Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

DOI:

10.3791/62109

⸱

6 Temmuz 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinde güvenilir gen ekspresyon kontrolü, kullanılan yöntemden bağımsız olarak, yüksek katlama değişimi, düşük gürültü ve belirlenmiş giriş-çıkış transfer işlevlerine sahip aletler gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, optogenetik gen ekspresyon sistemleri, memeli hücrelerinde protein seviyelerinin mekansal zamansal kontrolü için son on yılda çok dikkat çekmiştir. Bununla birlikte, ışık kaynaklı gen ekspresyonunu kontrol eden mevcut devrelerin çoğu mimaride farklılık gösterir, plazmidlerden eksprese edilir ve değişken optogenetik ekipman kullanır, bu da kararlı hücre hatlarında optogenetik bileşenlerin karakterizasyonunu ve standardizasyonunu keşfetme ihtiyacı yaratır. Burada, çalışma, memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu kontrol etmek için güvenilir gen devresi yapımı, entegrasyonu ve karakterizasyonunun deneysel bir boru hattını sunarak, bir vaka örneği olarak negatif geri beslemeli optogenetik devre kullanmaktadır. Protokoller ayrıca, optogenetik ekipmanın ve ışık rejimlerinin standartlaştırılmasının, gen ekspresyon gürültüsü ve protein ekspresyon büyüklüğü gibi gen devresi özelliklerini nasıl güvenilir bir şekilde ortaya çıkarabileceğini göstermektedir. Son olarak, bu makale optogenetiğe aşina olmayan ve bu teknolojiyi benimsemek isteyen laboratuvarlar için yararlı olabilir. Burada tarif edilen boru hattı, memeli hücrelerindeki diğer optogenetik devreler için geçerli olmalı ve memeli hücrelerinde transkripsiyonel, proteomik ve nihayetinde fenotipik düzeyde gen ekspresyonunun daha güvenilir, ayrıntılı karakterizasyonuna ve kontrolüne izin vermelidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diğer mühendislik disiplinlerine benzer şekilde, sentetik biyoloji de protokolleri standartlaştırmayı ve biyolojik sistemlerle ilgili soruları araştırmak için yüksek oranda tekrarlanabilir işlevlere sahip araçların kullanılmasına izin vermeyi amaçlamaktadır1,2. Sentetik biyolojide birçok kontrol sisteminin inşa edildiği alanlardan biri de gen ekspresyon regülasyonu alanıdır3,4. Gen ekspresyon kontrolü, fizyolojik ve patolojik hücresel durumlardaki rolleri nedeniyle çok önemli hücresel özellikler olan hem protein seviyelerini hem de değişkenliği (gürültü veya varyasyon katsayısı, CV = σ / μ, ortalamanın standart sapması olarak ölçülür) hedefleyebilir5,6,7,8. Protein seviyelerini ve gürültüyü kontrol edebilen birçok sentetik sistem4,9,10,11,12 tasarlanmış ve araçlar arasında protokolleri standartlaştırmak için fırsatlar yaratılmıştır.

Son zamanlarda ortaya çıkan gen ağlarını kontrol edebilen yeni bir araç seti optogenetiktir ve gen ekspresyonunu kontrol etmek için ışığın kullanılmasını sağlar13,14,15,16,17. Kimyasal öncüllerine benzer şekilde, optogenetik gen devreleri, bakterilerden memelilere kadar herhangi bir hücre tipine sokulabilir ve ilgilenilen herhangi bir aşağı akış geninin ekspresyonuna izin verir18,19. Bununla birlikte, yeni optogenetik araçların hızlı bir şekilde üretilmesi nedeniyle, genetik devre mimarisinde, ekspresyon mekanizmasında (örneğin, plazmid bazlı ve viral entegrasyon) ve ışık sağlayan kontrol ekipmanlarında farklılık gösteren birçok sistem ortaya çıkmıştır11,16,20,21,22,23,24,25 . Bu nedenle, bu, gen devresi yapımı ve optimizasyonu, sistem kullanım yöntemi (örneğin, entegrasyon ve geçici ifade), indüksiyon için kullanılan deneysel araçlar ve sonuçların analizi gibi optogenetik özelliklerin standardizasyonu için yer bırakmaktadır.

Memeli hücrelerinde optogenetik protokollerin standartlaştırılmasında ilerleme kaydetmek için, bu protokol, örnek olarak HEK293 hücrelerine (insan embriyonik böbrek hücresi hattı) entegre edilmiş bir negatif geri besleme (NF) gen devresi kullanarak memeli hücrelerinde optogenetik sistemlerin mühendisliğini yapmak için deneysel bir boru hattını açıklamaktadır. NF, standardizasyonu göstermek için ideal bir sistemdir, çünkü doğada oldukça bol miktarda bulunur26,27,28, protein seviyelerinin ayarlanmasına ve gürültünün en aza indirilmesine izin verir. Kısacası, NF, bir baskılayıcı tarafından kendi ekspresyonunu yeterince hızlı bir şekilde azaltarak hassas gen ekspresyon kontrolüne izin verir, böylece herhangi bir değişikliği kararlı bir durumdan uzaklaştırır. Kararlı durum, her bir indükleyici konsantrasyonu için yeni bir kararlı duruma ulaşılana kadar daha fazla protein üretimine izin vermek için baskılayıcıyı inaktive eden veya ortadan kaldıran bir indükleyici tarafından değiştirilebilir. Son zamanlarda, gen ekspresyonunun geniş dinamik bir tepkisini üretebilen, düşük gürültüyü koruyabilen ve mekansal gen ekspresyon kontrolü potansiyeline izin veren ışık uyaranlarına cevap verebilen mühendislik ürünü bir NF optogenetik sistemi oluşturuldu11. Işık kaynaklı tunerler (LITers) olarak bilinen bu araçlar, canlı hücrelerde gen ekspresyon kontrolüne izin veren daha önceki sistemlerden esinlenmiştir4,10,29,30 ve uzun süreli gen ekspresyon kontrolünü sağlamak için insan hücre hatlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiştir.

Burada, LITer'i örnek olarak kullanarak, ışığa duyarlı gen devreleri oluşturmak, bir Işık Plakası Aparatı (LPA, bir optogenetik indüksiyon donanımı)31 ile gen ekspresyonunu indüklemek ve mühendislik yapılmış, optogenetik olarak kontrol edilebilir hücre hatlarının özel ışık uyaranlarına tepkilerini analiz etmek için bir protokol özetlenmiştir. Bu protokol, kullanıcıların keşfetmek istedikleri herhangi bir işlevsel gen için LITer araçlarını kullanmalarını sağlar. Ayrıca, aşağıda özetlenen yöntemleri ve optogenetik ekipmanı entegre ederek çeşitli devre mimarilerine (örneğin, olumlu geri bildirim, negatif düzenleme vb.) sahip diğer optogenetik sistemler için uyarlanabilir. Diğer sentetik biyoloji protokollerine benzer şekilde, burada özetlenen video kayıtları ve optogenetik protokoller, kanser biyolojisi, embriyonik gelişim ve doku farklılaşması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli alanlarda tek hücreli çalışmalarda uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gen devresi tasarımı

