Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Safra Kanalı TNBS infüzyonu ile Kronik Pankreatit için Bir Fare Modeli

3.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

28 Şubat 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Kronik pankreatit (CP), genellikle inatçı karın ağrısı ile ilişkili olan pankreasın iltihabı ve fibrozisi ile karakterize bir hastalıktır. Bu makalede, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfiyonik asit (TNBS) ile safra kanalı infüzyonu yoluyla CP'nin fare modelini oluşturma tekniğinin iyileştirilmesine odaklanmaktadır.

Özet

Kronik pankreatit (CP), pankreas iltihabı ve fibrozis, glandüler atrofi, karın ağrısı ve diğer semptomları içeren karmaşık bir hastalıktır. Safra kanalı 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) infüzyon modelinin CP'de görülen nöropatik ağrının özelliklerini çoğalttığı CP'yi incelemek için çeşitli kemirgen modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farelerde safra yolu ilaç infüzyonu teknik olarak zordur. Bu protokol, cp fare modeli üretimi için safra kanalı TNBS infüzyon prosedürünü gösterir. TNBS, duodenumdaki Vater ampullası aracılığıyla pankreasa aşılandı. Bu protokol, işlem sırasında ilaç hacmini, cerrahi teknikleri ve ilaç kullanımını optimize etti. TNBS ile tedavi edilen fareler, vücut ağırlığı ve pankreas kilo azalmaları, ağrıya bağlı davranışlardaki değişiklikler ve anormal pankreas morfolojisi ile yansıtıldığı gibi CP özellikleri gösterdi. Bu gelişmelerle TNBS enjeksiyonu ile ilişkili mortalite en az düzeydeydi. Bu prosedür sadece pankreas hastalığı modellerinin oluşturulmasında kritik değildir, aynı zamanda lokal pankreas ilacı dağıtımında da yararlıdır.

Giriş

Kronik pankreatit (CP), pankreas atrofisi, fibrozis, karın ağrısı ve hem ekzokrin hem de endokrin fonksiyonların nihai kaybı ile karakterize kronik bir enflamatuar hastalıktır1. Mevcut tıbbi ve cerrahi tedaviler iyileştirici değildir, ancak hastalığın sonucu olan semptomları hafifletmek için üstlenilir: refrakter karın ağrısı, endokrin ve ekzokrin disfonksiyon. Bu nedenle, acilen daha etkili tedavilere ihtiyaç vardır2. Hayvan modelleri, hastalığın daha iyi anlaşılması ve potansiyel terapötiklerin araştırılması için gerekli bir araç sağlar3. CP için cerulein ve/veya alkol modellerinin yaygın olarak kullanıldığı birden fazla fare modeli geliştirilmiştir. Bir oligopeptid uyarıcı pankreas salgısı olan Cerulein'in, pankreas atrofisi, fibrozis içeren bir CP modelini tekrar tekrar teşvik ettiği gösterilmiştir4. Başka bir yaygın model, insan hastalarda gözlemlenene benzer ekzokrin yetmezlik üreten L-arginin seri enjeksiyonlarını kullanır5. CP ayrıca komple veya kısmi pankreas kanalı ligasyonu ve pankreas kanalıhipertansiyonu 6,7ile de indüklenebilir. CP için mevcut hayvan modellerinin çeşitliliğine rağmen, bu modellerin hiçbiri CP hastalarının yaşadığı karın ağrısını etkili bir şekilde yeniden üretmez8.

Önceki çalışmalar, 2,4,6 -trinitrobenzen sülfikonik asit (TNBS) lokal pankreas enjeksiyonunun CP hastalarının yaşadığı kalıcı ağrıyı9, 10,11çoğaldığını göstermiştir. TNBS ile tedavi edilen fareler, karın aşırı duyarlılığı ve ağrıya bağlı davranışların artmasının yanı sıra, CP hastalarında gözlenen bir fenomen olan ağrılı uyaranlara "genelleştirilmiş aşırı duyarlılık" göstermiştir10. CP ağrısını doğru bir şekilde taklit etmenin yanı sıra, TNBS modeli ayrıca fibrozis, mononükleer hücre infiltrasyon ve acınar hücrelerin yağ dokusu ile değiştirilmesi gibi insan durumunun diğer patolojik özelliklerini de çoğaltır10,12. Bununla birlikte, safra kanalı ile TNBS infüzyonu, farelerde ölüme neden olabilecek teknik olarak zorlu bir prosedürdür. Bilgimize göre, safra kanalı infüzyonunun nasıl yapıldığını gösteren görsel bir protokol yoktur. Bu yazıda, bir CP fare modeli oluşturmak için TNBS safra kanalı infüzyonunun prosedürünü gösteriyoruz. Bu prosedür CP ve diğer pankreas hastalıklarının incelenmesi için değerli hayvan modelleri üretmeye yardımcı olacak ve pankreas13'ediğer malzemeleri (örneğin virüs, hücreler) aşılamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi ve Ralph H. Johnson Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin onayıyla gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Fareler, yiyecek ve suya reklam libitumaccess ile standart bir 12 ışık / 12 karanlık döngü altında barındırıldı.

