Yöntem makalesi

Tip 2 Diyabette Bozulmuş Yara İyileşmesinde Anormal Gen Ekspresyonunu Tanımlamak için Cerrahi Dokular Üzerinde Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu

DOI:

10.3791/62091

⸱

13 Ocak 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Skin Sciences, University of Bradford, 2The Charles Institute of Dermatology, School of Medicine, University College Dublin, 3University of Baghdad

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknik, ex vivo yaraların açılması, lazer yakalama mikrodiseksiyonu yapılması ve klinik olarak ilgili insan dokusu kullanılarak diyabette zayıf yara iyileşme süreçleriyle ilgili gen ekspresyonundaki değişikliklerin ölçülmesi için bir kılavuz sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 2 diabetes mellitus (T2DM) küresel prevalansı hızlı bir şekilde artmaktadır. T2DM'li hastalar çok sayıda komplikasyondan muzdariptir ve bunlardan biri yara iyileşmesinin bozulmasıdır. Bu, iyileşmeyen yaraların veya ayak ülserlerinin gelişmesine ve nihayetinde amputasyona yol açabilir. Sağlıklı bireylerde yara iyileşmesi, iltihaplanma, proliferasyon ve yeniden şekillenmeyi kapsayan kontrollü ve örtüşen bir olaylar dizisini takip eder. T2DM'de bu adımlardan biri veya birkaçı işlevsiz hale gelir. T2DM'de bozulmuş yara iyileşmesini incelemek için mevcut modeller, yara iyileşmesini ve / veya potansiyel terapötik seçenekleri destekleyen moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro çizik yara tahlillerini, cilt eşdeğerlerini veya hayvan modellerini içerir. Bununla birlikte, bunlar T2DM hastalarında karmaşık yara iyileşme sürecini tam olarak özetlemez ve ex vivo insan derisi testleri, kötü iyileşeceği bilinen hastalardan punch biyopsi almanın etiği nedeniyle sorunludur. Burada, T2DM hastalarında (dis)fonksiyonel yara iyileşme yanıtında yer alan spesifik hücrelerin ekspresyon profillerinin, amputasyon veya elektif kozmetik cerrahi sonrası atılan fazla doku kullanılarak incelenebileceği bir teknik tanımlanmıştır. Bu protokolde, bağışlanan deri örnekleri toplanır, yaralanır, hava sıvı arayüzünde ex vivo olarak kültürlenir, farklı zaman noktalarında sabitlenir ve kesitlere ayrılır. Yara iyileşmesinde yer alan spesifik hücre tipleri (ör.epidermal keratinositler, dermal fibroblastlar (papiller ve retiküler), vaskülatür) lazer yakalama mikrodiseksiyonu ve dizileme veya mikrodizi ile analiz edilen gen ekspresyonundaki farklılıklar kullanılarak izole edilir ve ilgilenilen genler qPCR ile daha fazla doğrulanır. Bu protokol, diyabetli veya diyabetsiz hastalarda, ameliyattan sonra normal olarak atılan dokuyu kullanarak, hem kötü iyileşen hem de sağlam cilt arasındaki gen ekspresyonundaki doğal farklılıkları tanımlamak için kullanılabilir. T2DM kronik yaralarına ve alt ekstremite kaybına katkıda bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 2 diyabet insidansı, obezite salgını ve fiziksel hareketsizlik nedeniyle küresel olarak artmaktadır. Bu hastalarda kötü yara iyileşmesi yaygındır ve hastaların% 25'ine kadar kronik iyileşmeyen bir yara gelişir1. Bunu destekleyen mekanizmalar karmaşıktır ve tam olarak anlaşılmamıştır, bu da yeni terapötikler için keşif oranını sınırlar. Buna katkıda bulunan faktörlerden biri, tip 2 diyabet hastalarında yara iyileşmesini incelemek için uygun bir modelin olmamasıdır. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, kronik yara riski taşıyanlarda yara iyileşmesini incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir ex vivo model sağlamak ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini ilerletmek için transkriptomik analize izin vermektir.