  1. Tek bir gen devresinde/plazmidinde birleştirilecek genetik bileşenleri seçin (örneğin; memeli DNA entegrasyon dizisi motifleri32, ışığa duyarlı elementler33 veya fonksiyonel genler34).
  2. Herhangi bir genetik mühendisliği ve/veya moleküler klonlama yazılımı kullanarak, DNA dizilerini daha sonra kullanmak ve referans almak üzere saklayın, her diziye açıklama ekleyin ve gerekli tüm özellikleri inceleyin (örneğin, START kodonları, düzenleyici veya çevrilmiş diziler)35.
  3. Genel gen devresi tasarımına göre parçaları geliştirin veya benimseyin36. Örnek olarak, LITers11'de olduğu gibi optogenetik baskılayıcılar için, ışığa bağlı bozunma37,38 veya bir baskılayıcının DNA bağlanma yeteneğinin39 inaktivasyonu yapabilen bir alan için kodlayan bir gen dizisini birleştirin, baskılayıcı genin bitişiğinde ve çerçevesinde, (örneğin, TetR)4.
    1. Optogenetik aktivatörler için, ışık kaynaklı DNA bağlanması üzerine gen ekspresyonunu destekleyen bir aktivatör alanının40 varlığından emin olun41. Negatif veya pozitif otoregülasyon için, regülatör genin promotörünün içinde veya yukarısında düzenleyici bir bağlayıcı bölgenin varlığından emin olun (örneğin, TetR'yi ifade eden promotörün içindeki veya yukarısındaki tetO siteleri)42.
  4. Her gen devresi için moleküler klonlama yazılımını kullanarak DNA dizisi amplifikasyonu veya plazmidin dizilimi için primerleri tasarlayın.
  5. Moleküler klonlama yazılımının yerleşik özellikleri (örneğin, dizi hizalaması) aracılığıyla plazmid yapımı için primerleri hesaplamalı olarak doğrulayın.
  6. Üreticiden oligonükleotid astarları sipariş edin. Bu çalışmada inşa edilen ve kullanılan plazmidler, tasarlanan ve kullanılan astarlarla birlikte orijinal destekleyici malzemede11 bulunabilir.
  7. Astarları çift damıtılmış suda (ddH2O) 100 mM stok konsantrasyonuna kadar seyreltin.
  8. PCR için 100 mM stok astarlarının stokunu 10 mM konsantrasyona seyreltin.
  9. PCR karışımını 1 μL ileri astar, 1 μL ters astar, genomik için toplam 0.5-500 ng kütleye 1 μL şablon DNA veya plazmid veya viral DNA için 0.5 pg-5 ng, 12.5 μL DNA polimeraz 2x ana karışımı (veya üreticinin seyreltme faktörünü karşılayan hacim) ve toplam 25 μL'lik reaksiyon hacmi için 9.5 μL ddH2O ile hazırlayın.
  10. PCR karışımını seçilen enzime bağlı olarak uygun ayarlarda bir termosikler içinde inkübe edin43. Önerilen reaksiyon döngüleri şunları içerir:
    Adım 1: 95 °C'de 30 s ilk denatürasyon adımının bir döngüsü.
    Adım 2: 98 °C'de 5 sn denatürasyon adımının 40 döngüsü.
    Adım 3: 65 ° C'de 30 sn'lik tavlama adımının bir döngüsü (daha önce tasarlanan astarlar tarafından belirlenir).
    Adım 4: 72 ° C'de 1 dakikalık bir uzatma döngüsü (~ 1 kilobase (kb) şablon parçası uzunluğu).
    Adım 5: 72 ° C'de 2 dakikalık bir uzatmanın bir döngüsü.
    Jel elektroforezi ile test edilene kadar reaksiyonu 4 ° C'de tutun. Bu protokol, kullanılan reaktiflere (örneğin, polimeraz ve tamponlar) bağlı olarak değişecektir.
  11. Lineer PCR ürünlerini tek bir dairesel DNA vektörüne bağlamak için gerekli olan bir DNA montaj reaksiyonunda kullanılacak tüm parçaları yükseltmek için adım 1.9'u tekrarlayın.
  12. PCR ürünlerini% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın, ardından istenen uzunluktaki bantları saflaştırın.
  13. Ana karışımı bir DNA montaj reaksiyonu için hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: Bu örnekte, ana vektör, genel montaj sonuçlarında önemli değişikliklere neden olmadan PCR adımlarının verimliliğini artırmak için iki parçaya ayrılmıştır.
  14. DNA montaj reaksiyonu ana karışımını 1 saat boyunca 50 ° C'de bir termosikler içinde inkübe edin (DNA montaj reaktif protokolünde aksi belirtilmedikçe) ve reaksiyon ürününü bakteriyel transformasyon için kullanmak üzere reaksiyonu 4 ° C'de saklayın.
  15. Yetkili E. coli (Escherichia coli) hücrelerini ve ilgili bakteriyel dönüşüm protokolünü kullanarak bakteriyel transformasyonu (kimyasal veya elektroporasyon) ayarlayın. Transformasyondan sonra, dönüşüm karışımını plakalamak için seçilen bakteriyel seçim belirtecini (örneğin, Ampisilin) içeren bakteriyel Luria-Bertani (LB) agar plakalarını kullanın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin44.
  16. Ertesi gün plakaları kontrol edin. Kolonileri aşılamak için, plakalardan bireysel kolonileri seçin ve bunları kültür tüplerinde karşılık gelen bakteri seçim belirteci ile sıvı bir LB suyunda yeniden askıya alın. Bir çalkalayıcı inkübatörde 37 ° C'de, gece boyunca 300 rpm'de inkübe edin.
  17. Plazmid DNA'sını bakteri kültüründen çıkarmak için plazmid hazırlama protokolünü gerçekleştirin.
  18. Devreyi iki adımda doğrulayın. İlk olarak, yaklaşık plazmid ürününün elde edilip edilmediğini görmek için kısıtlama enzimlerini ham doğrulama olarak kullanarak bir test sindirimi gerçekleştirin. İkincisi, test sindirimi geçilirse / onaylanırsa, plazmidi daha sonra tasarım yazılımında beklenen dizilimle karşılaştırmak üzere kesin DNA dizisini elde etmek için bir Sanger dizileme tesisine (veya mevcut ekipmanı kullanarak işleme) gönderin.
    1. Test sindirimini gerçekleştirmek için, kullanılan moleküler klonlama yazılımına dayanarak en az iki parça üreten en az iki kısıtlama enzimi seçin. Enzimler seçildikten sonra, kullanılan enzimlere bağlı olarak her enzimden 1 μL, üretilen DNA'nın 5 μL'si ve uygun tuzlar ve tamponlarla 13 μL su ekleyerek test örneklerini hazırlayın. Reaksiyonu 1 saat boyunca 37 ° C'de veya enzim üreticisinin önerdiği gibi inkübe edin. Test sindirim ürünlerini% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın ve bantların doğru olup olmadığını belirleyin.
      NOT: Bantlar doğruysa, sıralamaya geçin.
    2. Dizileme yapmak için, yazılımda depolanan DNA'ya dayalı primerler üretin, böylece primerlerin tavlama bölgeleri yaklaşık 500 bp (baz çiftleri) birbirinden ayrılır ve ilgilenilen parçayı (gen devresi bileşeni) veya tam plazmidi kapsar. Astarları saf nükleaz içermeyen su (NF-H2O) ile 10 mM konsantrasyona kadar seyreltin. 0,2 mL'lik bir tüpe 1 μL 10 ng / μL DNA, 1 μL astar ve 8 μL NF-H2O ekleyerek dizileme örneklerini hazırlayın. Bunu her astar için tekrarlayın.
      NOT: Numuneler hazırlandığında, bunları dizileme tesisine bırakın ve sonuçları moleküler klonlama yazılımı kullanarak plazmid dizisi ile karşılaştırın.
  19. Bu adımda, gen devrelerini içeren plazmidleri uygun hücre hattına entegre etmek için yaklaşık 100-1000 ng / μL DNA örneği üretin.

