Method Article

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

DOI:

10.3791/62045

⸱

March 26th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM), doku mikroatominin eşi görülmemiş üç boyutlu görünümünü sunan yüzlerce ila binlerce seri kayıtlı ultrayapısal görüntünün toplanmasına izin verir. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar. Bununla birlikte, uygun doku hazırlığı olmadan hücresel ultrayapı, yanlış veya yanıltıcı sonuçlar çıkarılacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, görüntüler reçine gömülü biyolojik örneğin blok yüzünün taranarak oluşturulur ve bu genellikle ele alınması gereken zorluklar ve hususlar sunar. "Doku şarjı" olarak bilinen görüntüleme sırasında blok içinde elektronların birikmesi, kontrast kaybına ve hücresel yapıyı takdir edememesine neden olabilir. Ayrıca, elektron ışını yoğunluğunu / voltajını artırmak veya ışın tarama hızını azaltmak görüntü çözünürlüğünü artırabilirken, bu aynı zamanda reçine bloğuna zarar vermenin ve görüntüleme serisindeki sonraki görüntüleri bozmanın talihsiz yan etkisine sahip olabilir. Burada hücresel ultrayapıyı koruyan ve doku şarjını azaltan biyolojik doku örneklerinin hazırlanması için rutin bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, doku bloğunda en az hasarla yüksek kaliteli seri görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için görüntüleme hususları sağlıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) ilk olarak 1981 yılında Leighton tarafından reçineye gömülü dokunun ince bölümlerini kesebilen ve görüntüleyebilen dahili bir mikrotom ile artırılmış bir tarama elektron mikroskobu yaptığı açıklandı. Ne yazık ki, teknik sınırlamalar, biyolojik doku gibi iletken olmayan numuneler kabul edilemez şarj seviyeleri biriktirdiği için iletken numunelerle kullanımını kısıtladı (doku örneğinde elektron birikmesi)1. Buharlaştırılmış karbon azaltılmış doku şarjı ile kesimler arasındaki blok yüzünü kaplarken, bu büyük ölçüde artan görüntüleme alma süresi ve görüntü depolama, o zamanlar bilgisayar teknolojisi cihaz tarafından oluşturulan büyük dosya boyutlarını yönetmek için yetersiz olduğu için bir sorun olmaya devam etti. Bu metodoloji Denk ve Horstmann tarafından 2004 yılında değişken basınç odası2ile donatılmış bir SBF-SEM kullanılarak yeniden ele alındı. Bu, numune içindeki şarjı azaltan görüntüleme odasına su buharının girmesine izin verdi ve iletken olmayan örneklerin görüntülenmesini görüntü çözünürlüğü kaybına rağmen uygulanabilir hale getirdi. Doku hazırlama ve görüntüleme yöntemlerinde daha fazla iyileştirme artık yüksek vakum kullanılarak görüntülemeye izin verir ve SBF-SEM görüntüleme artık şarj 3 , 4,5,6,7,8,9'udağıtmak için su buharı güvenmez. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir.

SBF-SEM, 3-5 nm10,11gibi küçük düzlemsel çözünürlüğe sahip binlerce seri kayıtlı elektron mikroskopi görüntülerinin otomatik olarak toplanmasına izin verir. Ağır metallerle emprenye edilen ve reçineye gömülü doku, elmas bıçakla donatılmış bir ultramikrotom içeren bir tarama elektron mikroskobuna (SEM) yerleştirilir. Elmas bıçakla düz bir yüzey kesilir, bıçak geri çekilir ve bloğun yüzeyi, doku ultrayapısının bir görüntüsünü oluşturmak için elektron ışını ile raster desende taranır. Blok daha sonra z ekseninde "z-adım" olarak bilinen belirli bir miktar (örneğin, 100 nm) yükseltilir ve işlem tekrarlanmadan önce yeni bir yüzey kesilir. Bu şekilde doku kesildikçe 3 boyutlu (3D) bir görüntü bloğu üretilir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından daha fazla yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar.

