Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.
Yöntem makalesi
Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Mikrobiyal büyüme oranlarındaki suş içi heterojenitenin hassas ölçümleri, stres toleransı, patojenite ve zindeliğin diğer temel bileşenlerine genetik ve çevresel girdileri anlamak için gereklidir. Bu makale, deney başına yaklaşık 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonyasını izleyen mikroskop tabanlı bir tahlil tanımlamaktadır. Mayanın çok katlı bir plakada hareketsiz olarak otomatik olarak zaman atlamalı görüntülenmesi sonrasında, mikrokolony büyüme oranları özel görüntü analiz yazılımı ile kolayca analiz edilir. Her mikrokolony için floresan proteinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ve akut stresin sağkalımları da izlenebilir. Bu tahlil, suşların ortalama büyüme oranlarının kesin olarak tahmin edilmesine ve klonal popülasyonlarda büyüme, gen ekspresyasyonu ve stres toleransında heterojenliğin kapsamlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.
Giriş
Büyüme fenotipleri maya zindeliği için kritik katkıda bulunur. Doğal seleksiyon, 108 kişiyi aşabilen etkili nüfus büyüklüğünün tersi ile farklılık gösteren büyüme oranları ile soyları verimli bir şekilde ayırt edebilir1. Ayrıca, bir popülasyondaki bireyler arasında büyüme oranlarının değişkenliği evrimsel olarak ilgili bir parametredir, çünkü bahis koruma 2 , 3,4,5,6gibi hayatta kalma stratejilerinin temelini oluşturabilir. Bu nedenle, büyüme fenotiplerinin ve dağılımlarının son derece doğru ölçümlerine izin veren tahliller mikroorganizmaların incelenmesi için çok önemlidir. Burada açıklanan mikrokolony büyüme tahlili, deney başına ~105 mikrokolon için bireysel büyüme hızı ölçümleri oluşturabilir. Bu nedenle bu test, maya evrimsel genetiği ve genomikleri incelemek için güçlü bir protokol sağlar. Genetik olarak özdeş tek hücre popülasyonları içindeki değişkenliğin nasıl üretildiğini, sürdürüldüğünü ve popülasyon kondisyonu 7 ,8,9,10'anasıl katkıda bulunduğunu test etmek için özellikle iyi bir şekilde kendini ödünç verir.
Burada açıklanan yöntem (Şekil 1), mikrokolonlara büyümeyi izlemek için 96 veya 384 kuyulu bir cam tabanlı plaka üzerinde sıvı ortamda yetişen hücrelerin periyodik olarak yakalanan, düşük büyütmeli parlak alan görüntülerini kullanır. Hücreler, mikroskop plakasının altını kaplayan ve iki boyutlu koloniler oluşturan A lektin kontanvalinine yapışır. Mikrokolonlar monolayerde büyüdüğünden, mikrokolony alanı7numaralı hücre ile oldukça ilişkilidir. Bu nedenle, her bir mikrokolony alanının değişim hızını izleyen özel görüntü analizi yazılımı ile mikrokolony büyüme hızı ve gecikme süresi hakkında doğru tahminler oluşturulabilir. Ayrıca, deneysel kurulum, bu mikrokolonlarda ifade edilen floresan etiketli proteinlerin bolluklarını ve hatta hücre altı lokalizasyonlarını izleyebilir. Bu mikrokolonyum büyüme testinden elde edilen verilerin aşağı akış işlemesi, özel analiz veya Görüntüleri Kolayca İşleme (PIE)11, sağlam koloni alanı tanıma ve gitHub12aracılığıyla kullanılabilen düşük büyütmeli, parlak alan görüntülerinden yüksek verimli büyüme analizi için bir algoritma gibi mevcut görüntü analizi yazılımı ile elde edilebilir.
Mikrokolony-büyüme testinden elde edilen büyüme hızı tahminleri çok sayıda tek koloni ölçümünden oluşturulduğundan, makul büyüklükte bir deney için tahminlerden birkaç büyüklük sırasıyla standart hatalarla son derece doğrudur. Bu nedenle, tahlillerin farklı genotipler, tedaviler veya çevresel koşullar arasındaki büyüme hızı farklarını tespit etme gücü yüksektir. Multiwell-plate formatı, çok sayıda farklı ortam ve genotip kombinasyonunun tek bir deneyde karşılaştırılmasını sağlar. Suşlar farklı floresan belirteçleri tam olarak ifade ederse, aynı kuyuda karıştırılabilir ve sonraki görüntü analizi ile ayırt edilebilir, bu da iyi veri normalleştirmesine izin vererek gücü daha da artırabilir.
Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Bu protokol, deneysel plakanın hazırlanması ve hücrelerin görüntüye hazırlanması olan iki ana adımı izler. Plakaların randomizasyonu ve hücrelerin büyümesi deney gününden önce ve bu güne kadar yapılmalıdır. Seyreltme sırasında her adımda hücrelerin tekrar tekrar karıştırılması, kaplamaya kadar olan adımlarda zorunludur ve bu nedenle deneysel plakanın ilk olarak hazırlanması önerilir, böylece hücre seyreltmenin tamamlanmasından hemen sonra kaplamaya hazırdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Randomize Plakaların Hazırlanması (Deney Gününden Önce)
- Büyüme testi ile test edilecek suşları ve koşulları planlayın. Bu noktada, herhangi bir kuyuya rastgele suşlar ve koşullar atayın.
NOT: Plaka kurulumu göz önüne alındığında, ölçümlerde iyi ilişkili gürültüyü hesaba katmak için tek bir plakada gerinim ve büyüme durumu başına birden fazla çoğaltmanın dahil edilmesi önerilir. Daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın. - Farklı günlerde çalıştırılacak plaka çoğaltmaları için her bir gerinim ve çevresel durumun konumunu hesaplamalı olarak rastgele hale koyun.
- 30 °C'de (veya başka bir uygun sıcaklıkta) bir çalkalayıcıda maya özü-pepton-dekstroz (YEPD; % 2 glikoz) ortamında doygunluk için deneyde kullanılacak tüm hücreleri yetiştirin.
- Randomize stok plakalarını manuel olarak veya sıvı taşıma robotu ile oluşturun. Steril bir U-bottom doku kültür plakasının her kuyusuna belirlenen doymuş hücrelerin 10 μL'sini ekleyin. Birden fazla suş tek bir kuyuda test edilecekse, bunları bu noktada birleştirmeyin; bu birleştirme, mikrokolony kurucu hücreler olarak kaplandığında tüm suşların doğru konsantrasyonlarda olduğundan emin olmak için deney gününde hücre seyreltmelerinden hemen önce yapılacaktır.
- Her plakanın her kuyusuna 10 μL% 30 gliserol ekleyin. Hücrelerin ve gliserollerin iyi karışması için yukarı ve aşağı boru.
- Her plakayı bir folyo kapakla kapatın ve kullanıma hazır olana kadar hemen -70 °C'de dondurun.
NOT: Tüm randomize plakaların aynı gün içinde oluşturulması ve dondurulması önemlidir, böylece her plakadaki hücrelerin büyüme öncesi koşulları aynı olacaktır ve büyüme hızı testinde teknik varyasyon oluşturmayacaktır.
2. Mayanın Ön Büyümesi
NOT: Genellikle, bu deneme gününden önce başlar ve deneysel soruya oldukça bağlıdır. Ayrıntılar için Tartışma'ya bakın.
- -70 °C dondurucudan bir stok plakasını (kuyu başına 10 μL gliserol) çıkarın ve deney için kullanılacak 180 μL ortam ekleyin. Deney besin sınırlayıcı ortam kullanılarak yapılacaksa, mayanın sporülasyonu meydana gelebileceğinden, mayayı besin sınırlayıcı ortamda doygunluğa önceden yetiştirmeyin. Bunun yerine, sınırlayıcı olmayan medyada önceden büyüyün.
- 30 °C'de titrerken maya yetiştirin. Denemeden önce hücrelerin birden çok kez seyreltilmesinin gerekli olup olmayacağını belirlemek için tahlilin günlük aşamasındaki hücrelerle mi yoksa sabit fazda mı çalıştırılacağını düşünün. Testteki maya suşlarının veya koşullarının önemli ölçüde farklı büyüme oranlarına sahip olması bekleniyorsa, tüm farklı koşulların sabit faza ulaşması için iki günlük bir büyüme öncesi dönem gerekecektir.