2. Kararlı hücre hattı mühendisliği

  1. Bir memeli ekspresyon vektöründen ilgilenilen proteinin yüksek düzeyde ekspresyonunu sağlayan kararlı alt çizgilerin hızlı bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış bir memeli hücre hattı sipariş edin. Hücre tipi ve hücre hattı mühendisliğinin kolaylığı, kullanıcıların neyi tercih ettiğine veya neyi başarmayı amaçladığına bağlı olarak değişebilir.
    1. Örneğin, kullanıcılar minimum ara adımlarla hücre hattı mühendisliğini tercih ederse, transkripsiyonel olarak aktif bir genomik lokusta tek bir kararlı entegrasyon bölgesi (örneğin, FRT) içeren hücreleri sıralayın. Daha nüanslı hücre mühendisliği tercih edilirse, CRISPR / Cas9 gibi genetik mühendisliği araçlarını kullanarak tercih edilen yerlerde entegrasyon siteleri oluşturun.
  2. 37 °C'de nemlendirilmiş havada %5 CO2 içinde hücre yetiştirin. Büyüme koşullarını hücre tipi için gerektiği gibi ayarlayın.
  3. Yukarıda tasarlanan gen devrelerini transfekte etmek istenen hücrelerden elde edilen önceki adımlarda kararlı bir hücre-hat üretim sürecine başlanır. Bunu başarmak için, uygun rekombinaz (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu için Flp-rekombinaz) veya elektroporasyon gibi diğer yöntemlerle gen devresi DNA'sının bir lipozom karışımını45 kullanın.
  4. Transfeksiyondan iki gün sonra, hücreleri% 25 akıcılığa bölün.
  5. Hücreleri parçaladıktan altı saat sonra, medyayı 50 μg / mL higromisin antibiyotik (veya plazmid yapımı sırasında seçilen memeli antibiyotik direnç genine karşılık gelen başka bir antibiyotik ajanı) içeren taze bir ortamla değiştirerek antibiyotik seçimine başlayın.
    NOT: Gen devresi yapımında kullanılan ve her biri farklı bir öldürme eğrisine sahip olan çeşitli memeli antibiyotik direnç genleri vardır. Bu nedenle, devre yapımı için hangi memeli antibiyotik direnç geni seçilirse seçilsin, ilgili hücrelerde uygun bir öldürme eğrisi çalışılmalıdır. Bu adım, gen devresi yükünü içeren hücrelerin zenginleştirilmesini sağlarken, sisteme sahip olmayanlar öldürülür.
  6. Hücrelerin antibiyotik seçim ortamında büyümesine izin verin, plaka veya şişe birkaç düzine odağa sahip olana kadar her 2-3 günde bir taze ortama geçin. Yapışkan kültürleri, birleşime ulaşmadan önce kütük aşamasındayken geçiş.
  7. Yeterince fazla odak olduğunda, hücreleri Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat olmadan Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 1 mL% 0.25 tripsin,% 0.1 EDTA ile% 0.1 EDTA ile birkaç dakika boyunca tripsinize edin. Tripsini taze ortamlarla nötralize edin ve tüm hücreleri taze bir kaba geçirin.
  8. Taze kaptaki hücreler% 80 -% 100 birleştiğinde,% 45 eski ortam,% 45 taze ortam ve% 10 DMSO karışımında dondurun. Kalan hücreleri steril bir tüpe aktarın ve monoklonal hücreleri 96 delikli bir plakaya izole etmek için tek hücreli sıralama yapın.
  9. Monoklonal sıralamadan yaklaşık 2-3 hafta sonra, 96 delikli plaka içindeki kuyucuklarda odaklar bulunmalıdır. Yaklaşık% 50 -% 60 birleştiğinde, hücreleri 12 delikli bir plakaya bölün.
  10. 12 delikli plaka% 80 -% 100 birleştiğinde, T-25 şişesi ile tedavi edilen bir doku kültürüne bölünür. T-25 şişesindeki hücreler% 80 -% 100 birleştiğinde, hücreleri dondurun ve monoklonal hücre hatlarının karakterizasyonu ve testi için bir geçiş sağlayın.
    1. Monoklonal hücre hatlarını, indüklenen floresan muhabir üretimine dayalı gen ekspresyon profillerini raporlamak için mikroskopi ve akış sitometri testleri ile karakterize edin. Floresan antikor etiketleme ve immünofloresan testi ile fonksiyonel protein üretimini doğrulayın. Transkripsiyonel seviyedeki gen ekspresyon indüksiyonunu kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile test edin. Klonların yerel ve tüm genom dizilimi yoluyla genetik dizilimi ve entegrasyon doğruluğunu doğrulayın.