SBF-SEM görüntüleme öncelikle blok yüzün görüntüsünü oluşturmak için geri saçılmış elektronlar kullanırken, görüntüleme işlemi sırasında ikincil elektronlar üretilir12. İkincil elektronlar, bloktan kaçmayan geri saçılmış ve birincil ışınlı elektronların yanı sıra birikebilir ve blok yüzünde lokalize bir elektrostatik alana yol açabilecek "doku şarjı" üretebilir. Bu elektron birikimi görüntüyü bozabilir veya elektronların bloktan atılmasına neden olabilir ve geri teli dedektörü tarafından toplanan sinyale katkıda bulunarak sinyal-gürültü oranını13azaltır. Doku şarj seviyesi elektron ışını voltajı veya yoğunluğu azaltılarak veya ışın durma süresini azaltarak azaltılabilirken, bu sinyal-gürültü oranının azalmasına neden olur14. Daha düşük voltajlı veya yoğunlukta bir elektron ışını kullanıldığında veya kirişin her piksel alanında daha kısa bir süre kalmasına izin verildiğinde, dokudan daha az geri saçılmış elektron atilir ve elektron dedektörü tarafından yakalanır ve daha zayıf bir sinyalle sonuçlanır. Denk ve Horstmann, bu sorunu odaya su buharı sokarak ele aldı, böylece görüntü çözünürlüğü pahasına odadaki ve blok yüzündeki yükü azalttı. 10-100 Pa oda basıncı ile, elektron ışınının bir kısmı görüntü gürültüsüne ve çözünürlük kaybına katkıda bulunan dağınıktır, ancak bu aynı zamanda numune bloğu2içindeki yükü nötralize eden numune odasında iyonlar üretir. Numune bloğu içindeki yükü nötralize etmek için daha yeni yöntemler, görüntüleme sırasında blok yüzü üzerinde azot odak gazı enjeksiyonu veya prob-ışınlı kepçe enerjisini azaltmak ve toplanan sinyali artırmak için SBF-SEM aşamasına negatif voltaj getirmek içinkullanır 6,7,15. Blok yüzeyinde yük birikmesini azaltmak için sahne önyargısı, oda basıncı veya lokalize azot enjeksiyonu getirmek yerine, daha agresif görüntüleme ayarlarına izin vererek reçine karışımına karbon sokarak reçinenin iletkenliğini artırmak da mümkündür16. Aşağıdaki genel protokol, 2010 yılında yayınlanan Deerinck ve ark. protokolünün bir uyarlamasıdır ve yüksek çözünürlüklü görüntü alımını korurken doku şarjını en aza indirmek için yararlı bulduğumuz doku hazırlama ve görüntüleme metodolojilerinde yapılan değişiklikleri kapsar3,17,18,19. Daha önce bahsedilen protokol doku işleme ve ağır metal emprenyesine odaklanırken, bu protokol SBF-SEM çalışmalarının doğasında bulunan görüntüleme, veri analizi ve rekonstrüksiyon iş akışı hakkında fikir vermektedir. Laboratuvarımızda bu protokol kornea ve ön segment yapıları da dahil olmak üzere çok çeşitli dokulara başarıyla ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanmıştır, göz kapağı, lakrimal ve sert bezi, retina ve optik sinir, kalp, akciğer ve hava yolu, böbrek, karaciğer, cremaster kası ve serebral korteks / medulla ve fare, sıçan, tavşan, kobay, balık, monolayer ve tabakalı hücre kültürleri, domuz, insan olmayan primat ve insan20 , 21,22,23dahil olmak üzere çeşitli türlerde. Küçük değişiklikler belirli dokular ve uygulamalar için değerli olsa da, bu genel protokol temel görüntüleme tesisimiz bağlamında son derece tekrarlanabilir ve yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvanlar, Görme ve Oftalmik Araştırmalarda Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Houston Üniversitesi Optometri Üniversitesi hayvan işleme yönergelerinde açıklanan yönergelere göre ele alındı. Tüm hayvan prosedürleri ele alındıkları kurumlar tarafından onaylandı: Fare, sıçan, tavşan, kobay ve insan dışı primat prosedürleri Houston Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, zebra balığı prosedürleri DePauw Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve domuz prosedürleri Baylor College of Medicine Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm insan dokusu, insan dokusu ile ilgili araştırmalara ilişkin Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak ele alınmış ve uygun kurumsal inceleme kurulu onayı alınmıştır.

