Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Restriksiyon endonükleazları (REazlar), DNA'da diziye özgü çift iplikçik kırılmalarını etkileyen enzimlerdir. 1970'lerde REazların keşfi, rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesine yol açmıştır ve bu enzimler artık genetik modifikasyon ve manipülasyon için vazgeçilmez laboratuvar araçlarıdır¹. Tip II REazlar, DNA'yı tanıma dizileri içinde veya yakınında sabit bir yerde parçaladıkları için bu sınıfta en yaygın kullanılan enzimlerdir. Bununla birlikte, Tip II REazlar arasında çok fazla varyasyon vardır ve evrimsel ilişkilerine göre sınıflandırılmak yerine belirli enzimatik özelliklere dayalı olarak birkaç alt tipe ayrılırlar. Her bir alt tip arasında, sınıflandırma şemasında sık sık istisnalar vardır ve birçok enzim birden fazla alt tipe^{aittir 2}. Binlerce Tip II REaz tanımlanmıştır ve yüzlercesi ticari olarak temin edilebilir.

Bununla birlikte, Tip II REazlar arasındaki çeşitliliğe rağmen, çok az REase ayrıntılı olarak incelenmiştir. 1975 yılında Sir Richard Roberts tarafından kurulan rebase enzim veri tabanı REBASE'e göre,^bu enzimlerin 20'den azı için yayınlanmış kinetik veriler mevcuttur. Ayrıca, bazı REazlar, tanıma dizileri ^4,5,6,7 ile karşılaşmadan ve bağlanmadan önce DNA boyunca yayılırken doğrudan tek molekül düzeyinde gözlemlenmiş olsa da, bölünme reaksiyonu kinetiğine ilişkin çok az tek molekül çalışması vardır. Mevcut çalışmalar ya tek bölünme olaylarının meydana geldiği zamanlardaki değişimin ayrıntılı analizini yapmak için yeterli istatistik rapor etmemektedir ^8,9,10 ya da bölünme sürelerinin tam dağılımını yakalayamamaktadır¹¹. Bu tür bir analiz, nispeten uzun ömürlü kinetik ara ürünlerin varlığını ortaya çıkarabilir ve REaz aracılı DNA bölünmesinin mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Tek molekül düzeyinde, biyokimyasal süreçler stokastiktir - sürecin tek bir örneğinin gerçekleşmesi için bekleme süresi, τ, değişkendir. Bununla birlikte, birçok τ ölçümünün, gerçekleşen sürecin türünün göstergesi olan bir olasılık dağılımına, p(τ) uyması beklenebilir. Örneğin, bir enzimden bir ürün molekülünün salınması gibi tek adımlı bir süreç, Poisson istatistiklerine uyacak ve p(τ) negatif bir üstel dağılım şeklini alacaktır:

burada ortalama bekleme süresi β. İşlem oranının, k'nin, ortalama bekleme süresinin tersi olan 1/β'ye eşit olacağını unutmayın. Birden fazla adım gerektiren süreçler için, p(τ), her bir adım için tek üstel dağılımların evrişimi olacaktır. Aynı ortalama bekleme sürelerine sahip N tek üstel bozunma fonksiyonunun evrişimi için genel bir çözüm, β, gama olasılık dağılımıdır:

Burada Γ(N), N-1'in faktöriyelinin N'nin tamsayı olmayan değerlerine enterpolasyonunu tanımlayan gama fonksiyonudur. Bu genel çözüm, bireysel adımların ortalama bekleme süreleri benzer olduğunda bir yaklaşım olarak kullanılabilse de, nispeten hızlı adımların varlığının, önemli ölçüde daha uzun bekleme sürelerine sahip adımlar tarafından maskeleneceği anlaşılmalıdır. Başka bir deyişle, N değeri,¹² adımlarının sayısında bir alt sınırı temsil eder. Yeterli sayıda bekleme süresi ölçümü ile, β ve N parametreleri, olayların gruplandırılması ve gama dağılımının elde edilen histograma uydurulması veya maksimum olabilirlik tahmin yaklaşımı kullanılarak tahmin edilebilir. Bu nedenle, bu tür bir analiz, topluluk tahlillerinde kolayca çözülemeyen kinetik adımların varlığını ortaya çıkarabilir ve parametreleri doğru bir şekilde tahmin etmek için çok sayıda gözlem gerektirir^12,13.