3. Işık plakası aparatı indüksiyon tahlilleri

  1. Mühendislik hücrelerinin ışık indüksiyonu için kullanılacak bir LPA cihazı31,46 oluşturun. Kısaca, gen ekspresyonunu kontrol etmek için kullanılacak LPA'yı oluşturmak için birkaç geniş adım çok önemlidir. Bunlar arasında 3D baskı LPA çerçeve bileşenleri, devre kartı yapımı, mikrodenetleyici programcısı aracılığıyla devreyi programlama, bileşenleri son LPA'ya monte etme, hafıza kartını IRIS yazılımı ile programlama ve bitmiş cihazı kalibre etme sayılabilir. Daha kapsamlı bir açıklama için, yukarıdaki referanslara bakın.
    1. 3D parçaları Gerhardt et al. (2016 ve 2019) 31,46'da belirtildiği gibi yazdırın.
    2. Devre kartını Gerhardt et al. (2016 ve 2019) 31,46'da belirtildiği gibi monte edin.
    3. Ürün yazılımını, Gerhardt et al. (2016 ve 2019) 31,46'da belirtildiği gibi mikrodenetleyici programcısını kullanarak birleştirilmiş LPA devresine ekleyin.
    4. 3D baskılı parçaları ve monte edilmiş devre kartını Gerhardt et al. (2016 ve 2019) 31,46'da belirtildiği gibi birleştirin. Bu, montaj plakasını, devre kartını, LED (ışık yayan diyotlar) ara parçasını, plaka adaptörünü, 24 delikli bir plakayı, bir plaka kapağını, montaj cıvatalarını ve kanat somunlarını ve istifleme bileşenlerini filme alınan videoda ve Şekil 2'de gösterildiği gibi almayı içerir.
    5. Hafıza kartı programlaması ve cihazın kalibrasyonu için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
  2. Işık Plakası Aparatı (LPA)31 için bir SD kart programlamak ve bir optogenetik deneye başlamak için gereken uygun ışık koşullarını keşfetmek için Tabor Lab web sitesinde47 bulunan IRIS yazılımını kullanın.
    NOT: IRIS yazılımı, Tabor Lab tarafından geliştirilen LPA olarak bilinen optogenetik elektronik donanımı programlamak için web tabanlı bir uygulamadır. Yazılım, LPA donanımının her bir kuyucuğundaki bireysel ışık yayan diyotları (LED'ler) kontrol eden göreceli IRIS değerlerinin programlanmasına izin verir.
  3. LPA (4 x 6) açılır seçeneğini belirleyin ve ardından uygun aydınlatma yaklaşımını (Sabit Durum, Dinamik, Gelişmiş) tıklayın.
    NOT: Bu makale için, tüm tahliller kararlı durum örneklerine odaklanacaktır. Bununla birlikte, gelişmiş ayar örnekleri, darbe süreleri ve görev döngüsü rejimleri için kullanılabilir.
  4. Üst veya alt LED'lerin, plakanın kuyularına karşılık gelen hücrelere değerler girerek aydınlatılıp aydınlatılmayacağını seçin. Bu çalışmada kullanılan LPA'lar için tüm deneylerde üst konuma yerleştirilen mavi LED'ler kullanılmıştır. Her LED, bir kez programlandıktan sonra, sabit bir ışık yoğunluğu ile sürekli ışığa maruz kalma sağlayabilir. IRIS yazılımı, programlanabilen 4096 yoğunluk seviyesine izin verir.
  5. LED konumları seçildikten sonra, istenen deneysel anahat için yoğunluk değerlerini girin. Örneğin, plaka başına üç teknik kopya ile 8 farklı ışık yoğunluğu (veya darbe süreleri veya görev döngüsü) girin (Tablo 2). G.s., IRIS yazılımında LPA programlaması için kullanılan ışık yoğunluğu seviyesi ölçüm değerleri olan gri tonlamalı birimleri ifade eder.
    1. IRIS deney dosyalarını tasarlarken, LPA cihazındaki bitişik kuyucuklardan gelen kenar etkilerini, mavi ışığa maruz kalma yoğunluğunun artmasından kaynaklanan ışık toksisitesini ve istenen doz-yanıt türünü (örneğin, monotonik ve monotonik olmayan) belirlemeyi unutmayın.
    2. Kullanıcılar LPA'daki hücreleri belirli bir ışık parametresinin artan / azalan sırasına göre programlarsa (örneğin, yoğunluk), kuyular ışık çapraz konuşmasının kenar etkilerini veya hatta bitişik kuyuları etkileyebilecek ısıyı üretebilir. Bu, deneyler tamamlandığında ölçülen çıktıların sonucunu yanlışlıkla etkileyebilir. Bunu hafifletmek için, kullanıcılar kenar etkilerini en aza indirgeyerek kuyu konumlarını karıştırmak için IRIS yazılımında bir randomizasyon matrisi uygulayabilirler. Aşağıdaki Temsili Sonuçlar'da bir örnek açıklanmıştır (Şekil 4A-B).
    3. Ek olarak, mavi ışığın daha yüksek yoğunluklarının hücresel büyümeye ve canlılığa müdahale ettiği bulunmuştur48. Bu nedenle, ışık toksisitesini azaltmak için, araştırılan modaliteye bağlı olarak bir ışık yoğunluğu, darbe süresi veya görev döngüsü yanıt eğrisi üretmek önemlidir.
      1. Örneğin, 24 delikli plaka başına üç kopya ile 8 ışık yoğunluğu değerini, ışıksızlıktan LPA'nın maksimum yoğunluğuna kadar bir aralıkta programlayın. Daha sonra, bu örnekleri, her ışık değerinde popülasyon hücresi sağkalımını (ölü hücreler / hücresel enkaz dahil toplam olaylarla karşılaştırıldığında canlı hücreler) ölçmek için bir SSC-FSC kapısı veya propidium iyodür gibi canlı bir leke içeren bir akış sitometresinde çalıştırın.
      2. Daha sonra, deney düzeni için ideal popülasyon sağkalım miktarını belirleyin, çünkü herhangi bir uyaran proliferasyonu, gen ekspresyonunu veya hayatta kalmayı olumsuz yönde etkileyebilir (örneğin, uygun bir ödünleşim olarak% 80 hücre sağkalımını ayarlamak). Örneğin, bu çalışmada, kalibre edildikten sonra, yoğunluk 3000 g.s. birimini (LPA cihazının maksimum yoğunluğunun ~ 3/4'ü) geçmedi. Bunun bir örneği aşağıdaki Temsili Sonuçlar'da açıklanmıştır.
    4. Toksisite nedeniyle ışık değerlerini kısıtlamaya ek olarak, kullanıcılar monoton yanıtın aralığı gibi doz-yanıtın belirli bir bölümünü karakterize etmek için ışık değerlerini kısıtlamak isteyebilirler.
      1. Bunu başarmak için, başlangıçta, istenen doz-yanıtı belirlerken analiz edilen yönteme bağlı olarak çok çeşitli ışık yoğunluklarını, nabız sürelerini veya görev döngülerini tarayın (Tablo 2), örneğin gen ekspresyonunun monotonik bir doz-yanıt için artan ışık değerleriyle pozitif olarak ilişkili olduğu durumlarda.
      2. İlgilenilen ışık aralığını belirlemek için, birden fazla LPA'nın eşdeğer ışık miktarları sağlamak ve aşağıda özetlenen hücre kültürü çalışmalarına veya tahlillerine devam etmek için kalibre edilip edilmediğine bağlı olarak, farklı yoğunlukta / darbe süresinde / görev döngüsünde / vb. 24 kuyuya kadar veya daha fazla kuyucuk (örneğin, 48, 72, 96, vb.) Bu nedenle, istenen gen ekspresyonunu veren aralık aralığını belirlemek için geniş bir doz ışık uyaranı aralığına sahip bir optogenetik sistemin karakterizasyonuna başlayın ve daha sonra bu rafine doz aralığında deneyler yapın.
      3. Örneğin, bu çalışmada, bir kez 3000 g.s. birim toksik ışık yoğunluğu eşiği olarak belirlendi; Bu eşik, aşağıda özetlenen tahliller için ışığın üst sınırı olarak kullanılmıştır (örneğin, immünofloresan).
        NOT: Yukarıdaki adımlar, LPA'nın optik kalibrasyonundan bağımsızdır ve her optogenetik sistem için moleküler düzeyde kalibrasyona atıfta bulunur.
  6. IRIS'te uygun ışık yoğunluğu değerleri programlandıktan sonra, dosyaları indirmek ve aktarmak için USB 3.0 çıkışlı bir hafıza kartını LPA'ya takın.
  7. LPA'nın kalibrasyonu tamamlanırsa31, ışık indüksiyon testinin başlatılması için hücre kültürü çalışmasına geçin. Kalibrasyon yapılmadıysa, LPA mikrodenetleyici programcısı ile programlandıktan sonra bir Görüntü analiz yöntemi (adım 3.7.1-3.7.3) kullanarak LPA'yı kalibre edin.
    1. LPA'yı Gerhardt et al. (2016) 31 tarafından tanımlandığı gibi aynı IRIS seviyesine sahip olacak şekilde kısaca programlayın.
      NOT: Kalibrasyon için, LPA 2000 g.s. değerine sahip olacak şekilde programlanmıştır.
    2. Cihaz hafıza kartıyla programlandıktan ve sıfırlama düğmesine (LPA'daki fiziksel düğme) basıldıktan sonra, tüm cihazın bir görüntüsünü alın (örneğin, jel istasyon görüntüleyici, tarayıcı cihazı, vb.). Kalibrasyon için, cihaz 180° döndürülmüş olarak iki görüntü elde edin.
    3. Ardından, LPA plakasındaki LED yoğunluğundaki değişkenliği göstermek ve yoğunluğu kuyucuklar arasında eşit hale getirmek için LED kompanzasyon değerlerini hesaplamak için Gerhardt et al. (2016)31 tarafından tasarlanan açık kaynaklı yazılımı kullanın. Bunun bir örneği aşağıda temsil edilen sonuçlarda açıklanmıştır (Şekil 3). Bu kalibrasyon tamamlandıktan sonra, ışık indüksiyon testinin başlatılması için hücre kültürü çalışmasına geçin.
  8. Gen ekspresyonu üzerindeki ışık indüksiyon etkilerini araştırmak için önceki bölümden mühendislik monoklonal hücrelerinin şişelerini edinin.
  9. Eski medyayı şişeden çıkarın.
  10. Hücrelere 1 mL tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
  11. 5 dakika sonra, gerekli kimyasallarla desteklenmiş 4 mL Dulbecco modifiye Eagle ortamı (DMEM veya diğer istenen ortamlar) ekleyerek tripsini nötralize edin (bu çalışmada 50 μg / mL higromisin,% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi,% 10 fetal sığır serumu, FBS kullanılmıştır).
  12. Toplam 500 μL hacimde 24 delikli siyah bir plakaya kuyucuk başına ~ 75.000 hücre ekleyin. Tohumlanan hücrelerin sayısı, istenen deneyin süresine ve kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişebilir.
    NOT: Ek olarak, hücre tohumlama yoğunluğunun kültür bakımını ve potansiyel olarak deneyin süresini etkilediğini unutmayın. Kuyu başına daha az sayıda hücreden başlamak, kültürün akıcılığa ulaşmadan önce daha uzun zaman süreleri sağlar. Ayrıca, ilgilenilen gen devrelerine entegre edilen optogenetik bileşenlerin türü, gen ekspresyonunun kararlı bir duruma ulaşmasını etkileyecek ve bu nedenle deneylerin süresini etkileyecektir. Dikkate alınabilecek diğer faktörler hücre hattına özgü büyüme oranları, ortam bileşimi ve koşullu büyüme etkileridir (yani, ışık).
  13. Kaplamadan sonra, hücreleri 2-6 saat boyunca yerleşmelerini sağlamak için% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
  14. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir doku kültürü başlığına aktarın, plastik kapağı çıkarın ve plakanın üstüne yapışkan bir folyo şerit ekleyin (Şekil 2D). Bu adım, kuyuların üst ve yanları kaplandığı için kuyular arasında minimum ışık aktarımına izin verir ve ışık artık yalnızca LED'in yerleştirildiği kuyunun altından girebilir.
  15. Plakayı LPA'nın takılı 3B parçalarına yerleştirin. Ardından, plakayı, her köşedeki cihaz vidalarının üzerine oturan 3D baskılı LPA kapağıyla örtün.
  16. Cihazı güç kaynağına takın ve güncelleştirilmiş LPA deneme ayarlarının uygulandığından emin olmak için LPA cihazındaki sıfırlama düğmesine basın.
  17. Orijinal tohumlama yoğunluğuna, hücre hattına özgü büyüme hızına ve büyüme koşullarına bağlı olarak deney sistemi içindeki hücreleri uygun bir süre boyunca inkübe edin. Bu örnekte, hücre çizgileri, gen ekspresyonunun kararlı bir duruma ulaşması için sürekli olarak 3 gün boyunca indüklenmiştir. Bununla birlikte, birçok optogenetik sistemin (örneğin, VVD) kararlı durum gen ekspresyonuna çok daha erken (örneğin, 24 saat) ulaşabileceği ve bu nedenle deneysel indüksiyon sürelerinin gerektiğinde azaltılabileceği veya uzatılabileceği belirtilmelidir.
  18. Işık indüksiyon deneyinin sonunda, mühendislik hücre hatlarını karakterize etmek için aşağıdaki dört tahlilden herhangi biri için örnekleri kullanın (bölüm 4-7).