1. Doku İşleme

  1. Sodyum kakodylat tozunu ddH 2 O'da karıştırarak0,4M sodyum kakadodylat tampon stok çözeltisi hazırlayın. Bu tampon, fiksatif (aşağıda adım 1.3'te açıklanan kompozisyon), yıkama tamponunun yanı sıra osmiyum ve potasyum ferrosiyanür çözeltileri yapmak için kullanılır.
    NOT: Perfüzyon fiksasyonu genellikle SBF-SEM çalışmaları için en iyi fiksasyon yöntemidir, çünkü fiksasyon hızla ve tüm vücutta gerçekleşir. Çalışma tasarımınızda perfüzyon fiksasyonu mümkün değilse, 1.3.
  2. Hayvan modeli24, 25,26için uygun fizyolojik basınçla perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin. Bu, heparinize salin ile transkardiyal sıralı perfüzyon ve ardından her biri organizmanın üzerinde belirli bir yüksekliğe (örneğin, hayvan modelinde vasküler sistemin fizyolojik basıncına uygun) yerleştirilen, sol ventrikül içine fiksatif akan ve sağ kulakçıkta yapılan bir kesiden çıkan fiksatif ile yapılır. Kan fiksatif ile değiştirildiği için ilgi çekici doku soluklaşır, eğer dokunuzun tamamı veya bir kısmı döknmezse, doku uygun şekilde sabitlenmeyebilir ve ultrayapı korunmayabilir.
  3. Doku örneklerini 2 mm x 2 mm x 2 mm'den büyük olmayan bloklar halinde kırpmak için jilet veya keskin neşter kullanın. 1.2. adım atlandıysa, bunu hızlı bir şekilde yapın, böylece doku mümkün olduğunca çabuk sabitlenebilir.
    1. Alternatif olarak, dokuyu fiksatif altında parçalara parçalar ve daldırma işlemini tamamlamak için taze fiksatife aktarın. Fiksatifin son bileşimi% 2.5 glutaraldehit ve 2 mM kalsiyum klorür içeren 0.1 M sodyum kakadül tampondan oluşur. Fiksasyonun oda sıcaklığında en az 2 saat ve 4 °C'de en fazla bir gecede devam etmesine izin verin. Mümkünse, sabitleme yaparken numuneleri hafifçe çalkalamak için bir rocker/tilt plakası kullanın.
    2. Alternatif olarak, bir invertör mikrodalga varsa, 1 dakika açık, 1 dakikalık kapalı 4 döngü için 150 watt'ta vakum altında yukarıda belirtilen fiksatifte dokuyu sabitlayın. Mikrodalga fiksasyonu, dokuyu hızla sabitlemiş ve doku ultrayapısını koruduğuiçin 1.3.
      NOT: Bu protokol sırasında dokunun kurumasına asla izin verilmemeli, dokuyu bir çözeltiden diğerine hızlı bir şekilde aktarmaya özen verilmelidir.
  4. Sabit dokuyu 2 mM kalsiyum klorür içeren 0,1 M sodyum kakadot tamponunda oda sıcaklığında her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  5. Aşağıdaki osmiyum ferrosiyanür çözeltisini, tercihen önceki yıkama adımları sırasında taze hale getirin. %4 osmiyum tetroksit çözeltisi (ddH 2 O'da hazırlanmıştır)0,2M kakadodylat tamponda% 3 potasyum ferrosiyanid eşit hacimde 4 mM kalsiyum klorür ile birleştirin. Önceki yıkama adımından sonra, dokuyu bu çözeltiye karanlıkta buzda ve duman kaputunda 1 saat yerleştirin.
    NOT: Osmiyum tetroksit, ampulde gelen sarı kristal bir maddedir. Osmiyum tetroksit çözeltisini oluşturmak için ampulü açın, ddH2O ekleyin ve kristaller tamamen çözünene kadar karanlıkta 3-4 saat sonicate edin. Osmiyum tetroksit çözeltisi açık sarı bir çözeltidir, çözelti siyahsa osmiyum azaltılmıştır ve artık kullanılmamalıdır.
  6. Doku osmiyum ferrosiyanit çözeltisinde inkübasyon yaparken, tiyokarbohidrazid (TCH) çözeltisini hazırlamaya başlayın. Bu çözeltiyi taze hazırlayın ve 1 saatlik osmiyum ferrosiyanür fiksasyon süresinin sonunda kolayca kullanılabilir hale verin. 0,1 g tiyokarbohidrazid ile 10 mL ddH2O'yu birleştirin ve bu çözeltiyi 1 saat boyunca 60 °C fırına yerleştirin. Çözeltinin çözüldüğüne emin olmak için her 10 dakikada bir hafifçe döndürün. Kullanmadan önce, bu çözeltiyi 0,22 μm şırındi filtresinden filtreleyin.
  7. TCH'de inkübasyon yapmadan önce, dokuyu oda sıcaklığında ddH2O 5x ile her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) yıkayın.
  8. Dokuyu filtrelenmiş TCH çözeltisine oda sıcaklığında toplam 20 dakika yerleştirin (Şekil 1A-C).