3. Mikroskop Kurulumu
- Mikroskop plaka hazırlama
- Mikroskop inkübatörünün açık olduğundan ve mikroskop odasını deneysel koşullar için istenen büyüme sıcaklığına ısıttığından emin olun. Saccharomyces cerevisiae hücrelerini kullanan standart deneyler için inkübatör, büyüme hızı tahlil sırasında hücrelerin büyüme koşullarının doğru olmasını sağlamak için mikroskop odasını 30 °C'ye ısıtmalıdır.
- Tezgahı, pipetleri ve diğer aletleri% 70 etanol ile sterilize edin. Bir mikroskop plakası alın ve tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendilin üstündeki tezgaha yerleştirin.
NOT: Eldivenler açık olsa bile mikroskop plakasının altına asla dokunmayın ve mikroskop plakasını herhangi bir yüzeye dokunduğunda her zaman tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendilin üzerine yerleştirin. Bu, deney görüntülendikten sonra lekelerin veya çiziklerin büyüme hızı ölçümlerini engellemesini önler. - 5 mL 5x concanavalin A çözeltisini çözün, su ile 1 kata seyreltin ve filtre 0,2-μm filtre ile donatılmış bir şırınna ile sterilize edin.
- Filtre, çözeltilerde gerçekleşmiş olabilecek kristalleri veya kalıntıları gidermek için testte kullanılacak diğer tüm sıvıları deneysel ortam da dahil olmak üzere 0,2 μm filtre ile sterilize eder. Kristallerin varlığı mikroskopi görüntülerinin kalitesini düşürecektir.
- Pipet 200 μL concanavalin Mikroskop plakasının her kuyusuna bir çözelti.
- Concanavalin A çözeltisinin her kuyunun altını eşit şekilde kapladığından ve hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için plakanın altında tiftiksiz ve statik içermeyen bir silme ile plakayı 411 x yerçekiminde (g) 2 dakika santrifüj edin.
- Plakayı kapağıyla örtün ve 1-2 saat bekletin. Plakanın tam oturma süresi esnektir, ancak deneyin farklı çalıştırmaları arasında tutarlı olmak önemlidir.
- Tüm concanavalin A çözeltisini emişle veya lavaboya veya bir kap içine zorla boşaltarak plakadan çıkarın. Plakanın cam kısmına dokunmamaya dikkat edin. Bazı concanavalin A çözeltisi damlalarının kuyularda kalması kabul edilebilir.
- Mikroskop plaka kuyularını 400 μL steril su ekleyerek yıkayın. Önceki adımda concanavalin A ile yapılan suyu çıkarın. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin.
- Plakaya hemen 185 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin. Bu plakaya 15 μL doğru seyreltilmiş hücre eklenecektir.
- Maya Hücre Seyreltme
NOT: Aşağıdaki adımlarda, 250.000 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için doymuş bir kültürden (yaklaşık 108 hücre/mL) 400 kat maya seyreltilmesi açıklanmaktadır, bunun 15 μL'si cam-alt plakada 400 μL'ye seyreltilecek ve 96 kuyulu bir plakada kuyu başına yaklaşık 4000 hücrenin son sayısı verilecektir. 384 kuyu plakası kullanıyorsanız kuyu başına son hücre sayısı yaklaşık 700 olmalı ve seyreltmeler buna göre ayarlanmalıdır. Bu oran, günlük aşamasında toplanan, daha zengin veya daha zayıf büyüme öncesi ortamda büyüyen veya farklı suşlardan toplanan hücreler için ayarlanmalıdır. Büyüme hızı 10 saatten uzun süreler için test edildiğinde kuyu başına hücrelerin son yoğunluğu azaltılmalıdır.- Seri seyreltmeler için iki adet 96 kuyu kültür plakası kurun: plaka 1 ve 2 olarak etiketleyin ve her seri seyreltme plakasına 90 μL deneysel büyüme ortamı (yani mayanın mikroskopta büyüyeceği ortam) ekleyin.