4. Işık kaynaklı mühendislik hücrelerinin floresan mikroskopisi

  1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, LPA'daki hücreleri inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü başlığına yerleştirin.
  2. Folyo şeridini çıkarın ve plakayı 1-2 dakika bekletin. Bu, hemen plakaya yerleştirilirse, plastik kapak üzerinde yoğuşmanın oluşmasını önler.
  3. 1-2 dakika oturduktan sonra, orijinal plastik kapağı tekrar tabağa koyun.
  4. Hücreleri uygun faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile görüntüleyin.
  5. Cihaza bağlı olarak, pozlama süresini, ışık kaynağı yoğunluğunu ve mühendislik hücrelerini görüntülemek için kazancı ayarlayın. Bu deneyde, aşağıdaki parametreler uygulanmıştır: FITC/GFP (yeşil floresan proteini) ışık kaynağına maruz kalma süresi için 50 ms ve her biri için% 100 yoğunlukta faz-kontrast maruz kalma süresi için 1-5 ms.
    NOT: Optimal maruz kalma sürelerinin, kazanç seviyelerinin ve ışık kaynağı yoğunluklarının, floresan muhabirindeki aşırı doygunluğu en aza indirmek, hücresel hasarı en aza indirmek ve nitel ve nicel analiz için yeterli görüntüleri yakalamak için genellikle bu çalışmanın deneyiminden ampirik olarak türetildiğine dikkat edilmelidir. Bu parametrelerin her birinin seviyelerini belirlerken, akılda tutulması gereken hususlar, sinyal-gürültü oranlarını en üst düzeye çıkarmak, fototoksisiteyi en aza indirmek, floresan sinyallerinin aşırı doygunluğunu en aza indirmek ve zayıf floresan sinyallerini yükseltme yeteneğini arttırmayı içerir.
    1. Bu parametreleri büyük ölçüde geçici olarak optimize edin; Bununla birlikte, önceki deneysel değerler (örneğin, floresan muhabirinin aşırı doygunluğuna neden olan ışık kaynağı yoğunluğu), uygun olduğunda gelecekteki deneysel ayarlara rehberlik edebilir. Örneğin, bir devreden (LITer1.0) veya deney kurulumundan (örneğin, ışık yoğunluğu) kazanç ayarları, maruz kalma süreleri ve ışık yoğunluğu başlangıç değerleri, benzer ancak farklı bir gen devresine (LITer2.0) 11 veya farklı bir ışık modalitesine (örneğin, hafif hizmet döngüsü) geçerken başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
  6. Mikroskopi yazılımına programlanmış bir koordinat şablonuyla plaka görüntülemeyi kolaylaştırın, böylece tüm plaka boyutu (örneğin, 24 kuyu) kuyu başına birden fazla görüntü konumundan otomatik görüntü alımına sahip olun.

5. Işık kaynaklı mühendislik hücrelerinin akış sitometrisi

  1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
  2. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakanın bir veya iki dakika oturmasını bekleyin.
  3. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
  4. Her bir oyuğa 100 μL% 0.25 tripsin ekleyin, plakayı plastik bir kapakla örtün ve inkübatöre geri yerleştirin.
  5. Hücreleri inkübatörde 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
  6. 5 dakika sonra, plakayı çıkarın ve doku kültürü başlığına geri koyun.
  7. Her tripsinizli her birini 400 μL DMEM ile iyice nötralize edin.
  8. 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpü, hücre süzgeci (veya tamamen tripsinize edilmemiş büyük hücre kümelerini çıkarmak için filtrelenebilen uygun akış sitometri tüpü) ile her bir kuyucuğa karşılık gelen bir adla etiketleyin.
  9. Hücre kümelerini kırmak ve akış sitometrisi için tek hücreli numuneler oluşturmak üzere her bir kuyucuğun içeriğini 6-8 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipet kullanın49.
  10. Her bir kuyucuğun tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçle etiketli tüplere aktarın.
  11. Hücreleri doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
    NOT: Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi, üniversite hastanesinde bulunan çekirdek bir tesisin parçasıydı.
  12. Akış sitometrisi yazılımındaki kalıntıları ve hücresel kümeleri dışlamak için uygun boyut ve ayrıntı düzeyindeki tek hücreleri yakalamak için bir ileri ve yan saçılma kapısı (sırasıyla FSC ve SSC) oluşturun.
  13. Kapı ayarlandıktan sonra, uygun kapıyla yaklaşık 10.000 hücreyi yakalayın. Bu sayıyı, kullanıcıların aradığı hücresel veri miktarına bağlı olarak ayarlayın. Deneydeki hücreleri içeren her tüp için tekrarlayın.
  14. Deney tamamlandıktan sonra, verileri analiz için mevcut akış sitometrisi veri yazılımına aktarın.
  15. Bir FSC-SSC kapısı oluşturun (edinme sırasında daha önce olduğu gibi) ve bunu her deneysel veri grubuna uygulayın. Bu makalede bu kapıyı oluşturmak için indüklenmemiş hücre popülasyonunun bir referans kuyusu kullanılmıştır, ancak yoğunluğa dayalı kapılar gibi kapı oluşturma için başka metrikler de mevcuttur.
  16. FSC-SSC kapısı ile çevrili deneysel koşullarla, akış sitometrisi verilerini histogram olarak çizin veya elde edilen ekspresyon modellerini göstermek için başka şekillerde temsil edin. Bu deneyde, floresan GFP / FITC veya PE / TexasRed kanalları tarafından yakalandı.

6. RNA ekstraksiyonu ve gen devresi bileşenlerinin kantitatif PCR'si

  1. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
  2. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakayı bir veya iki dakika bekletin.
  3. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
  4. Uygun RNA ekstraksiyon kitini kullanarak hücrelerden RNA çıkarmaya devam edin.
  5. RNA ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, her numunenin ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin (Tablo 3).
  6. Ayrıca, her numunenin kantitatif PCR'sini gerçekleştirin (Tablo 4). PCR reaksiyonlarını ayarlamak için bir DNA polimeraz ve ilişkili protokol kullanın. Bu adım için, bir temizlik geni ve ilgilenilen bir gen ile çoklanmış bir reaksiyon oluşturun veya ayrı reaksiyonlar oluşturun. Bu örnekte, GFP, KRAS ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) seviyeleri araştırılmıştır. qRT-PCR deneyini tamamladıktan sonra, RNA seviyesindeki gen devresi kıvrım değişimini göstermek için mevcut yazılım aracılığıyla analize devam edin.

7. Gen devre bileşenlerinin immünofloresansı

  1. Metanolü soğutmak için bir buz banyosu veya dondurucu kullanın.
  2. İndüksiyondan 24-72 saat sonra, hücreleri inkübatördeki LPA'dan veya görüntülemeden sonra mikroskoptan çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin.
  3. Doğrudan LPA'dan çıkarılırsa, folyo şeridini çıkarın ve plakayı 1-2 dakika bekletin.
  4. Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin (tüm kuyular kullanılıyorsa tüm 24 delikli plakadan).
  5. Her bir oyuğa 100 μL% 0.25 tripsin ekleyin, plakayı plastik bir kapakla örtün ve inkübatöre geri yerleştirin.
  6. Hücreleri inkübatörde 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
  7. 5 dakika sonra, plakayı çıkarın ve doku kültürü başlığına geri koyun.
  8. Her tripsinizli her birini 400 μL DMEM ile iyice nötralize edin.
  9. Mini santrifüj tüplerini her bir kuyucuğa karşılık gelen isimlerle etiketleyin.
  10. Bir P1000 pipet kullanın ve hücre kümelerini kırmak için her bir kuyucuğun içeriğini 6-8 kez yukarı ve aşağı pipet kullanın.
  11. Her bir kuyucuğun tüm içeriğini (~ 500 μL) etiketli tüplere aktarın.
  12. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  13. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
  14. 750-1000 μL% 4 paraformaldehit (fosfat tamponlu salin, PBS ile seyreltilmiş) içinde hücreleri yeniden askıya alın (hücre kümelerini kırmak için her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ve pipet kullanın).
  15. Hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika oturmasına izin verin.
  16. Kuluçkadan sonra, 750-1000 μL PBS ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
  17. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  18. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
  19. 750-1000 μL buz gibi soğuk metanol içinde hücreleri yeniden askıya alın (hücre kümelerini kırmak için her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ve pipet kullanın).
  20. Hücrelerin buz üzerinde veya -20 ° C'lik bir dondurucuda 30 dakika oturmasına izin verin.
  21. Kuluçkadan sonra, 750-1000 μL PBS ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
  22. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  23. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
  24. Kullanılan antikorların türüne bağlı olarak, protokolü bu noktadan itibaren değiştirin. 7.24.1-7.24.14 veya 7.24.15-7.24.22 adımlarından birini izleyin.
    1. Birincil ve ikincil bir antikor kullanıyorsanız, 100 μL primer antikordaki hücre kümelerini kırmak için her tüpte bir P1000 / P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Bu durumda, KRAS antikoru veya ERK antikoru da dahil olmak üzere stok antikorları için 1:800'lük bir seyreltme yapıldı ve oda sıcaklığında 1 saat oturmasına izin verildi. Antikorlar, 0.5 g BSA ile 1x PBS'den yapılmış bir inkübasyon tamponunda seyreltildi.
      NOT: İlgilenilen antijene karşı standart bir antikor seyreltme eğrisi oluşturarak antikorun tam seyreltmesini ampirik olarak belirleyin.
    2. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    3. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    4. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    5. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
    6. 100 μL sekonder antikordaki hücre kümelerini kırmak için bir P1000/P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın. Bu durumda, hücreler KRAS antikoru için 1:800 veya ERK antikoru için 1:2000 seyreltmede 100 μL sekonder antikorda yeniden askıya alındı ve oda sıcaklığında 30 dakika oturmalarına izin verildi. Birincil antikorlara benzer şekilde, inkübasyon tamponundaki ikincil antikorları yukarıda açıklandığı gibi seyreltin. Standart bir eğrinin ampirik bulgularına dayanarak ikincil antikorların seyreltmelerini belirleyin.
    7. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    8. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    9. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. Tamamlandığında, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
    11. 500 μL PBS'deki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
    12. Her tüpün tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçlerle etiketli tüplere aktarın.
    13. Hücreleri, doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
      NOT: Birkaç kontrole sahip olmanın, akış sitometrisi ölçümü ve mühendislik hücre gen ekspresyonunun analizi ile ilerlemek için önemli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, tamamen lekesiz hücrelere sahip olmak, yalnızca birincil antikor ile boyanmış hücreler ve yalnızca ikincil antikor ile boyanmış hücreler, sonuçları antikorlardan gelen arka plan sinyalleri ile karşılaştırmak için yararlı olabilir.
    14. Ardından, bölüm 5'te açıklandığı gibi analize devam edin.
    15. Sadece birincil bir antikor kullanıyorsanız, 100 μL etiketli primer antikor içindeki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 / P200 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Uygun antikor seyreltmesini belirleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Standart eğriden antikor seyreltmesini ampirik olarak belirleyin.
    16. Antikor ekledikten sonra, etiketli antikorlar üzerindeki ışık etkilerini önlemek için tüpleri bir folyo ile örtün.
    17. Kuluçkadan sonra, inkübasyon tamponunun 750-1000 μL'sini ekleyin. Pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru yapın.
    18. Hücreleri 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    19. 500 μL PBS'deki hücre kümelerini kırmak için bir P1000 pipet ve pipet kullanarak hücreleri her tüpte 6-8 kez yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
    20. Her tüpün tüm içeriğini (~ 500 μL) süzgeçli etiketli tüplere aktarın.
    21. Hücreleri, doğru dalga boylarındaki lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin (buzda veya buzda hücrelere sahip tüpleri getirebilir).
      NOT: Birkaç kontrole sahip olmanın, akış sitometrisi ölçümü ve mühendislik hücre gen ekspresyonunun analizi ile ilerlemek için önemli olduğu unutulmamalıdır. Tamamen lekesiz hücrelere ve tek başına birincil antikor ile boyanmış hücrelere sahip olmak, sonuçları antikorlardan gelen arka plan sinyalleriyle karşılaştırmak için yararlıdır.
    22. Bu noktadan sonra, bölüm 5'te açıklandığı gibi analize devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede yer alan gen devresi montajı ve kararlı hücre hattı üretimi, transkripsiyonel olarak aktif, tek kararlı FRT bölgesi içeren ticari, modifiye HEK-293 hücrelerine dayanmaktadır (Şekil 1). Gen devreleri, plazmid içinde FRT bölgelerine sahip vektörler halinde inşa edildi ve HEK-293 hücre genomuna Flp-FRT entegrasyonuna izin verdi. Bu yaklaşım Flp-In hücreleriyle sınırlı değildir, çünkü FRT siteleri, CRISPR / Cas950 gibi DNA düzenleme teknolojisi kullanılarak ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin okuyucuları, optogenetik gen devrelerini (ve diğer gen ekspresyon sistemlerini) karakterize etmek için hayati önem taşıyan adımlar hakkında fikir edinebilirler: 1) gen devresi tasarımı, yapımı ve doğrulanması; 2) gen devrelerini kararlı hücre hatlarına sokmak için hücre mühendisliği (örneğin, Flp-FRT rekombinasyonu); 3) mühendislik hücrelerinin LPA gibi ışık tabanlı bir platformla indüklenmesi; 4) floresan mikroskopi ile ışık indüksiyon tahlillerinin ilk karakterizasyonu; ve 5) akış sitometrisi, kantitatif g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yorum ve önerileriniz için Balázsi laboratuvarına, ilk LPA'yı oluşturmamıza yardımcı oldukları için Dr. Karl P. Gerhardt ve Dr. Jeffrey J. Tabor'a ve LOV2-degron plazmidlerini paylaştıkları için Dr. Wilfried Weber'e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R35 GM122561 ve T32 GM008444]; Laufer Fiziksel ve Kantitatif Biyoloji Merkezi; ve Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu. Açık erişim ücreti için finansman: NIH [R35 GM122561].

Yazar katkıları: M.T.G. ve G.B. projeyi tasarladı. M.T.G., D.C. ve L.G. deneyleri gerçekleştirdi. M.T.G., D.C., L.G. ve G.B. verileri analiz etmiş ve makaleyi hazırlamıştır. G.B. ve M.T.G. projeyi denetledi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 mL PCR tüpleri PCREppendorf951010006reaktifi
%0.25 Tripsin EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CImemeli hücrelerinin ayrılması ve hasat edilmesi için
reaktif 0.5-10 μ L Ayarlanabilir Hacimli PipetEppendorf3123000020pipetleme reaksiyonları için kullanılan alet
; L Ayarlanabilir Hacimli Pipetpipetleme reaksiyonları için kullanılanEppendorf
aleti; L Ayarlanabilir Hacimli PipetEppendorf3123000055pipetleme reaksiyonları için kullanılan alet
; L Ayarlanabilir Hacimli PipetEppendorf3123000039pipetleme reaksiyonları için kullanılan
alet 5 mL Polisten Yuvarlak Tabanlı Tüp, Hücre Süzgeç Kapaklısitometrisi içinCorning352235
5702R Santrifüj, 4 x 100 Rotorlu, 15 ve 50 mL Adaptörlü, 120 VEppendorfmemelikültürü çalışmaları için 22628113 ekipman
AgaroseDenville BilimselGR140-500jel elektroforezi için reaktif
96 oyuklu Plakalar için Alüminyum FolyolarVWR®60941-126ışık indüksiyonu deneylerinde plakaları kaplamak için kullanılan alet
plazmidli bakterileri seçmek içinampisilinSigma AldrichA9518-5G
Analog girdap karıştırıcıThermo Fisher Scientific02215365PRPCR, transformasyon veya jel ekstraksiyon reaksiyonlarını taşımak için araç
Bacto Susuz AgarFisher ScientificDF0140010reaktifi büyüyen bakteriler
BD LSRAriaBD656700tasarlanmış hücre hatlarını monoklonal popülasyonlara ayırmak için araç
BD LSRFortessaBD649225tasarlanmış hücre hatlarını karakterize etmek için araç
BSA, Sığır Serum AlbüminDevlet Bilimsel KaynakIF inkübasyon tamponu
için SIGA4919-1G reaktifiHücre Kültürü Plakası 12 kuyulu, Şeffaf, kapaklı düz tabanlı, polistiren, pirojenik olmayan, standart-TCMonoklonal hücreleri büyütmek için kullanılanCorning353043
Memelihücre kültürü içinVWR22628113
Kimyasal davlumbazN/AN/AIF reaksiyonlarını gerçekleştirmek için alet
Şeffaf Hücre Kültürü Plakası 24 kuyulu düz tabanlı kapaklıBD353047monoklonal hücreleri büyütmek için kullanılan plaka
CytoOne T25 filtre kapağı TC şişesiUSA ScientificCC7682-4825memeli hücrelerini büyütmek için kap
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fischer ScientificBP231-100reaktifi, tasarlanmış memeli hücrelerini dondurmak için kullanılır
elektroforezi içinEtidyum BromürThermo Fisher Scientific15-585-011
Falcon 96 İyi Şeffaf Düz Tabanlı TC ile İşlenmiş Kültür Mikroplakası, KapaklıSıralanmış monoklonal hücreleri büyütmek içinCorning353072
FCS ExpressDe Novo Yazılımı:Akış sitometrisi verilerini karakterize etmek içinN/A
Fetal Sığır Serumu , Düzenli, USDA 500 mLmemeli hücreleri
için Corning 35-010-CV reaktifiŞeffaf Kapaklı Fisherbrand Petri Kapları - Yükseltilmiş sırt; 100 x 15 mmFisher Scientificbakteriyetiştirme ekipmanları
FB0875712 Gibco  DMEM, Yüksek GlikozluThermo Fisher Scientific11-965-092memeli hücrelerini büyütmek için reaktif
Hs00932330_m1 KRAS izoformu bir Taqman Gen Ekspresyon TestiYaşam Teknolojileri4331182qPCR Probu
Higromisin B (50 mg/mL), 20 mLYaşam TeknolojileriUygun gen devresi entegrasyonuna sahip hücreleri seçmek için10687-010
iScript Ters Transkripsiyon Süper KarışımıBio-Rad LaboratoriesRNA'yıcDNA'ya dönüştürmek için 1708890 reaktifi
Laboratuvar Dondurucu -20 derece CVWR76210-392deneysel reaktifleri depolamak için ekipman
Laboratuvar Dondurucu -80 derece CPanasonicMDF-U74VCdeneysel reaktifleri depolamak için ekipman
Laboratuvar Buzdolabı +4 & derece; CVWR76359-220deneysel reaktifleri depolamak için ekipman
LB Broth (Lennox), 1 kgSigma-AldrichL3022-250Gbakteri yetiştirmek için reaktif
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008gen devrelerini memeli hücrelerine dönüştürmek için reagemt
MATLAB 2019MathWorksN/Ayazılımı
MetanolAcros Organics413775000immünofloresan reaksiyonu için reaktif
Mikrosantrifüj Tüpleri, Polipropilen 1.7 mLVWR20170-333plastik eşya kabı
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gen Ekspresyon TestiYaşam Teknolojileri4331182qPCR Probu
MultiTherm ShakerBenchmark BakteriyelH5000-HCekipmanı dönüşüm
NanoDrop Lite SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-NDL-US-CANDNA / RNA konsantrasyon ölçümü için ekipman
NEB Q5 Yüksek Sadakatli DNA polimeraz 2x Master MixNEBM0492Sgen devresi parçalarının PCR'si için reaktif
NEB10-beta Yetkin E. coli (Yüksek Verimlilik)New England Biolabs (NEB)C3019Hgen devresini yükseltmek için bakteri hücreleri ilgi çekici
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lgen devresi fragementlerini birleştirmek için reaktif
Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskop ile DS-Qi2 kameraNikon Instruments Inc.Gen ekspresyonunu ölçmek içinN/A
: NIS-Elements,Nikon Instruments, Inc.Floresan mikroskobu veri oligonükleotidlerini karakterize etmek için N/A
Gen devresi bileşenlerinin PCR'si için kullanılanIDTN/A
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Serisi CO2 UV ve H2O<>sub2 KontrolüMemelihücreleri
için Panasonic MCO-170AICUVHL-PA cihazıParaformaldehit, %16 Elektron Mikroskobu Sınıf ElektronMikroskobu Bilimleri15710-Sreaktifi
PBS, Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1x)invitrojen14190144reaktifi, IF inkübasyon tamponu için reaktif
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL), büyüyenhücreleri
primer ERK antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi4370Sprimer ERK antikoru
primer KRAS antikoruSigma-AldrichWH0003845M1immünfloresan için primer KRAS antikoru
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)Qiagen27106gen devresi plazmitlerini saflaştırmak için reaktif kiti
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (50)Qiagen28704gen devresi parçalarını saflaştırmak için reaktif kiti
QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR SistemiqRT-PCREppendorfA28137
RNA/cDNA amplificaiton RNeasyThermo Fisher ScientificN/A
Tasarlanmış memeli hücrelerinin RNA'sını çıkarmak içinQiagen74134
İkincil ERK antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi8889Simmünfloresan için ikincil ERK antikoru
ikincil KRAS antikoruInvitrogenA11005immünfloresan için ikincil KRAS antikoru
Serolojik Pipetler 5.0 mLOlympus Plastics12-102çeşitli kimyasal reaksiyonları oluşturmak için kullanılan reaktifler
SmartView Pro Görüntüleyici SistemiBüyük BilimUVCI-1200doğru PCR bantlarını görüntülemek için araç
SnapGene Viewer (ücretsiz) veya SnapGeneSnapGeneN/Ayazılımı DNA dizisi tasarımı ve analizi
Sahne üstü inkübatörTokai HitPCR, transformasyon veya jel ekstraksiyon reaksiyonlarını taşımak içinINU-TIZ
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo FisherGen devresi parçalarının PCR'si için bilimsel 4444557 reaktifi
TaqMan İnsan GAPD (GAPDH) Endojen Kontrol (VIC/MGB probu), primer sınırlı, 2500 rxnYaşam Teknolojileri4326317EqPCR Probu
ThermocyclerPCR, transformasyon veya jel ekstraksiyon reaksiyonlarını taşımak içinBio-Rad1851148
VisiPlate-24 Siyah, Siyah Şeffaf Tabanlı, Steril ve Doku Kültürü İşlem Görmüş 24 Kuyulu MikroplakaPerkinElmer1450-605plakası deneyler
VWR Tek Kullanımlık Pastör Pipetleri, Cam, Borosilikat Cam Pipet, Kısa Uç, Kapasite=2 mL, Toplam Uzunluk=14,6 cmMemeli hücre kültürü içinVWR14673-010
VWR Mini Yatay Elektroforez Sistemleri, Mini10 Jel SistemiVWR89032-290DNA jel elektroforezi için ekipman
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007FRT ile tasarlanmış hücre hattı site
gerçekleştirmek için 100-1000 &mu 20-200 &mu 3123000039 2-20 & mu Akış reaktifiDoğru reaktifi plakasısantrifüj aletiJel reaktifi kabı yazılımı Büyüyen reaktifi için bilimsel cihazı yazılımı reaktifiMemeli hücre kültürü için memeli için 100x Fisher Scientific 15140-122 reaktifi İmmünfloresan için Bağıl Miktar Tayin Uygulaması için ekipmanıPlus Mini Kitini ölçmek için yazılımı kiti aracı aracı Işık indüksiyonu için kullanılan reaktifi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetic Gene CircuitsMammalian CellsGene Expression ControlLight Inducible ExpressionStable Cell LinesFlow CytometryFluorescence MicroscopyNegative Feedback CircuitGene Expression NoiseProtein Expression Quantification

İlgili makaleler