  9. TCH'de inkübasyonu takiben, dokuyu oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  10. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %2 osmiyum tetroksit (potasyum ferrosiyanür ile azaltılmış osmiyum değil) içeren ddH2O'ya doku yerleştirin. Bu duman kaputunda ve karanlıkta yapılmalıdır, çünkü osmiyum ışıkla azaltılabilir (örneğin, alüminyum folyo altında) (Şekil 1D-F).
  11. Osmiyum tetroksit inkübasyonunu takiben, oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x dokunun.
  12. Dokuyu 4 °C'de bir buzdolabında gece boyunca%1sulu uranil asetat (ddH 2 O'ya karıştırılan uranil asetat tozu) içine yerleştirin.
  13. Buzdolabından doku çıkarmadan hemen önce, taze Walton'un kurşun aspartat çözeltisini hazırlayın. 0.03 M aspartik asit çözeltisinin 10 mL'sinde 0.066 g kurşun nitrat eriterek başlayın (damıtılmış suyun 10 mL'sinde 0.04 g aspartik asit) ve pH'ı 1 N KOH (10 mL damıtılmış suda 0.5611 g) ile 5.5'e ayarlayın.
    DİkKAT: pH'ı ayarlarken bir çökelti oluşabilir. Bu kabul edilebilir bir şey değil.
    1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, pH'ı izlerken yavaşça 1 N KOH damla yönünde ekleyin. Bitmiş şeffaf kurşun aspartat çözeltisini 60 °C fırında 30 dakika önceden ısıtın. Bir çökeltme oluşursa çözelti kullanılamaz ve başka bir çözüm hazırlanmalıdır.
  14. Dokuyu buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  15. Yıkadıktan sonra, sıcaklığı 60 ° C'de tutarken, dokuyu ısıtılmış Walton'un kurşun aspartat çözeltisine 30 dakika yerleştirin.
  16. Walton'un kurşun aspartatında inkübasyondan sonra, dokuyu oda sıcaklığında ddH 2 O (Şekil 1G-I)içinde her biri3dakika (toplam 15 dakika)5x yıkayın.
  17. Buz gibi bir aseton serisi (%30, %50, %70, %95, %95, %100, %100 ve %100 aseton (varsa ddH2O'da) ile dokuyu susuz bırakın ve serinin her adımı için 10 dakika bekleyin.
  18. Buz gibi dehidrasyon serisini takiben, dokuyu 10 dakika boyunca oda sıcaklığı asetonunda yerleştirin.
    1. Bu süre zarfında, Embed 812 ACM reçineyi formüle edin. Işın hasarına karşı daha dayanıklı olduğu için "sert karışım" tarifini kullanın. Reçineyi iyice karıştırın ve dokuyu 4 saat boyunca 812:aseton (1:3 karışım) katıştırın, ardından 8 saat veya gece boyunca 812:aseton (1:1 karışımı) ekleyin ve son olarak gece boyunca 812:aseton (3:1 karışımı) gömün. Bu reçine sızma adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin.
  19. Ertesi gün, dokuyu 4-8 saat boyunca% 100 Gömün 812, daha sonra taze% 100 Bir gecede 812 gömün ve son olarak 4 saat boyunca taze% 100 Gömün 812. Bu reçine sızma adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin.
    1. Gömmeden hemen önce, az miktarda reçineyi bir karıştırma kabına yerleştirin ve reçine tozla doyurulana ancak hala akışkan olana ve grenli hale gelene kadar karbon siyahı tozunda yavaşça karıştırın (karıştırmak için ahşap bir çubuk kullanılabilir). Kalın mürekkebe benzemeli ve görünür kümeler olmadan ahşap çubuktan yavaşça damlatabilmelidir.
  20. Doku örneklerini silikon kauçuk kalıba yönlendirin ve reçine bloğu içindeki numune yönünün kaydedilmesi ve referans alınabilmesi için bir resim çekin. Numuneleri silikon kalıbın ucunda karbon siyahı doymuş reçine ile örtün ve kalıbı 65 °C'de ~1 saat fırına yerleştirin.
    1. Kalıbı, doku örneğini kapladığı kalıbın ucuna reçineyi içerecek bir eğime yerleştirin. Reçinenin karşı ucundaki kalıba deney/doku örneği tanımlayıcısı içeren bir etiket yerleştirin (Şekil 2A).
  21. Silikon kalıbı fırından çıkarın ve kalıbın geri kalanını etiketin görünür kalmasını sağlamak için net reçine (karbon siyahı yok) ile doldurun. Karbon siyahı ile aşılanmış reçineyi, berrak reçine ile kolayca karıştırmayacak kadar tedavi edin.
    1. Kalıp içinde doku içermeyen ekstra bir kuyu hazırlayın. Ekstra kuyudan başlayarak, kalıbın geri kalanını berrak reçine ile doldurun.
    2. Karbon siyahı aşılanmış reçine berrak reçineye kanamaya başlarsa, silikon kalıbı ek süre (örneğin, 15 dakika) fırına geri yerleştirin.
    3. Tüm doku örnekleri berrak reçine ile doldurulduktan sonra, kürleme işlemini tamamlamak için silikon kalıbı 48 saat boyunca 65 °C'de fırına (düz, eğimsiz) geri yerleştirin.