NOT: Hangi son seyreltmenin kullanıldığına bakılmaksızın, her birinde küçük bir maya hacminin daha büyük bir deneysel ortam hacmine pipetle karıştırıldığı ve daha sonra büyük miktarda deneysel ortamın bir pipetle kuvvetli bir şekilde karıştırıldığı en az iki seri hücre seyreltilmesi önerilir (aşağıdaki adım 3.2.5 ve 3.2.6'da olduğu gibi). - Hücre plakasını büyüme öncesi elde edin ve plakayı 411 x g'da 2 dakika santrifüj edin.
NOT: Plakadaki farklı kuyuları çapraz kirletmemek çok önemlidir. Folyo kaplamayı plakalardan çıkarmadan önce bu santrifüjleme adımının amacı, bir kuyudan maya dolu damlacıkların folyodan uçmamasını ve diğer kuyularda sona ermesini sağlamaktır. Santrifüjlemeden sonra folyo kaplama ile temas eden mayayı önlemek için plakaları asla eğmemeye veya karıştırmamaya dikkat edin. - Folyoyu dikkatlice soyun ve pipet karıştırmak için kuyunun etrafında hareket ettirirken, bir pipetle hücreleri plakadaki toplam hacmin yaklaşık yarısına ayarlanmış bir pipetle kuvvetlice pipetle geri koyun. Tüm hücrelerin kuyuların dibinden yeniden biriktirildiğini kontrol edin.
- Bireysel kuyularda birden fazla suş kullanılacaksa, suşlar şu anda deney için gerekli oranda karıştırılmalıdır. Büyüme hızı ölçümleri oluşturmak için bir referans suşu kullanılacaksa, referansın test suşuna oranı 1:1 olmalıdır.
- Pipet 10 μL maya büyüme medyasından seyreltme plakası 1'e. Kuyu başına 200 μL'lik son hacme her kuyuya 100 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin. Kuvvetlice yukarı ve aşağı boru.
- Pipet 10 μL maya plaka 1'den plaka 2'ye. Her kuyuya 100 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin ve karıştırmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı borulayın.
NOT: Bu seyreltme adımları, büyüme öncesi aşamanın sonunda birbirine yapışan maya kümelerinin ayrılmasına yardımcı olmak ve her kuyuda yaklaşık eşit sayıda maya hücresinin sona ermesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Her kuyuda tutarlı sayıda maya olması, büyüme hızı ölçümlerinde deneysel gürültü ve önyargıların giderilmesine yardımcı olur (bkz. Temsili Sonuçlar).
- Seri seyreltmeler için iki adet 96 kuyu kültür plakası kurun: plaka 1 ve 2 olarak etiketleyin ve her seri seyreltme plakasına 90 μL deneysel büyüme ortamı (yani mayanın mikroskopta büyüyeceği ortam) ekleyin.
- Sonication
NOT: Sonication isteğe bağlıdırve sadece birbirine yapışma eğilimi yüksek olan maya suşları için yapılması gerekir (örneğin, bazı vahşi suşlar). Laboratuvar suşları için sonication genellikle gerekli değildir ve adım 3.4'e geçilerek atlanabilir.- %70 etanol ile dolu 96 kuyulu bir tabağa yerleştirerek % 70 etanol ile 96 pimli bir sonicator kafasını sterilize edin ve tiftik ve statik içermeyen bir mendille kurulayın.
- Floküle maya hücrelerini parçalamak için yeterince güçlü olan, ancak hücreleri öldürmeyen veya yüksek stres tepkilerine neden olmayan bir sonication programı ayarlayın. Belirli bir deney için en iyi sonication programını tanımlamak için bazı testler gerekebilir. Bu deneyde kullanılan sonication programı şudur: genlik = 10, işlem süresi = 10 s, pulse-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Bu tam program muhtemelen tüm sonicators için geçerli değildir, bu nedenle deney gününden önce test önerilir.
- Mayayı seri seyreltme plakasında 2 kez daha beş kez kuvvetlice yukarı ve aşağı borulayarak karıştırın.
- Seyreltme plakası 2'yi platforma yerleştirin ve hücre süspansiyonundaki sonicator pimleriyle sabitleyin, ancak plakanın altına dokunmayın. Uygun kulak korumasını kullanarak sonication programını çalıştırın.