Şu anda yara iyileşmesini incelemek için birden fazla model mevcuttur ve her birinin güçlü ve zayıf yönleri vardır. db / db fare2 veya streptozotosin ile indüklenen diyabetik sıçanlar3 gibi in vivo hayvan modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır; Bununla birlikte, kemirgen modellerindeki yaralar, insan vücudunda kullanılan mekanizmadan çok farklı olan kasılma yoluyla iyileşir ve klinik çalışmalarageçişte sınırlı başarıya sahiptir 4,5. İnsan dokusunu kullanmanın faydaları iyi bilinmektedir4, ancak zaten bozulmuş bir yara iyileşme tepkisini sürdürdüğü bilinen bireylere deneysel yaralar açmanın etiği ile karmaşıklaşmaktadır. Sonuç olarak, diyabetli insan denekler üzerinde yapılan çalışmalar, eksize edilmiş doku üzerinde deney yapmaktan ziyade daha yaygın olarak inflamatuar yanıta yöneliktir6. Çip üzerinde organ7 ve yapay cilt modelleri8 de mevcuttur. Bunlar, insan hücresi katkılarını analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak hastalar arası değişkenlik hakkında çok az gösterge verir. Bu nedenle, hassas hasta popülasyonlarında yara iyileşmesinin ilerlemesini incelemek için klinik olarak ilgili modeller, bu alandaki mekanik anlayışı ve ilaç keşfini hızlandırabilir.

Aşağıda açıklanan ex vivo yaralama protokolü Stojadinovic ve Tomic-Canic, 20139'dan uyarlanmıştır. İnsan doku örneklerinin ex vivo kontrollü yaralanmasından elde edilen transkripsiyonel verilerin incelenmesi için uygundur ve yara iyileşmesi kötü olan hastalardan (örneğin, tip 2 diyabet, yaşlı bireyler) alınan klinik örneklere uygulanabilir, böylece yara iyileşmesinin bu koşullarda nasıl etkilendiği ve potansiyel olarak nasıl restore edilebileceği hakkında bilgi edinmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan cerrahi dokusunun sağlanmasına dayanır. Deneyden önce etik onay ve bilgilendirilmiş hasta onayı alındı ve çalışma Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun hale geldi.

1. Doku toplanması ve ex vivo yaralama

  1. Uzuv amputasyonu/ameliyatını takiben cerrahi dokuyu %5 penisilin-streptomisin-fungizon, 2 mM L-glutamin ve %10 fetal sığır serumu (FBS; tam büyüme ortamı) içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) içeren steril bir kaba toplayın.
    NOT: Bu şekilde toplanan doku, deneyden önce 4 °C'de 24 saate kadar saklanabilir. Ex vivo deneyler için dokunun canlılığını sağlamak için, dokunun mümkün olan en kısa sürede işlenmesi veya çoklu doku bağışlarında deneyleri standartlaştırmak için toplama ve yaralama arasında sabit bir zaman aralığı bırakılması önerilir. Doku herhangi bir süre saklanacaksa, RNA bütünlüğünü korumak için numuneye bir RNA stabilizasyon solüsyonu eklenmelidir.
  2. Steril forseps kullanarak, dokuyu %5 penisilin-streptomisin-fungizon ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Steril bir neşter ve / veya cerrahi makas kullanarak dermisteki yağı kesin ve atın. Dokuyu steril PBS ile doldurulmuş taze bir petri kabına aktarın.
  3. İki steril bıçağı, iki bıçak arasında 1 mm boşluk olacak şekilde birbirine takın. Epidermisin uzunluğu ve papiller dermisin üst kısmı boyunca ~ 1 mm aralıklarla iki paralel doğrusal çizgi çizin10,11.
  4. Doğrusal bir yara oluşturmak için steril forseps ve cerrahi makas kullanarak skor çizgileri arasındaki epidermisi çıkarın.
  5. Dokuyu küçük dikdörtgenler halinde (maksimum 1 cm2 boyutunda) kesmek için bir neşter kullanın, her iki tarafta sağlam epidermis ile yarayı çevreleyin.
    NOT: Doku ve müteakip RNA bütünlüğünü korumak için, 1.2-1.5 adımları mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir.
  6. 4x büyütmede bir mikrodiseksiyon mikroskobu kullanarak yaralı dokunun bir görüntüsünü alın ve görüş alanının yaranın tamamını ve çevresindeki sağlam epidermal dokuyu yakaladığından emin olun.
  7. Steril forseps kullanarak, doku dikdörtgenlerini 6 oyuklu bir plakaya bir doku kültürü ekine yerleştirin ve 2 mL tam büyüme ortamını kuyucuğa nazikçe pipetleyin. Bu, numunenin sıvı-hava arayüzünde kültürlenmesini sağlayacaktır.
  8. 37 ° C'de% 5 CO2 içinde havada 120 saate kadar inkübe edin.
    NOT: Doku, inkübasyonun sonunda adım 1.6'daki ile aynı büyütmede bir mikrodiseksiyon mikroskobunda görüntülenmelidir. Gerekirse her 24 saatte bir görüntü de çekilebilir.