2. Blok Hazırlama

NOT: Yöntem, örneğin blokta nasıl yönlendirildiğine ve bölümlemenin nasıl gerçekleşeceğine bağlı olacaktır. Bununla birlikte, en yaygın doku yönelimi, reçine bloğunun ucuna ortalanmış, reçine bloğunun uzun ucuna dik olan dokuyu bulur.

  1. Çoğu durumda, önce numune bloğunu mikrotome aynasına yerleştirerek, konik ucu mandrenden yaklaşık 5-6 mm yukarı yapışarak dokuyu bulmak için bloğun ucunun kırpılması. Ayarlanan vida ile yerine kilitleyin ve bir ısı lambasının altına yerleştirin.
  2. Birkaç dakika sonra blok dövülebilir ve kırpılması kolay olacaktır. Mandreni stereomikroskop tutucusuna yerleştirin ve doku görünene kadar blok yüze paralel ince bölümler yapmak için yeni bir çift kenarlı jilet kullanın. Bu en iyi blok yüzünde angling ışığı ile görülür, doku örneği, reçinenin dokudan yoksun kısımlarına kıyasla daha az yansıtıcı ve ayrıntılı olacaktır. Dokunun nasıl ve nerede bulunduğu hakkında bir fikir için karbon siyahı doymuş reçinenin tanıtımından önce doku örneklerinin fotoğrafına danışın.
  3. Kırpma amacıyla bir numune pim tutucusu bir kenara koyun. Bu pim tutucu asla SEM haznesine yerleştirilecektir ve bu nedenle eldivensiz olarak ele alınabilir, bu kesme pimi tutucusu olarak adlandırılır. Görüntüleme odasına yerleştirilecek herhangi bir numune tutucuya eldivensiz asla dokunulmamalıdır. Bu, mikroskop odasına gres ve yağ girmesini önler.
  4. Kırpma pim tutucusuna alüminyum bir numune pimi yerleştirin ve pim tutucunun 3-4 mm üzerinde tutulan pimin yüzü (düz yüzey) ile set vidasını hafifçe sıkın.
  5. Numuneyi yerinde tutmak için kullanılan tutkal için daha geniş bir yüzey alanı sağlamak için pimin yüzünde birkaç derin, çaprazlama çizikleri yapın. Alüminyum pim kullanılırsa, bu adım için küçük bir çelik düz başlı tornavida önerilir (Şekil 2B).
  6. Doku örneğini içeren mandreni, reçine yumuşak ve dövülebilir hale gelene kadar ısı lambasının altına geri yerleştirin, ardından stereomikroskopun altındaki ayna kabına yerleştirin.
  7. Reçine bloğunun doku örneğini içeren kısmından fazla reçineyi kesmek için çift kenarlı bir jilet kullanmak. Sonuçta pime bağlı doku bloğunun boyutu yaklaşık 3 mm çapında ve 2-3 mm yüksekliğinde olacaktır.
    1. Jileti doğrudan reçine bloğuna kabaca 1-2 mm itin, ardından jileti bir önceki kesime eşit derinlikte reçine bloğuna yatay olarak dikkatlice itin. Bloğun doku örneğini içeren kısmına zarar vermek veya kesmek mümkün olduğundan, bunu yavaşça ve büyük bir dikkatle yapın. İki kesik bir araya geldikçe, fazla reçine bloktan ayrılır. Sadece 3 mm x 3 mm yükseltilmiş alan kalana kadar reçineyi çıkarmaya devam edin.
  8. Bu ilk kırpmadan sonra, bloğu (hala aynada) birkaç dakika boyunca ısı lambasının altına yerleştirin.
  9. Reçine yumuşak ve dövülebilir hale geldikten sonra, bloğu stereomikroskopun altına geri yerleştirin. Yeni bir çift kenarlı jilet kullanarak, reçine bloğunun üst kısmını, kesilmiş kısmın yaklaşık 1 mm altında, tek bir pürüzsüz kesimle kesin. Numune pimine yapıştırılacağı için düz bir yüzey tercih edilir. Bu adım bloğun kaldırılan kısmına aktarabilecek ve uçup kaçmasına neden olabilecek bir miktar kuvvet gerektirdiğinden, örneğin kaybolmasına izin vermemeye dikkat edin. Kesilmiş ve kesilmiş numuneyi bir kenara yerleştirin.
