Yöntem makalesi

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

DOI:

10.3791/62041

⸱

16 Haziran 2021

 ,  ,  , 
1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA'ların (mRNA'lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA'ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3' çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce s....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanları içeren deneysel prosedürler, San Francisco'daki Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (an182026 protokolü) tarafından onaylandı.

1. Medyanın hazırlanması

  1. Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH'ı 7,4 olarak ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg/mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 μM cilostamid ekleyin.

2. Ypet-3' UTR ve mCherry için mRNA kodlamasının hazırlanması

  1. İlgi çekici mRNA'ların....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded prophase I-arrested oositlerine, IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış Ypet muhabirini kodlayan mRNA ve mRNA kodlama mCherry içeren bir muhabir karışımı enjekte edildi. YFP ve mCherry ifadesi 39 oositte kaydedildi, bunlardan 30'u olgunlaştı ve 9'u prophase I'de negatif kontrol olarak tutuklandı. Üç olgunlaşan oosit, gecikmiş bir GVBD'ye (N=2) sahip oldukları veya kayıt sırasında çanağa taşındıkları için analiz için hariç tutuldu (N=1). Şekil 3'te profaz I ve ol.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA'nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7'nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel aktivasyonun iyi görselleştirilmesin.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti'ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı'ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ortamın hazırlanması< / güçlü>
Sığır Serumu Albümin Tozu BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
SilostamidEMD Millipore231085
MEM alfaGibco12561-056
Minimum Esansiyel Orta Kartal Sigma-AldrichM2645
Penisilin-Streptomisin 100x Solüsyonu, Steril FiltreliGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodyum Bikarbonat JT-Baker3506-1
Sodyum PiruvatGibco 11360-070
Ultra saf damıtılmış suInvitrogen10977-015
YFP/3' UTR ve mCherry kodlayan mRNA'nın hazırlanması
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Karbenisilin disodyum tuzuSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Klonlama KitiMcLabCCK-20
CutSmart Tamponu (10x)New England BiolabsB7204
DNA yükleme boyası (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP ÇözeltisiNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA merdiveniThermo FisherSM1333
LB Agar Plakaları 100 & g/mL Karbenisilin, Teknova TeknovaL1010
LB Orta (Kapsüller)MP Biyomedikal3002-021
MEGAclear Transkripsiyon Temizleme KitiYaşam TeknolojileriAM1908
MfeI-HF kısıtlama enzimiNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transkripsiyon KitiInvitrogenAM1344
Phusion Yüksek Sadakatli DNA polimerazNew England BiolabsM0530
Poli(A) Atık kitiInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kiti Qiagen27106
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704
S.O.C. ortaThermo Fisher15544034
TAE tamponu Apex Biyomedikal 20-193
Ultra Saf Etidyum Bromür ÇözeltisiYaşam Teknolojileri15585011
Oosit toplama
Kalibre edilmiş mikro pipetler için aspiratör tüpü tertibatıSigma-AldrichA5177-5EA
Kalibre edilmiş mikro pipetlerDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide İğne 26 G x 1/2BD305111
Şırınga 1 mlBD309659
Oosit mikro enjeksiyon
35 mm Çanak | No. 0 Lamel | 20 mm Cam Çapı | KaplamasızMatTekP35G-0-20-CHızlandırılmış mikroskopi için
Filamentli borosilikat camSutter InstrumentBF100-78-10
Embriyo Kültürü için YağIrvine Scientific9305
Mikroenjeksiyon içinPetri KabıFalcon351006
Doku Kültürü ÇanakFalcon353001 Oosit inkübasyonu için
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderŞekil 1S
MetaMorph Hazırlanması, sürüm 7.8.13.0 Moleküler Cihazlar  Hızlandırılmış mikroskopi için, 3' UTR çevirisinin analizi 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigati....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maternal mRNA TranslationOocyte MaturationSingle Oocyte AssayIn Vitro MaturationReporter AccumulationTime Lapse MicroscopyOocyte InjectionCumulus Oocyte ComplexTranslation RegulationYFP mCherry Ratio

İlgili makaleler