2. Doku fiksasyonu ve kriyoseksiyon

  1. Dokuyu sıvı nitrojen içinde dondurun. Bir kriyostat aynasına az miktarda kriyostat uyumlu kesme ortamı yerleştirin ve dokuyu içine gömün. Dokuyu aynaya dik olarak yönlendirin, böylece kesme yüzü yaralı alan da dahil olmak üzere cildin tüm katmanlarını kesecektir. -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
  2. Kriyostatı oda sıcaklığında %70 etanol ve RNase dekontaminasyon spreyi ile temizleyin. Kriyostat sıcaklığını -28 °C'ye ayarlayın.
  3. Mandren ve kriyostat bıçağının yönünün, yaralı doku ve alttaki dermis dahil olmak üzere dokunun tüm kalınlığını kapsayan bölümler üretip üretemeyeceğini kontrol edin.
  4. Kriyostatı kullanarak, her yaradan on adet 7 μm'lik kesit kesin ve RNA içermeyen mikrodiseksiyon slaytlarına yerleştirin.
  5. Slaytları, RNaz içermeyen bir ortam sağlamak için mikrodiseksiyon slaytlarının -80 ° C'de sağlandığı orijinal kutusunda saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir, ancak depolama süresi uzadıkça RNA bozulmasının artacağını unutmayın.

3. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu

  1. Mikrodiseksiyon slaytlarını doku bölümü ile birlikte kuru buza yerleştirin ve lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskop odasına gidin.
  2. 1. slaytı havayla kurutun ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu gerçekleştirmeden hemen önce RNaz içermeyen bir hematoksilen ve eozin boyama kiti kullanarak bölümleri hematoksilen ile boyamaya hızlı bir şekilde devam edin.
  3. 10x büyütmede lazer yakalamalı mikrodiseksiyon mikroskobu kullanarak yaralı dokuyu görselleştirin ve lazerle çekilecek ilgi alanının fotoğrafını çekin.
  4. Bu alanın etrafını (örneğin, epitel dili, granülasyon dokusu, mikrodamarlar) izleyin ve kullanılan özel mikroskop için yazılım talimatlarını kullanarak mikrodiseksiyon 0.5 mL difüzör izolasyon kapaklarında toplayın.
  5. Diseke edilen dokunun yerini ve tam eksizyonunu göstermek için 10x büyütmede lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskobunu kullanarak lazerle yakalanan ilgi alanını yeniden görselleştirin ve görüntüleyin.
    NOT: RNA bozulmasını en aza indirmek için maksimum 1 saat boyunca her numune için (10 bölüme kadar) lazer yakalama gerçekleştirin.
  6. Üreticinin talimatlarına göre mikrodiseke edilmiş dokuyu içeren tüpe RNA depolama tamponu ekleyin ve -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarılana kadar kuru buzda saklayın.
    NOT: Protokol burada geçici olarak duraklatılabilir.