1. Enjeksiyon için TNBS çözeltisinin hazırlanması

  1. % 0.9 salin içinde% 10 etanol hazırlayın. %10 etanol 1 mL'ye 7,5 μL TNBS ekleyerek stok TNBS'yi (bkz. Malzeme Tablosu)%10 etanol içinde 7,5 mM'lik nihai konsantrasyonda çözün.
    DİkKAT: TNBS kimyasal bir tehlike oluşturur. Çözeltiyi bir duman kaputunun içine hazırlayın ve TNBS ile doğrudan teması önlemek için eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın.
  2. 50 μL%0,75 TNBS çözeltisini 31 kalibrelik bir iğne ile bir insülin şırıngasına yükleyin. Salin içinde araç kontrolü ile aynı boyutta bir şırınna 50 μL%10 etanol yükleyin. Şırınnaları buza yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar ışıktan koruyun.

2. Fare hazırlama ve ameliyat

  1. Karın cerrahi bölgesinden saçları tıraş edin.
  2. Ameliyattan önce analjezik dozda (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) bir adet önceden enjekte edin.
  3. Fareyi% 1.5-2 izofluran ve 1 L / dk oksijen ile genel anestezi altında indükle ve koruyun. Parmakları sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği nedeniyle gözlemleyerek anesteziyi onaylayın.
  4. Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. Fare anestezi altındayken her göze veteriner merhem uygulayın.
  5. Cerrahi bölgeyi %2 iyotla 3x silerek, ardından %70 alkol(Malzeme Masası)ile dezenfekte edin.
  6. 0,5-1 cm'lik bir kesi oluşturmak için mikro makasla laparotomi gerçekleştirin.
  7. Duodenumu hafifçe maruz bırak ve pamuklu çubuklar ( Malzeme Masası ) kullanarak ortak safrakanalınıbulun.
  8. TNBS veya araççözeltilerininkaraciğere ve safra kesesine akışını önlemek için proksimal ortak kanalın üzerine düz bir mikro hemo klipsi ( Malzeme Tablosu ) yerleştirin (Şekil 1A, B).
  9. Duodenumu hafifçe maruz koyun ve iğneyi Vater'in papillası aracılığıyla pankreas kanalına yerleştirin.
  10. İğne kanalın içine girdikten sonra, iğneyi yerine sabitlemek ve enjekte edilençözeltininduodenuma girmesini önlemek için iğneyi çevreleyen duodenumun üzerine kavisli bir mikro hemo klipsi(Malzeme Tablosu ) yerleştirin .
  11. Çözeltiyi (TNBS veya araç) bir dakika boyunca pankreas kanalına yavaş yavaş aşılayın.
    NOT: TNBS'nin bir dakika içinde yavaşça aşılanması gerekir ve pankreas 5/16 inç ve 31G iğneli bir insülin şırıngası ile perfüzyon edildiğinde infüzyon hızını kontrol etmek kolaydır. Safra kanalına batmamak için eli mümkün olduğunca sabit tutun. TNBS başarıyla enjekte edilirse, pankreasın içinde sarı renk görülebilir.
  12. İnfüzyondan sonra, karaciğerin yakınındaki mikro kelepçeyi dikkatlice çıkarın ve ardından iğneyi ve duodenumu tutan mikro kelepçeyi çıkarın.
  13. Duodenumu dikkatlice orijinal konumuna getirin.
  14. Duodenumun orijinal konumuna dönmesine yardımcı olmak ve peristalsin iyileşmesine yardımcı olmak için kapanmadan önce karın boşluğunda 0,5 mL sıcak steril salin (36-37 °C) bırakın.
  15. 5-0 dikiş ile sürekli dikiş kullanarak kas tabakasındaki kesiği kapatın. 4-0 dikiş ile yarıda kalan dikiş kullanarak cildi kapatın.
  16. Anesteziden iyileşmeyi sağlamak için fareleri içeren kafesi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  17. Farelerin sıcak olduğunu ve bekleme odasına geri dönmeden önce spontan hareket edebildiğini onaylayın.
  18. Her 12 saatte bir analjezik (örneğin, buprenorfin 0.1 mg/kg i.p.) ve ameliyat sonrası 48 saat için ek ısı sağlamaya devam edin.

