Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Özet

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Özet

Önceki insan organotipik retina kültürü (HORC) modelleri müstakil retinalar kullanmıştır; bununla birlikte, retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera tarafından verilen yapısal destek olmadan, kırılgan retinanın bütünlüğü kolayca tehlikeye atılabilir. Bu çalışmanın amacı retina eksplantlarını kültlürken retina bütünlüğünü korumak için retina, RPE-koroid ve sklera içeren yeni bir HORC modeli geliştirmekti.

İris ve lensi çıkarmak için limbüs boyunca çevresel olarak kesildikten sonra, göz kapağını düzleştirmek için dört derin kesi yapıldı. Önceki HORC protokollerinin aksine, sadece retinayı değil, RPE-koroid ve sklerayı da kesmek için bir trefin kullanıldı. Ortaya çıkan üç katmanlı eksplantlar 72 saat boyunca kültürlendi. Anatomik yapıları değerlendirmek için hematoksilin ve Eozin lekeleme (H&E) kullanıldı ve retina eksplantları apoptoz, Müller hücre bütünlüğü ve retina iltihabı için immünhistokimya (IHC) ile karakterize edildi. Hastalık indüksiyon olasılığını doğrulamak için eksplantlar diyabetik retinopatiyi (DR) taklit etmek için yüksek glikoz (HG) ve pro-enflamatuar sitokinlere (Cyt) maruz kaldı. Luminex manyetik boncuk tahlili, kültür ortamına salınan DR ile ilişkili sitokinleri ölçmek için kullanıldı.

H&E lekeleme, alttaki RPE-choroid ve sklera ile retina eksplantlarında belirgin retinal lamel ve kompakt çekirdekler ortaya çıkarırken, alttaki yapılar olmayan retinalarda daha az kalınlık ve ciddi çekirdek kaybı gözlendi. IHC sonuçları apoptoz ve retina iltihabının yanı sıra korunmuş Müller hücre bütünlüğünün olmadığını gösterdi. Luminex tahlilleri, HG + Cyt'e maruz kalan retina eksplantlarında DR ile ilişkili pro-enflamatuar sitokinlerin 24 saat taban çizgisi seviyelerine göre salgılarının önemli ölçüde arttığını göstermiştir.

Retina bütünlüğünün apoptoz veya retina iltihabı olmadan korunduğu yeni bir HORC protokolünü başarıyla geliştirdik ve karakterize ettik. Ayrıca, retina eksplantlarını HG + Cyt'e maruz açıklarken DR ile ilişkili pro-enflamatuar biyobelirteçlerin indüklenmiş salgılanması, bu modelin klinik olarak çevrilebilir retina hastalığı çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektedir.

Giriş

Retina, gelen ışık enerjisini elektrik sinyallerine dönüştürmekten sorumlu son derece özel bir oküler yapıdır ve daha sonra beyin tarafından görsel algı için işlenir. İnsan retinası, iki sinaptik ve üç çekirdek katmanı¹ 'den(Şekil 1)oluşan benzersiz bir lameller yapıda son derece düzenlenmiş dinamik bir hücre tipi yelpazesi içerir. Retina homeostazı nöroretinal hücreler, kan damarları, sinirler, bağ dokuları ve RPE¹arasındaki karmaşık bağlantılar tarafından sürdürülür. Sofistike retina anatomisi ve fizyolojisi nedeniyle, birçok retina hastalığının mekanizmaları hala iyi anlaşılmamıştır

Protokol

İnsan donör göz kapları, nakil için kornea eksizyonunu takiben ve Kuzey B Sağlık ve Engellilik Etik Komitesi (NTX/06/19/CPD/AM07) tarafından onaylandığı şekilde Yeni Zelanda Ulusal Göz Bankası'ndan elde edildi.

NOT: Steril doku kültürü koşullarını sağlamak için kültür sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Önemli retina bütünlüğü kaybını önlemek için dokular 24 saat içinde kültürlenmelidir.

Şekil 2: Sandviç retina eksplantlarının toplanması prosedürün....

Sonuçlar

Bu HORC modelinde retina bütünlüğü korunmuştur. Retina bütünlüğü kültürlü sandviç retina eksplantlarında korunmuş, ancak bitişik yapılar olmadan kültürlenmiş retinada kaybolmuştur. H&E, kültürde 72 saat sonra kesitli sandviç retina eksplantlarının yapısal bütünlüğünü incelemek için yapılmıştır. Sandviç retina eksplantları, INL ve ONL'de kompakt çekirdeklerle GCL'den ONL'ye korunmuş bütünlük ve belirgin bir lamel yapısı göstermiştir (Şekil 4A).

Tartışma

HORC şu anda klinik öncesi retina araştırmalarında klinik olarak en çevrilebilir modeldir. İn vitro hücre kültürü modelleriyle karşılaştırıldığında, HORC, dinamik retina hücre tiplerini ve nöronlar, vaskülürler ve hücre dışı ortamla bağlantılarını koruyarak insan retinasının anatomisini daha iyi temsil edebilir¹⁹. Hayvan modellerine kıyasla HORC, farklı retina hücre tiplerinin yanı sıra değişen fotoreceptör yoğunluğu ve oranları gibi türler arası varyasyonlar nedeniyle insan retina hastalıklarının.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tek Kullanımlık Biyopsi Punchları (5 mm)	Integra York PA Inc., ABD	21909-142	Bu makalede cerrahi trefinler olarak anılacaktır
İnsan Rekombinant IL-1 ve beta;	Peprotech, ABD	200-01B	Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL
İnsan Rekombinantı TNF-a	Peprotech, ABD	300-01A	Çalışma konsantrasyonu: 10 ng / mL
DAPI (1 & mikro; g/mL)	Sigma Aldrich, Almanya	#D9542	Nükleer leke. Çalışma seyreltmesi 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesi	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., ABD	10565018	Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium besin karışımı F-12, 1 & kez; antibiyotikler ve antimikotik karışımı (AA, 100 kez; stok)
İnce Makas - Keskin-Künt	İnce Bilim Aletleri (FST)	14028-10	İpuçları: Keskin-Künt, Kesme Kenarı: 27mm, Uzunluk: 10cm, Alaşım / Malzeme: Paslanmaz Çelik, Tırtıklı: Hayır, Uç Şekli: Düz
Graefe Forseps	Güzel Bilim Aletleri (FST)	11050-10	Uzunluk: 10cm, Uç şekli: Düz, Uçlar: Tırtıklı, Uç Genişliği: 0,8 mm, Uç Boyutları: 0,8 x 0,7 mm, Alaşım / Malzemeler: Paslanmaz Çelik
Fare monoklonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Almanya	#C9205	Cy3'e konjuge primer antikor. Çalışma seyreltmesi 1:1000.
Fare monoklonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Almanya	#C9080	Cy3'e konjuge edilmiş birincil antikor. Çalışma seyreltmesi 1:50.
Tavşan poliklonal TUNEL (Yerinde Hücre Ölümü Tespit Kiti, Floresein)	Sigma Aldrich, Almanya	# 11684795910	Floresein-dUTP'ye konjuge primer antikor. Enzim tampon çözeltisi ile 1:10 oranında çalışma seyreltmesi.