4. Diferansiyel gen ekspresyonunun miktar tayini

  1. Numune tüplerini 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek mikrodiseke edilmiş dokudan RNA'yı izole edin.
  3. RNA'yı 12 μL RNaz içermeyen su nihai hacminde elute edin ve üreticinin talimatlarına göre bir RNA amplifikasyon kiti ve termal döngüleyici kullanarak RNA'yı amplifiye edin. Daha fazla analiz için yeterli RNA'yı sağlamak için iki tur amplifikasyon önerilir. Tablo 1'deki amplifikasyon koşullarını kullanın.
İlk amplifikasyon turuİkinci büyütme turu
İlk iplik senteziİlk iplik sentezi
AdımSıcaklıkSaatAdımSıcaklıkSaat
165 °C5 dk165 °C5 dk
24 °Ctutmak24 °Ctutmak
342 °C45 dk325 °C10 dk
44 °Ctutmak437 °C45 dk
537 °C20 dk54 °Ctutmak
695 °C5 dk
74 °Ctutmakİkinci iplikçik sentezi
AdımSıcaklıkSaat
İkinci iplikçik sentezi195 °C2 dk
AdımSıcaklıkSaat24 °Ctutmak
195 °C2 dk337 °C15
24 °Ctutmak470 °C5 dk
325 °C5 dk54 °Ctutmak
437 °C10 dk
570 °C5 dkİn vitro transkripsiyon
64 °CtutmakAdımSıcaklıkSaat
142 °C6 saat
İn vitro transkripsiyon24 °Ctutmak
AdımSıcaklıkSaat337 °C15 dk
142 °C3 saat44 °Ctutmak
24 °Ctutmak
337 °C15 dk
44 °Ctutmak

Tablo 1: Amplifikasyon koşulları.

  1. Amplifiye edilmiş RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını ölçün. A260/230 (saflık) ve A260/280 (kirleticiler) > 1.8 absorbans oranları daha fazla analiz için uygundur.
    NOT: Saflaştırılmış amplifiye edilmiş RNA, odaklanmış gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabilir (adım 4.5-4.6) veya mikrodizi analizi için gönderilebilir.
  2. Üreticinin talimatlarına göre yüksek kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Temsilci koşulları aşağıdaki gibidir:
    • esnasında 25 10 dk
    • 2 saat boyunca 37 °C
    • esnasında 85 °C 5 dk
    • 4 °C tutma
  3. Üreticinin talimatlarına göre 0.5 μL cDNA ve 1 μM primer (ilgilenilen genin) kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin. Temsili koşullar ve astar dizileri aşağıdaki gibidir.
    1. Kantitatif PCR koşulları için aşağıdaki koşulları kullanın: 10 dakika boyunca 95 °C; 15 saniye boyunca 95°C'de 40 döngü ve 1 dakika boyunca 62°C; 5 dakika boyunca 95 °C; ve 4 ° C tutun.
    2. Aşağıdaki astar dizilerini kullanın:
      GAPDH
      İleri 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Ters 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'

      KRT17 Serisi
      İleri 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Ters 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Verilerin yorumlanması