- Program çalıştırdıktan sonra, sonicator kafasını% 70 etanol ve ardından su ile temizleyin ve ardından hücrelerin tekrar flocculate olmaması için hemen mikroskop plaka hazırlığına geçin.
- Plakayı Mikroskop için Hazırlayın:
- Pipet 15 μL maya seri seyreltme plakası 2 mikroskop plakasından 200 μL hacme kadar.
- Plakayı nefes alabilen bir zarla örtün. Plakayı bu zarla, örneğin bir lastik silindir kullanarak iyice kapatmak önemlidir.
- Maya hücrelerini cam yüzeyindeki concanavalin A'ya yapıştırmak için, plakayı 411 x g'da2 dakika boyunca altında tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendille santrifüj edin.
- Mikroskopta, plakanın üst ve alt kısmını tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendille silin ve döküntülerden kurtulmak için sıkıştırılmış havayı tabağa üfleyin.
- Plakayı mikroskopa yerleştirin, düz olduğundan ve A1 kuyusunun sol üst köşede olduğundan emin olun.
4. Zaman Atlamalı Mikroskopi Büyüme Hızı Ölçümleri
NOT: Hızlandırılmış mikroskopi sırasında aşağıdaki özellikler bilgisayar kontrollü olarak kontrol edilir: x, y ve z konumu, panjurlar ve floresan filtreleri. Donanım tabanlı otomatik odaklama sistemi, hızlandırılmış görüntüleme sırasında odak düzlemlerinin sürüklenmesini önlemek için en uygun sistemdir. Alternatif olarak, yazılım tabanlı otomatik odaklama döngüsü kullanılabilir. Mikroskop odasındaki nemi korumak için, deney süresi boyunca odada arıtılmış su ile bir beher tutulması önerilir.
- Her mikroskop plakası kuyusunun tam olarak görüntülenebilmesi için görüntüye bir konum listesi (x,y) oluşturun. Hiçbir hücrenin birden çok kez analiz olmaması için çakışan görüntülerden kaçının.
- 15x büyütmede diyoskopik aydınlatma (DIA) ile brightfield görüntü. Pozlamayı ~5 ms olarak ayarlayın.
- Hücrelerin açıkça görülebilmesi için görüntüyü dijital olarak yakınlaştırın. Plakanın köşesindeki dört kuyuda ve plakanın ortasındaki bir kuyuda deney için ideal odağı tanımlamak için odak düğmelerini kullanın. Hücrelerin maksimum kontrastını alacak şekilde odaklanın.
- Deneme için z konumunu (veya otomatik odaklama konumunu) bu kuyuların her biri için tanımlanan z/otomatik odaklama konumlarının ortalaması olacak şekilde ayarlayın. Mikroskop plakası iyi yapılmışsa ve cam tabanın kusurları yoksa, ideal odak pozisyonları her kuyu için benzer olmalıdır.
NOT: Görüntüleri kolayca işleme (PIE) görüntü analizi ardışık düzeni11,12ile analizederken,hücrelerin mikroskop üzerinde biraz odaklanmaması yararlıdır, böylece hücrenin dışında koyu bir kenar ve doğru koloni tanıma ve boyut tahminlerine yardımcı olan açık renkli bir iç mekan vardır. - Floresan suşları kullanıyorsanız, hiçbir pikselin aşırı pozlanmamasını sağlamak için görüntülerin kanallarını ve pozlamalarını tanımlayın. Floresan kanallar için pozlama süresini ayarlarken, hücreleri uzun süre floresan heyecana maruz bırakmamak için mikroskopta "canlı yakalama" modunu kapatın, çünkü bu hem hücreleri fotobleach edebilir hem de strese neden olabilir.
- İstenilen süre boyunca istenen zaman aralığında görüntü yakalamak için zaman sırası alımını ayarlayın.