  10. Kesilmiş alüminyum pim içeren kırpma pim tutucusuna stereomikroskop haznesine yerleştirin. Pim yüzüne, görünür bir menisküs oluşturmadan pimi tamamen kapacak şekilde ince bir siyanoakrilat tutkal tabakası uygulayın. Doku bloğunun kesilmiş parçasını tokalarla alın ve pim yüzüne yerleştirin. Doku örneğini numune piminin üzerine ortala. Aşağı itin ve birkaç saniye tutun. Tutkalın birkaç dakika ayarlamasına izin verin.
  11. Tutkal iyice kuruduğunda, kırpma pim tutucusuna stereomikroskopun altına geri yerleştirin. İnce bir dosya kullanarak, fazla reçineyi, iğnenin üzerinde hiçbir reçinenin sarkmasın diye dosyala. Reçine şekli dairesel pim kafasına benzemelidir.
  12. Reçine bloğunuzun yükseltilmiş kısmındaki dokuyu bulun, eğik aydınlatma bunun için yararlıdır. Çift kenarlı bir jilet kullanılarak, doku örneğini içeren reçinenin yükseltilmiş kısmı 1 mm2'denbüyük olmayan bir alana kesilmelidir. Mümkünse, blok yüz daha da küçük kesilebilir, bu elmas bıçak üzerindeki stresi azaltacak ve uzun ömürlülüğünü artıracaktır.
    1. Mümkün olduğunca fazla reçineyi çıkarın ve bloğu bir boyutta biraz daha uzun bırakın. Çok fazla kuvvet uygulandığında doku örneğini içeren reçinenin parçalanması mümkün olduğundan, bu yavaşça ve özenle yapılır. Bir jilet önerilirken, bu adım için ince bir metal dosya kullanılabilir.
  13. İnce bir metal dosya açısı ile fazla reçine, doku örneğini içeren yükseltilmiş kısmın dışındaki alanda, pimin kenarına doğru aşağı doğru (Şekil 2C).
  14. Gümüş boya ve ardından altın püskürtme uygulamadan önce hazırlanan numuneden reçine parçacıklarını ve tozları çıkarın. Gümüşü asetonla karıştırın, böylece kolayca yayılabilir bir sıvıdır, ojeye benzer (ancak aplikatörden damlayacak kadar ince değildir) ve tüm numune bloğu yüzeyine ince bir kat uygulayın. Aseton hızla buharlaşır, bu nedenle gümüş boya kalınlaşmaya başladığında ek aseton eklemek gerekebilir.
    1. Mikroskopa yüklenmeden önce gümüş boyanın gece boyunca kurumasını bekleyin.
      NOT: Blok yüzünün 1 mm x 1 mm'nin ötesine genişlememesi için bu gümüş tabakanın ince olması gerekir ve gümüş boya elmas bıçağına hiç zarar vermemiş olsa da, elmas bıçağın uzun ömürlülüğünü korumak için daha küçük blok yüzler önerilir. Gümüşle karıştırılan aseton, görüntüleme odasına aseton buharı sokmaktan kaçınmak için numuneyi mikroskopta altın püskürtmeden veya yüklemeden önce tamamen buharlaşmalıdır.
    2. Gümüş boyanın uygulanmasından sonra, numune bloğuna ince bir altın tabakası uygulayın. Standart bir altın folyo hedefi ile donatılmış standart bir vakum püskürtme cihazı kullanarak, 200 miliTorr (Argon gazı) oda basıncı ve 2 dakika boyunca çalışan 40 miliamper, 20 nm kalınlığında altın kaplama ile sonuçlanacaktır.
  15. Kaplamadan sonra, monte edilmiş ve kesilmiş bloğu uygun deney etiketi takılı bir tüpe yerleştirin. Tek kullanımlık transfer pipetleri kullanarak özel tüpler oluşturun.
    1. Transfer pipetini ampulnün hemen altına kesin, transfer pipet tüpünün kısa bir kısmını soğanlı ucun altına takın. Kesilen boru kısmını kısaltın ve pipet ucunu yeterince geri kesin, böylece alüminyum numune pimi içine sokulabilir.
    2. Alüminyum numune pimini içeren ucu modifiye transfer pipetinin soğanlı ucuna yerleştirin.
  16. Hazırlanan bir doku bloğunu yüklemeden önce, fazla gümüş boyayı blok yüzünün yüzeyinden dikkatlice kesin.

3. Blok Yüzü Görüntülemek için SEM Ayarları

NOT: Takip eden görüntüleme ayarları, yazarlar tarafından kullanılan ve sağlanan Materyaller Tablosunda listelenen cihazda üretilmiştir. Bu cihaz değişken basınçlı görüntüleme yeteneğine sahip olsa da, en iyi sonuçlar yüksek vakum altında yakalandı.

  1. Durma Zamanı: Seri kesitleme sırasında 12 μs/px kullanın. İlgi çekici bir bölge tespit edildiğinde, 32 μs/px'te daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü elde edilebilir.
  2. Vakum Ayarları: 9e-008 Pa'lık bir top basıncı, 1.1e-004 Pa'lık bir kolon basıncı ve 9.5e-002 Pa oda basıncı kullanın.
  3. Yakalama Süresi: Yukarıdaki ayarlarla, görüntü başına 50 saniye hızında 2048x2048 px görüntü yığını yakalayın. İlgi çekici bölgelerin daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri, görüntü başına 9 dakikadan biraz daha az bir hızda 4096x4096 px'te yakalanabilir.
  4. Kesit Kalınlığı: 100-200 nm kullanın. Daha azı mümkündür, ancak daha düşük ışın voltajı, yoğunluğu veya durma süresi gerektirebilir.
  5. Yüksek Gerilim (HV): 7-12 kV kullanın. Gerilimi artırmak spot boyutunu azaltır ve çözünürlüğü artırırken, ışın hasarı için daha fazla olasılık sunar. Daha yüksek kV, ışın penetrasyonunu arttırır ve bu da ayrıntıların kaybolmasına neden olur. Bununla birlikte, kV'nin düşürülmesi sinyali gürültü oranına düşürür (Şekil 3)14.
  6. Işın Yoğunluğu (BI): Yazarın SBF-SEM cihazı 1-20 arasında değişen bir ışın yoğunluğu ölçeği sunar. Bu ölçekte, 5-7 değerleri aşırı şarj ve ışın hasarı olmadan kaliteli görüntüler verir. BI ne kadar yüksek olursa çözünürlük o kadar büyük olursa, şarj etme ve ışın hasarı14.
  7. Spot Boyutu ve Görüntü Büyütme: Işın yoğunluğuna ve voltaj seviyesine göre nokta boyutunu belirleyin. İdeal olarak, spot boyutu kullanılan piksel boyutundan daha büyük olmamalıdır. Piksel boyutu, görüş alanının (FOV) piksel sayısına bölünmesiyle belirlenir. Örneğin, görüntü boyutu 2048x2048 piksel olan 25 μm FOV piksel başına 12,2 nm verir. Bu nedenle spot boyutu 12,2 nm'den büyük olmamalıdır. Şekil 4, HV, BI ve spot boyutunun nasıl ilişkili olduğunu göstermektedir.
  8. Çalışma Mesafesi (WD) - Blok yüz görüntüleme ile çalışma mesafesi ayarlanamaz. Bu sadece bir odaklanma faktörüdür. Görüntülenmiş tüm bloklar için neredeyse aynı olacaktır. Çalışma mesafesi ayarlanamazken, yakalanan görüntünün çözünürlüğünde kritik bir rol oynar. Çalışma mesafesi azaldıkça, yakalanan görüntülerdeki çözünürlük sınırı artar. Bazı durumlarda görüntüleme odasında değişiklikler yaparak çalışma mesafesini azaltmak mümkün olabilir, ancak bu değişiklikler kullanıcının takdirine bağlı olarak yapılmalıdır. Çalışma mesafesini azaltmak ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için kapı montaj mikrotom vidalarını gevşettik ve mikrotomları vidaları yeniden iyileştirdikten sonra ışın dedektörüne ~2 mm daha yakın olacak şekilde yeniden konumlandırdık.
  9. Çözünürlük - Yukarıdaki ayarları kullanarak, 3,8 nm'ye kadar x & y çözünürlük mümkündür. Çözünürlüğün ışın nokta boyutunun yanı sıra görüntü yakalamalarının piksel çözünürlüğü ile sınırlı olduğunu belirtmek önemlidir (örneğin, 2048x2048 piksel görüntüde yakalanan 20 μm görüş alanı, 3,8 nm spot boyutu kullanılmış olsa bile 9,8 nm piksel çözünürlüğüne sahiptir). z düzlemdeki görüntü çözünürlüğü kesit kalınlığına bağlıdır, 100-200 nm'nin bu protokolle iyi çalıştığını görüyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare Korneası
Bu protokol fare korneasına kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerden (EFMB) oluşan bir ağın mevcut olduğu gösterilmiştir. Daha önce bu ağın sadece embriyonik ve erken postnatal gelişim sırasında mevcut olduğuna inanılıyordu. SBF-SEM, kornea boyunca geniş bir EFMB ağı ortaya çıkardı ve kesit şeklinde ölçüldüğünde 100-200 nm çapında olduğu tespit edilen bireysel lifler bulundu. Ayrıca, bu E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemlerin amacı, laboratuvarımızın yüksek çözünürlüklü seri elektron mikroskopi görüntülerini güvenilir bir şekilde yakalamasını sağlayan doku hazırlama ve görüntüleme metodolojisini vurgulamak ve SBF-SEM görüntülemesini yaparken oluşabilecek potansiyel tuzakların yanı sıra bu sonuca yol açan kritik adımlara dikkat çekmektir. Bu protokolün kullanılmasındaki başarı, dokunun düzgün bir şekilde sabitlenmesi, ağır metallerin numuneye emprenye edilmesi, şarjı azaltmak için gömme reçinesinin değiştirilmesi ve görüntüleri ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown ve Margaret Gondo'ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 EY-018239 ve P30 EY007551 (Ulusal Göz Enstitüsü), kısmen Lion's Foundation for Sight ve kısmen NIH 1R15 HD084262-01 (Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü) tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Alüminyum PerçinEndüstriyel Perçin & Bağlantı Elemanları A.Ş.6N37RFLAP/1100Numune pimi olarak kullanılır.
2.5mm Düz Başlı TornavidaWiha Kalite Araçları27225
Aseton ElektronMikroskobu BilimleriRT 10000Gümüş boyayı seyreltmek için kullanılır.
Aspartik AsitSigma-AldrichA8949
Kalsiyum KlorürFisherScientificC79-500
İletken Gümüş BoyaTed Pella16062
Denton Desk-II Standart altın folyo hedef ile donatılmış Vakumlu Püskürtme CihazıDenton VakumN/ABu, yazarlar tarafından kullanılan altın püskürtme cihazıdır, alternatifler kabul edilebilir.
Çift Kenarlı Tıraş MakineleriFisher Scientific50-949-411
Gömme 812Elektron Mikroskobu Bilimleri14120
Gatan 3View2, Tescan Mira3 Alan emisyonuSEM Gatan & TescanN/ABu, yazarlar tarafından kullanılan SBF-SEM cihazıdır, alternatifler kabul edilebilir.
Cam Kabuk Şişeleri, 0.5 DRAM (1.8 ml)Elektron Mikroskobu Bilimleri72630-05
Gluteraldehit ElektronMikroskobu Bilimleri16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNAMetinde siyanoakrilat yapıştırıcı olarak anılır.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDMetinde karbon siyahı olarak anılır.
KOHFisherScientific18-605-593
Kurşun NitratFisher ScientificL62-100
MikrodalgaPelcoBioWave ProBu, yazarlar tarafından kullanılan mikrodalgadır, alternatifler kabul edilebilir.
Osmiyum TetroksitSigma-Aldrich201030
Potasyum FerrosiyanürSigma-AldrichP9387
Silikon Gömme KalıpTed Pella10504
Sodyum Kakodilat TrihidratElektron Mikroskobu Bilimleri12300
Samco Transfer PipetiThermoFisher Scientific202Numune pimi yapmak için kullanılır depolama tüpleri.
İsviçre Desen İğne DosyalarıElektron Mikroskobu Bilimleri62115
TiyokarbohidrazidSigma-Aldrich223220
Uranil AsetatPolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AŞekil 5-7 ve 9'da bulunan rekonstrüksiyonları oluşturmak için kullanılır.
Fiji (Fiji Just ImageJ'dir)ImageJ.netN/ATrakEM2, manuel segmentasyona yardımcı olmak için Fiji'ye eklenebilir.
Mikroskopi Görüntü Tarayıcısı (MIB)Helsinki Üniversitesi, Biyoteknoloji EnstitüsüN/A
YazılımıSinir Sistemleri LaboratuvarıN/A
SuRVoS TezgahıElmas Işık Kaynağı & Nottingham ÜniversitesiN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/ASanal gerçeklik ve histogram tabanlı rekonstrüksiyon yöntemlerinde rekonstrüksiyona izin verir.
Yeniden Yapılandırma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329(2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985(2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11(2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107(2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721(2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434(2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388(2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53(2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801(2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910(2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357(2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173(2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face SEMScanning Electron MicroscopyTissue PreparationBiological Tissue SamplesThree Dimensional ImagingResin EmbeddingTissue UltrastructureImage AcquisitionElectron Microscopy ArtifactsCorneal Nerve Imaging

Related Articles