  1. ImageJ kullanarak adım 1.6-1.8'de oluşturulan ex vivo dokunun görüntülerini kullanarak yara iyileşme oranını hesaplayın. ImageJ 12,13,14'te yara alanlarının otomatik olarak nasıl analiz edileceğine dair farklı varyasyonları vurgulayan çok sayıda yeni yayın bulunmaktadır.
  2. ΔCT yöntemini kullanarak, ilgilenilen gen için eşik döngülerini temizlikçininkiyle karşılaştırarak gen ekspresyonunu ölçün (örneğin, gliseraldehit-3-fosfat; GAPDH). Bunu yapmak için, temizlikçi ve ilgilenilen gen için CT değerini not edin.
    1. Mevcut mRNA miktarını normalleştirmek ve farklı izolasyonlar arasındaki RNA ekstraksiyon konsantrasyonlarındaki farklılıkları kontrol etmek içiniki CT değeri arasındaki farkı hesaplayın:
      ΔCT = CT (ilgilenilen gen) - CT (temizlikçi)
    2. Temizlikçinin yüzdesi olarak ifade edilen, ilgilenilen genin nispi nicelleştirmesini vermek için CT değerleri arasındaki farkın büyüklüğünü hesaplayın:
      Bağıl nicelik ölçümü = (2-ΔCT) x 100
    3. Her örnek için ilgilenilen genlerin nispi niceliklerini karşılaştırarak farklı hasta donörleri / hastalık durumları arasındaki farkları inceleyin.
      NOT: Tüm tekniğin bir şeması Şekil 1'de bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün ardından, temsili sonuçlar elde etmek için 48 saatlik bir zaman noktası seçildi. Elektif kozmetik cerrahiden elde edilen fazla dokuda ilk yaranın oluşturulması, eksize edilen yaranın açıkça görülebildiği Şekil 2A'da görülebilir. Hematoksilen ve eozin boyama, bunun tam kalınlıkta bir yara oluşturduğunu doğrular (Şekil 2B). 48 saat sonra, yaranın kısmi kapanması ışık mikroskobu altında görülebilir (Şekil 2C). Histolojik boy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 2 diyabet gibi kronik bozuklukların görülme sıklığı küresel olarak arttıkça, patofizyolojik olarak ilgili çalışmaları kolaylaştırabilecek tekniklere olan ihtiyaç daha acil hale gelmektedir. Yukarıda açıklanan protokol, insan dokusunu kullanarak ex vivo iyileşen yaralardan elde edilen transkriptomik verileri incelemek için standart bir yöntem sağlar.

Bu protokol, ilgili otoriteden etik izin verilmiş fazla klinik dokunun ve bilgilendirilmiş onam ver...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP, Avrupa Komisyonu 7. Araştırma ve Teknik Geliştirme Çerçeve Programı - Marie Curie Yenilikçi Eğitim Ağları (ITN), Hibe sözleşmesi no.: 607886. tarafından desteklenmiştir. RW, Aveda, Hair Innovation & Technology, ABD tarafından desteklendi. RB ve SS, Bradford Üniversitesi Cilt Bilimleri Merkezi tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Arcturus RiboAmp PLUS kitiThermoFisher ScientificKIT0521RNA amplifikasyon kiti
Difüzör Kapakları 0.5 mLMMIK10028161Lazer yakalama mikrodiseksiyon kapakları; 50 paket
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD60461000 mg / L glikoz, L-glutamin ve sodyum bikarbonat içeren, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Scientific10270106Hücre kültürü takviyesi
H & E Boyama Kiti PlusMMIK10028305Rnaz içermeyen hematoksilen ve eozin boyama kiti
Yüksek kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kitiUygulamalı Biyosistemler4368814Ters transkripsiyon kiti
L-glutaminThermo Fisher Bilimsel25030149Hücre kültürü takviyesi
Membran SlaytlarıMMIK10028153Laer yakalama mikrodiseksiyon slaytları; Kutu başına 5
Netwell Mesh InsertCorning3479Hücre kültürü eki
Penisilin-Streptomisin-FungizoneThermo Fisher Scientific15070-063Hücre kültürü takviyesi
15290-026
OCTTissue-Tek Sakura4583Kriyostat uyumlu kesme ortamı
PBSThermo Fisher Scientific10209252100 ml steril su başına beş tablet ve daha sonra hücre kültürü kullanımı için otoklavlanmış
RNeasy Mikro KitiQiagen74004RNA ekstraksiyon kiti
RNase AwaySigma-Aldrich83931RNase spreyi
Steril bıçaklarBilimsel Laboratuvar MalzemeleriINS4974Doku diseksiyonu uygular
Destek SlaytıMMIK10028159Lazer yakalama mikrodiseksiyonu destek slaytı, RNaz içermeyen
Cerrahi makasBilimsel Laboratuvar MalzemeleriINS4860Doku diseksiyonu uygular
Cerrahi forsepsBilimsel Laboratuvar MalzemeleriINS2026Doku diseksiyonu uygular
SYBR Green SupermixUygulamalı Biyosistemler4344463 Kantitatif PCR mastermix