3. Fare davranışını izleme

  1. Ameliyat sonrası 7. günde dikişleri çıkarın.
  2. Ameliyat sonrası ilk hafta boyunca fare sağlığını ve davranışını günlük olarak izleyin. Seslendirme, kambur sırt duruşu veya daha az hareket etme gibi sıkıntı belirtilerine dikkat edin. Vücut ağırlığını her gün ölçün.
  3. Von Frey monofilamentlerini (VFF' ler) karın mekanik aşırı duyarlılığını ölçmek için kullanın ve ameliyat sonrası9,14olarak tanımlandığı gibi2,3 hafta.
    1. Her 1-2 sn'de 10x olan üst karın bölgesine artan sırada farklı uygulanan kuvvetlerin VFF'lerini uygulayın. Karnın yükseltilmesini, geri çekilmesini veya yalamasını (çekilme yanıtı) olumlu bir yanıt olarak düşünün.
    2. Olumlu bir yanıt gözlenmezse daha güçlü bir uyaran, olumlu bir yanıt gözlenirse daha zayıf bir uyaran uygulayın. Çekilme eşiği, farenin zamanın% 50'sini yanıtladığı kuvvettir.

4. Pankreas dokusunun toplanması ve histolojik analizi

  1. Servikal çıkık ile anestezi altındaki fareleri kurban edin ve pankreası bağırsaktan ve diğer organlardan dikkatlice parçalara ayırmayın.
  2. Pankreası 24 saat boyunca% 10 paraformaldehitte sabitleyin, parafin içine gömün, 5 μm kalınlığında doku bölümlerini kesin ve boyama için cam slaytlara yerleştirin.
  3. Hematoksilin-eosin ve Masson'un üç renkli boyamasını daha önce bildirildiği gibi standart yöntemler kullanarak gerçekleştirin4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Safra kanalı infüzyon prosedürleri, bu prosedürle ilişkili fare mortalitesini azaltmak için optimize edilmiştir10. TNBS ilk olarak toplam 35 μL veya 50 μL hacimde verildi. TNBS'nin 50 μL'lik bir hacimde enjeksiyonu tüm pankreasa ulaşabilir ve daha homojen bir hastalık fenotipine neden olabilir (Şekil 1B). Ek olarak, 31G iğne ile insülin şırıngası kullanılarak TNBS enjeksiyonu, düzenli şırıngalara ve iğne boyutlarına göre infüzyon hızını daha iyi kontrol edebilir. Buz ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kronik pankreatit indükle etmek için TNBS'nin safra kanalı infüzyonu, farelerde teknik olarak zordur, çünkü farelerin% 22,5'i ilaç infüzyonunun 3-4 gün içinde ölebilir10. Burada, bu rapor önceki çalışmalara dayanarak prosedürü iyileştirdi ve erken fare ölüm oranını% <10'a düşürdü. Örneğin, artan ilaç hacmi (35 μL'den 50μL'ye kadar) ilaçların tüm pankreasa ulaşmasını sağlayabilir. Bir insülin şırıngası ve daha küçük bir iğne boyutu (31G) kullanmak, pankreas kanalına potansiyel hasarı ve safra keses...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Gazi İşleri Bakanlığı (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir # 1R01DK105183, DK120394 ve DK118529'dan HW'ye. Dr. Hongju Wu'ya teknik deneyimlerini paylaştığı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Nötr tamponlu formalin v / vFisher Scientific23426796
Alkol hazırlama pedleri, sterilFisher Scientific22-363-750
Hayvan Anestezi sistemiVetEquip, Inc.
Buprenorfin hidroklorür, enjeksiyonPar Steril Ürünler, LLCNDC 42023-179-05
Santrifüj tüpleri, 15 mLFisher Scientific0553859A
Etanol, mutlak (200 kanıt), moleküler biyoloji sınıfıFisher ScientificBP2818500
Ekstra ince Mikro Diseksiyon makası 4" düz keskinRoboz Cerrahi Enstrüman A.Ş.RS-5882
Graefe forseps 4" ekstra hassas uçRoboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5136
Isıtmalı pedAmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner İğne Tutucu 5.25"Roboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-7850
31 gauge iğneli insülin şırıngasıBD324909
İyot hazırlama pedleriFisher Scientific19-027048
İzofluranPiramal Yoğun BakımNDC 66794-017-25
Forseps uygulayan mikro klips 5.5"Roboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5410
Mikro klip, düz güçlü kavisli 1x6mmRoboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5433
Mikro klips, düz, 0.75mm klips genişliğiRoboz Cerrahi Alet A.Ş.RS-5420
Pikrilsülfonik asit çözeltisi, TNBS, H2OMillipore Sigma92822-1ML
Polipropilen Sütür 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
Polipropilen Sütür 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
Sodyum klorür, %0.9 intravenöz solüsyonVWR2B1322Q
Cerrahi örtü, sterilMed-Vet InternationalDR1826
Doku KasetiFisher Scientific22-272416
Von Frey filamentleriBiosebEB2-VFF
901806

Kaynaklar

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Safra Kanalı İnfüzyonuPankreatik FibrozisPankreatik İnflamasyonNöropatik AğrıPankreatik AtrofiCerrahi TeknikPankreatik İlaç Uygulaması
Safra Kanalı TNBS infüzyonu ile Kronik Pankreatit için Bir Fare Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.