak için lazer tabanlı ene....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Louisville Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan protokollerin ardından sağlıklı bağışçılardan tam kan bağışı toplandı.
1. Akostofluidik cihazın imalatı
- 500 μm çapında kanallar içeren eşmerkezli spiral tasarımlı bir fotomask elde edin. Örnek olarak ek dosyalarda bir CAD dosyası sağlanır. Özel bir foto maskesi ticari bir satıcıdan sipariş edilebilir veya maske yazıcısı kullanılarak desenlenebilir.
- Standart fotolithografi tekniklerini kullanarak fotoresist kaplı silikon gofret üzerine eşmerkezli spiral tasarımın bir kalıbını hazırlayın.
- 100 mm'lik silikon gofrete yaklaşık....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
3D baskılı bir kasanın içine monte edilmiş akostofluidik sistemin bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, ultrason kontrast ajanları kullanarak birden fazla hücre hattında hücre içi moleküler teslimatı geliştirmek için kullanılabilecek bir akostofluidik sistem üretir.
Şekil 2 tedavi edilmemiş bir kontrol grubuna kıyasla akostofluidik tedavi ile birincil insan T hücrelerine floresan bileşik olan floresa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, araştırma uygulamaları için biyomoleküllerin hücre içi teslimatını geliştiren düşük maliyetli bir akostofluidik sistemin montajını ve çalışmasını açıklar. Bu sistemi kurarken ve çalıştırırken göz önünde bulundurulacak birkaç önemli faktör vardır. Akostofluidik cihaz, tutarlı kanal boyutları27ile kolayca kalıplanabilen biyouyumlu bir malzeme olan PDMS'de üretilmiştir. Cihaz kanalları, kültürlü hücrelerle çalışırken steriliteyi artırmak için akostofluidik işlemden önce 15 mL%70 etanol ç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ortak yazarlar MAM ve JAK, bu araştırmayla ilgili ürünlerden finansal olarak yararlanabilecek DesiCorp'un mülkiyetine sahiptir.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı (#1827521, #1827521, #1450370) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01HL127518) tarafından finanse edildi. Louisville Üniversitesi Mikro/Nano Teknoloji Merkezi tarafından fotolithografi hizmeti verildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akustoakışkan Cihaz İmalatı | |||
| DOW SYLGARD 184 SİLİKON ENKAPSÜLANT ŞEFFAF 0.5 KG KİT | Ellsworth Yapıştırıcılar | 4019862 (SKU)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ | |
| Harris Uni-Core (2.5 mm)Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 69039-25 | |
| 15 mL Falcon Tube için Mikroakışkan Rezervuar - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Mikroskop Slaytı | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| triklorosilan | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Klorosilan çok tehlikeli ve yanıcıdır. Maruz kalma ciddi yanıklara ve göz hasarına neden olur. |
| Tygon PVC yumuşak plastik boru (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Parça #) | |
| https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/Akustoakışkan Sistem Montajı | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barkod) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Ultrason Kontrast Maddelerinin Hazırlanması | |||
| 1,2-distearoil-sn-glisero-3-etilfosfokolin (DSEPC) | Avanti Lipidleri | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) | Avanti Lipidleri | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2- distearoil-sn-glisero-3-fosfogliserol (DSPG)Avanti | Lipidleri | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (dekaflorobutat gazı) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Birleştiriciler | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polioksietilen 40 stearat | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonikatör | Qsonica | Q125-110 (Referans) | |
| https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=rPrimarty T Hücrelerinin Hazırlanması | |||
| autoMACs çalıştıran tampon | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Sipariş No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Hücre İzolasyon Kiti, insan (Pan T-Cell Biotin Antikor Kokteyli & Pan T-Cell Mikro Boncuk Kokteyli) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Sipariş No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| manyetik hücre ayırıcı (autoMACS Pro Ayırıcı) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Sipariş No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| A549 Akciğer Kanseri Hücrelerinin Hazırlanması | |||
| Trehaloz Test Kiti | Megazyme | K-TREH (Kedi. Hayır.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Tripan mavisi (sulu çözelti içinde% 0.4 Kullanıma Hazır, steril) | VWR | 97063-702 (Kat. Hayır.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Kaynaklar
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