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gianino, E., Miller, C., Gilmore, J. Smart Wound Dressings for Diabetic Chronic Wounds. Bioengineering. 5 (3), Basel. (2018).
  2. Song, M., et al. Cryptotanshinone enhances wound healing in type 2 diabetes with modulatory effects on inflammation, angiogenesis and extracellular matrix remodelling. Pharmaceutical Biology. 58 (1), 845-853 (2020).
  3. Liu, J., et al. Involvement of miRNA203 in the proliferation of epidermal stem cells during the process of DM chronic wound healing through Wnt signal pathways. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 348(2020).
  4. Pastar, I., Wong, L. L., Egger, A. N., Tomic-Canic, M. Descriptive vs mechanistic scientific approach to study wound healing and its inhibition: Is there a value of translational research involving human subjects. Experimental Dermatology. 27 (5), 551-562 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Mirza, R. E., Fang, M. M., Weinheimer-Haus, E. M., Ennis, W. J., Koh, T. J. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice. Diabetes. 63 (3), 1103-1114 (2014).
  7. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  8. Yun, Y., Jung, Y. J., Choi, Y. J., Choi, J. S., Cho, Y. W. Artificial skin models for animal-free testing. Journal of Pharmaceutical Investigation. 48, 215-223 (2018).
  9. Stojadinovic, O., Tomic-Canic, M. Human ex vivo wound healing model. Methods in Molecular Biology. 1037, 255-264 (2013).
  10. Castellano-Pellicena, I., et al. Does blue light restore human epidermal barrier function via activation of Opsin during cutaneous wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 51 (4), 370-382 (2019).
  11. Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
  12. Castellano-Pellicena, I., Thornton, M. J. Isolation of epidermal keratinocytes from human skin: The scratch-wound assay for assessment of epidermal keratinocyte migration. Methods in Molecular Biology. 2154, 1-12 (2020).
  13. Suarez-Arnedo, A., et al. An imaje J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS ONE. 15 (7), 0232565(2020).
  14. Venter, C., Niesler, C. U. Rapid quantification of cellular proliferation and migration using ImageJ. Biotechniques. 66 (2), (2019).
  15. Al-Rikabi, A. H. A., Riches-Suman, K., Tobin, D. J., Thornton, M. J. A proinflammatory environment induces changes in the diabetic phenotype of human dermal fibroblasts derived from diabetic and nondiabetic donors: Implications for wound healing. Scientific Reports. , (2020).
  16. Chen, A., et al. Towards single-cell ionomics: a novel micro-scaled method for multi-element analysis of nanogram-sized biological samples. Plant Methods. 16, 31(2020).
  17. Lutz, B. M., Peng, J. Deep profiling of the aggregated proteome in Alzheimer's Disease: from pathology to disease mechanisms. Proteomes. 6 (4), 46(2018).
  18. Rinschen, M. M. Single glomerular proteomics: A novel tool for translational glomerular cell biology. Methods in Cell Biology. 154, 1-14 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ex Vivo CiltYara yile me ModelleriEpidermal KeratinositlerDermal FibroblastlarHava S v Aray z
Video yakında

İlgili makaleler