- Deneyi çalıştırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün yeniliği, büyüme hızının bir popülasyondaki bireysel hücreler için zaman atlamalı görüntüleme yoluyla mikrokolonlara büyümelerini izleyerek hesaplanabilmesidir (Şekil 2A). Mikro sömürgeler concanavalin A varlığı nedeniyle düzlemsel bir şekilde saatlerce büyüdüğünden, alanları deney boyunca izlenebilir ve zaman içinde alanın doğal günlüğündeki değişime doğrusal bir uyum, 7,9, 10,13gözlenen her bir k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan protokol, hücre büyümesi ve gen ekspresyonunun aynı anda bireysel mikrokolonlar düzeyinde izlenmesini sağlayan çok yönlü bir testtir. Bu iki modaliteyi birleştirmek benzersiz biyolojik içgörüler sağlar. Örneğin, önceki çalışmalar bu tahlili, aynı anda7,10'unher ikisini de ölçerek Izojenik wildtype hücrelerinde TSL1 geninin ekspresyonu ile mikrokolony büyüme hızı arasında negatif bir korelasyon göstermek için kullanmıştır. Açıklanan tahli...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Naomi Ziv, Sasha Levy ve Shuang Li'ye bu protokolün geliştirilmesine katkılarından dolayı, David Gresham'a paylaşılan ekipmanlar için ve Marissa Knoll'a video prodüksiyon konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35GM118170 tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Genel Malzemeler< / güçlü > | |||
| 500 mL Şişe Üstü Filtre .22 ve mikro; m PES Sterilizasyon, Düşük Proteinli Bağlama, 45 mm | Boyunlu Fisher | CLS431154 | ortamı filtrelemek için kullanılır |
| BD Falcon*Doku Kültürü Plakaları, mikrotest u-dipli | Fisher | 08-772-54 | Hücreleri dondurmak, hücreleri önceden büyütmek ve seyreltmek için kullanılan 96 oyuklu kültür tüpleri |
| İğnesiz BD Şırıngaları, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Concanavalin A Costar'ı filtrelemek için kullanılır |
| Steril Tek Kullanımlık Reaktif Rezervuarları | Fisher | 07-200-127 | çok kanallı pipet ile çözeltileri pipetlemek için kullanılan reaktif rezervuarları |
| Costar Thermowell Alüminyum Sızdırmazlık Bandı | Fisher | 07-200-684 | 96 kuyulu plaka |
| contası Kimwipes | Fisher | 06-666A | mikroskop plakasının tabanını kalıntı ve çiziklerden uzak tutmak için tüy bırakmayan ve statik içermeyen mendiller |
| Nalgene Şırınga Filtreleri | ThermoFisher Bilimsel | 199-2020 | 0.2 μ m gözenek boyutu, 25 mm çap; concanavalin A çözeltisini filtrelemek için kullanılır |
| Ortam Bileşenleri | |||
| Minimal kimyasal olarak tanımlanmış ortam (MD;% 2 glikoz) | mikroskopi sırasında maya öncesi büyümesi ve büyümesi için kullanılan alternatif mikroskopi ortamı | ||
| Sentetik Komple Ortam (SC;% 2 glikoz) | mikroskopi ortamı Mikroskopi | ||
| sırasında maya öncesi büyümesi ve büyümesi için kullanılırMaya özütü-pepton-dekstroz (YEPD;% 2 glikoz) dondurmadan önce orta | hücre büyümesi randomize plakalar | ||
| < güçlü > Mikroskopi Malzemeleri < / güçlü > | |||
| Nefes alabilen membran | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | nefes alabilen membranlar mikroskopi deneyi sırasında plakayı kapatmak için kullanılır. Bu aşamada, kuyucuklarda yoğuşmayı önledikleri ve daha iyi mikroskopi görüntülerine izin verdikleri için nefes alabilen membranlar önerilir |
| Brooks 96 kuyulu düz şeffaf cam tabanlı mikroskop plakası | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | mikroskop plakası |
| Canavalia ensiformis'ten (Jack Bean) Concanavalin A, liyofilize toz | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | 5x concanavalin A çözeltisi yapın ve 5 ml 5x concanavalin A'yı 50 mL konik tüplerde -80 ° C'de dondurun; C |
| Kullanılan Suşlar | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | |||
| , atalardan kalma Hall ve Joseph 2010 mutasyon birikim suşunun soyu, YFR054cΔ::Scw11P ile dönüştürüldü: :GFP | |||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000, 96 pinli ek | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E, Mükemmel Odak Sistemli | Otomatik tabla ve otofokus sistemi ile ters |
Kaynaklar
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325(2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972(2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744(2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste