Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi kullanılarak adaptif lökosit alt kümelerinin karakterizasyonu için taze kireçlenmiş aort kapakçıkları örneklerinden T lenfosit izolasyonu sürecini ve T hücre klonlama analitik adımlarını açıklarız.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kapakçığın hafif kalınlaşmasından şiddetli kireçlenmeye kadar uzanan aktif bir hastalık süreci olan kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), transktheter aort kapak replasmanı (TAVR) gibi yeni terapötik seçeneklere rağmen yüksek mortalite ile ilişkilidir.
Kapak kireçlenmesi ile başlayan ve şiddetli aort darlığı ile yol açan tüm yollar sadece kısmen anlaşılmaktadır. Aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayarak, T lenfositlerinin stenotik kapak dokusundan test edilmesi, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Cerrahi eksizyondan sonra, taze aort kapak örneği küçük parçalar halinde parçalara ayrılır ve T lenfositleri kültürlenir, klonlanır ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanılarak analiz edilir.
Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden elde edilen sonuçlar, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T hücre konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt türlerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir. Bu çalışmada, CAVD patofizyolojisinde adaptif bağışıklığın rolünü daha iyi anlamak için taze kireçlenmiş aort kapak örnekleri üzerinde gerçekleştirilen T hücrelerinin izolasyonunu ve akış sitometrisi kullanarak T hücre klonlarının analiz edilmesinin adımlarını gösteriyoruz.
Giriş
Kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), sağlık hizmetleri üzerinde ağır bir etkisi olan en yaygın kalp kapak hastalıklarından biridir. Son yıllarda aort kapak değişimi sıklığı önemli ölçüde artmıştır ve artan yaşlı nüfus nedeniyle daha da artması beklanmaktadır1.
CAVD'nin alttaki patofizyolojisi sadece kısmen bilinmektedir ve mevcut terapötik stratejiler cerrahi veya perkütan prosedürler yoluyla konservatif önlemler veya aort kapak değişimi ile sınırlıdır. Bugüne kadar, aort kapak değişimi (AVR) yapılmadıkça, etkili hiçbir tıbbi tedavi CAVD ilerlemesini engelleyemez veya tersine çeviremez ve yüksek mortalite erken sempt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma, İyi Bilimsel Uygulamanın Sağlanması için Charité Tüzüğü'ne göre yürütüldü ve gizlilik ve etikle ilgili yasal kılavuz ve hükümlere uyulur. Etik Kurul tüm insan deneylerini onaylamıştır ve hastaların mahremiyeti ve anonimliği Etik Form'da bildirilen kurallara uygun olarak sürdürülmektedir.
NOT: Aşağıda açıklanan protokol için taze insan stenotik kapak örnekleri kullanılmıştır.
1. Reaktif hazırlama
- RPMI 1640 Medium: Non-esansiyel amino asitler ekleyerek zenginleştirilmiş RPMI komple ortamını hazırlayın; Sodyum Piruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol ve Penisilin-Streptomisin (Pen/Strep). Kullanmad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şiddetli aort kapak darlığı olan insan hastalardan elde edilen taze aort kapak örneklerinin lökosit popülasyonu karakterize etmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntem kullandık (protokole bakın). PBMC'leri izole etme yöntemi, deneyin her adımında (klonlama, yeniden besleme ve bölme aşamaları) kullanılan besleyici hücrelerin elde edilmesinde hayati bir adımdır ve aort valf örneklerinde lökositlerin algılanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. Bu yöntemin temel adımları Şekil 1'de gösterilm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada akış sitometrisi kullanarak stenotik aort kapak örneklerinden izole edilmiş T lenfosit subpopulasyonlarını karakterize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, PBMC'leri izole etmek için ışınlanmış buffy coat kullanılmasını gerektirir. Buffy ceket torbalarının tabi tutulması gereken radyasyon frekansı 9000 Rad/90 Gridir (Gy) ve besleyici hücrelerin çoğalmasını durdurmak için çok önemli bir adımı temsil eder. Buffy ceket torbalarından izole edilen hücrelerin rolü, sadece besleyici hücreler olarak hareket etmek v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu protokol için kullanılan tüm buffy palto çantaları, Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer ve Charité Benjamin Franklin Radyoloji Bölümü'nün tüm ekibinin mevcudiyeti sayesinde ışınlandı. Burs sahibi/Mary Roxana Christopher, bu çalışma Alman Kardiyak Derneği'nin (DGK) bursu ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL plastik şırınga | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96 kuyulu U-dipli Çok kuyulu plakalar | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Torba Spike (iğnesiz) | Sigma | P6148 | ile %4'e seyreltin |
| Parlak menekşe 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE& | nbsp; Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE / Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Parlak menekşe 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Parlak menekşe 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tüpü 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tüpü 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL konik santrifüj tüpü | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL konik santrifüj tüpleri | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler | BD | 2300E | |
| Hızlı okuma 102 plastik sayma haznesi | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Kültür ortamı için filtreler 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Kültür ortamı için filtreler 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Liyofilize Takviye Edici Gıda | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Bazal Orta | Irvine Scientific | T000 | |
| Isı ile İnaktive Edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (İnsan serumu) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| İnsan IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamin | Gibco | 11140050 | |
| Lenforep | Şahin | 352057 | |
| Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehit | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Fosfat tamponlu salin) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penisilin / Streptomisin | Gibco | 15070063 10000 U / mL | |
| PHA (fitohemaglutinin) | Kök Hücre Teknolojiler | 7811 | |
| Plastik Petri kapları | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Medya | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodyum piruvat | Gibco by Life teknolojileri | 11360070 | |
| Şırınga Filtreleri 0,45 mikro; l | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Hücre kültürü şişeleri | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Hücre kültürü şişesi | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Merkaptoetanol | Gibco | A2916801 |
Kaynaklar
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