Bu makale, yüzlerce bireysel REaz aracılı DNA bölünme olayını paralel olarak gözlemlemek için kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu kullanmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Testin tasarımı, birkaç deneyin sonuçlarını bir araya getirmeyi mümkün kılar ve binlerce olay içeren bekleme süresi dağılımları oluşturabilir. Kuantum noktalarının yüksek fotostabilitesi ve parlaklığı, deneyin başlamasından birkaç dakika sonra bile meydana gelen bölünme olaylarını gözlemleme yeteneğinden ödün vermeden 10 Hz'lik bir zaman çözünürlüğüne izin verir. İyi zamansal çözünürlük ve geniş bir dinamik aralık, büyük bir veri seti toplama yeteneği ile birleştiğinde, 1 ^dakika-1 aralığında devir oranlarına sahip REase'lerin bölünme yollarında çoklu kinetik adımların varlığını ortaya çıkarmak için bekleme süresi dağılımlarının doğru karakterizasyonuna izin verir. EcoRV durumunda, tümü başka yollarla tanımlanmış olan üç kinetik adım çözülebilir ve bu da tahlilin bu tür adımların varlığına duyarlı olduğunu doğrular.

İlgilenilen tanıma dizisini içeren dubleks DNA substratları, biyotinillenmiş bir oligonükleotidin, tek, kovalent olarak bağlı yarı iletken nanokristal kuantum noktası ile etiketlenmiş tamamlayıcı bir zincire tavlanmasıyla üretilir. Bu substratlar, yüzeyine kovalent olarak bağlanmış yüksek moleküler ağırlıklı polietilen glikol (PEG) moleküllerinden oluşan bir çim ile bir cam lamel üzerine inşa edilmiş bir akış kanalına sokulur. DNA substratları, serbest uçlarında bir biyotin bulunan PEG moleküllerinin bir kısmı tarafından bir biyotin-streptavidin-biyotin bağlantısı yoluyla yakalanır. TIRF mikroskobunda, cam-sıvı arayüzünden uzaklaştıkça katlanarak azalan bir buharlaşma dalgası aydınlatma sağlar; Penetrasyon derinliği, kullanılan ışığın dalga boyu sırasına göredir. Bu koşullar altında, yalnızca işlevselleştirilmiş cam yüzey üzerinde yakalanan bir DNA molekülü tarafından yüzeye bağlanan kuantum noktaları uyarılacaktır. Çözeltide serbest olan kuantum noktaları, aydınlatılan bölge içinde kısıtlanmayacak ve bu nedenle ışıldamayacaktır. Bir kuantum noktasını yüzeye bağlayan DNA parçalanırsa, bu kuantum noktası yüzeyden yayılmak için serbest kalacak ve floresan görüntüsünden kaybolacaktır.

Birçok Tip II REaz'ın magnezyum¹⁴ yokluğunda DNA'yı bağladığı bilinmesine rağmen, hepsi DNA bölünmesine aracılık etmek için magnezyum gerektirir¹⁵. Bu REazlar, magnezyum yokluğunda yüzeyde hareketsiz hale getirilmiş DNA'yı bağlayabilir. Magnezyum içeren tampon, DNA'ya REaz önceden bağlanmış bir kanaldan aktığında, kuantum noktalarının kaybolmasıyla gösterildiği gibi bölünme hemen başlar. REaz moleküllerinin önceden bağlanması ve ardından magnezyum eklenerek DNA bölünmesinin başlatılmasıyla elde edilen senkronizasyon, bir deneyde gözlemlenen enzim popülasyonundaki her molekül için bağımsız olarak DNA bölünmesinin tamamlanmasına kadar geçen gecikme süresinin ölçülmesini kolaylaştırır. Floresein, magnezyumun görüş alanına gelişini belirtmek için magnezyum içeren tampona izleyici bir boya olarak dahil edilir. Magnezyum içeren tamponda hiçbir enzim bulunmadığından, magnezyum içeren tamponun gelişinden her bir kuantum noktasının kaybolmasına kadar geçen gecikme süresi, DNA'ya zaten bağlı olan bir REaz'ın DNA'yı parçalaması ve kuantum noktasını cam yüzeyden serbest bırakması için geçen süreyi gösterir. Kuantum nokta kaybolması hızlı bir şekilde gerçekleşir ve yoğunluk yörüngesinde keskin bir azalmaya neden olur ve belirli bir DNA molekülünün parçalanma süresinin net bir göstergesini sağlar. Olay sürelerinin belirlenmesi, yoğunluk yörüngelerinin matematiksel analizi ile gerçekleştirilir ve tipik bir deney, yüzlerce tanımlanabilir bölünme olayıyla sonuçlanır. Birden fazla deneyin sonuçları, doğrusal olmayan en küçük kareler veya maksimum olabilirlik analizi ile N ve β parametrelerinin tahminine izin vermek için yeterli istatistikler sağlamak üzere bir araya getirilebilir.

1. Genel bilgiler

1. Oligonükleotid tasarımı
   NOT: 60 baz çifti (bp) uzunluğundaki DNA substratı, 100 mM NaCl'de 75 °C'lik çift yönlü erime sıcaklığına sahip bir çift tamamlayıcı oligonükleotidden oluşur.
   1. Tek bir 5' biyotin modifikasyonu ile sentezlenen bir oligonükleotid ve diğerini 5' tiyol modifikasyonu (altı karbonlu bir ara parça ile) ile sipariş edin. Tanıma sitesini dubleks bölgenin ortasına yerleştirin.
      NOT: EcoRV ile kullanım için oligonükleotid dizileri aşağıda gösterilmiştir (tanıma yeri kalın harflerle yazılmıştır).
      5' BİOTİN - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' TİYOL - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Tüm adımlar için 18 MOhm dirençli ultra saf su kullanın.
3. Foto ağartmayı önlemek için kuantum noktaları içeren tüm solüsyonları ışıktan koruyun.
4. Bu protokolü tamamlamak için bir basınçlı hava kaynağı kullanın.

2. Kuantum nokta etiketli DNA substrat materyallerinin hazırlanması

NOT: Yukarıda açıklanan oligonükleotidlerin yanı sıra, diğer malzemeler için Malzeme Tablosuna ve kuantum nokta etiketli DNA substratlarının hazırlanması için gerekli tamponlar için Tablo 1'e bakın.

1. Kuantum noktalarına bağlanacak oligonükleotid üzerindeki 5' tiyol gruplarını azaltın.
   1. Her tiyollenmiş oligonükleotidi 100 μM'lik bir konsantrasyonda su içinde yeniden süspanse edin.
   2. Her oligonükleotid numunesi için 650 μL suyu boyut dışlamalı bir spin kolonuna pipetleyin ve ~15 saniye boyunca vorteksleyin. Sütunu 30 dakika boyunca toplanmaya bırakın.
   3. DTT çözelti içinde hızla bozulduğundan, her kullanımdan hemen önce taze 100 mM ditiyotreitol (DTT) çözeltisi hazırlayın. 7.7 mg DTT içeren bir şişeyi dikkatlice açın ve şişeye 500 μL sodyum fosfat tamponu pipetleyin; iyice karıştırmak için girdap.
   4. Her yeniden süspanse oligonükleotid için yeni bir tüp hazırlayın ve tüpe 50 μL oligonükleotid ve 50 μL DTT çözeltisi ekleyin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Oligonükleotidlerin 5' ucundaki oksitlenmiş tiyol grupları arasındaki disülfür bağlarını azaltmak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   5. Döndürme sütunu kapaklarını çıkarın ve her sütunu toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonlarını 2 dakika boyunca 750 × g'da santrifüjleyin ve elüatı atın.
   6. Spin kolonlarını yeni santrifüj tüplerine aktarın. Bir DNA / DTT karışımı örneğinin tüm hacmini (100 μL) hazırlanan her sütuna nazikçe pipetleyin. 2 dakika boyunca 750 × g'da santrifüjleyin ve konsantrasyonun yaklaşık 40 μM olduğunu doğrulamak için elüatın absorpsiyonunu 260 nm'de ölçün.
   7. Tiyol gruplarının oksidasyonunu ve disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için hemen kullanılmayacak numuneleri -20 °C'de saklayın.
2. DNA'nın kuantum noktalarına bağlanması
   1. Yapılacak her yapı için 50 μL'lik bir kuantum nokta stoğu alikotunu bir diyaliz cihazına pipetleyin ve pipet ucuyla zara dokunmamaya dikkat edin. 15 dakika boyunca ~ 100 rpm'de karıştırarak numune hacminin en az 1000 katı olan bir N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES) tamponu hacmine karşı diyalize edin.
   2. Her kullanımdan hemen önce CHES tamponunda 6 mM'lik taze bir sülfosüksinimidil-4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (sülfo-SMCC) çözeltisi hazırlayın. 2 mg sülfo-SMCC içeren bir şişeyi dikkatlice açın ve şişeye 800 μL CHES tamponu pipetleyin. İyice karıştırmak için girdap.
   3. Bir pipetleyici kullanarak, diyaliz cihazından asılı kuantum noktalarını dikkatlice alın ve eşit hacimde sülfo-SMCC çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın; Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Sülfo-SMCC'nin kuantum noktaları üzerindeki birincil aminlerle reaksiyona girmesine izin vermek için 1000 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   4. Bir pipetleyici kullanarak, her numuneyi dikkatlice yeni bir diyaliz cihazına aktarın. Fazla sülfo-SMCC'yi çıkarmak için, diyaliz cihaz(lar)ında bulunan hacmin en az 1000 katı olan bir CHES tamponu hacmine karşı 15 dakika karıştırarak diyalize edin. Tamponu 2 kez değiştirin ve toplamda 3 kez taze CHES tamponu ile diyaliz gerçekleştirin, bu da diyalizin her tampon değişiminden 15 dakika sonra devam etmesine izin verir.
   5. İkinci reaksiyona hazırlanırken tamponu değiştirmek için, diyaliz cihazlarını, cihaz(lar)da bulunan hacmin en az 1000 katı olan bir hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir behere aktarın. 15 dakika karıştırarak diyalize girin, tamponu 2 kez değiştirin ve toplamda 3 kez taze PBS ile diyaliz yapın, her tampon değişiminden sonra diyalizin 15 dakika devam etmesine izin verin.
   6. Bir pipetleyici kullanarak, diyaliz cihaz(lar)ından kuantum noktalarını içeren çözeltiyi dikkatlice geri kazanın ve her bir numuneyi, PBS'de seyreltilmiş eşmolar miktarda tiyollenmiş oligonükleotid içeren yeni bir tüpe aktarın. Bu noktadaki kuantum nokta konsantrasyonu ~4 μM olduğundan, eşit hacimde bir PBS ve indirgenmiş ve saflaştırılmış oligonükleotid numunesinin hacminin 1/10'unu (yaklaşık 4 μM konsantrasyon) birleştirin. 1000 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   7. 0.5 mg / mL nihai BSA konsantrasyonu elde etmek için her örneğe sığır serum albümini (BSA, 10 mg / mL) ekleyin. Bir pipetör kullanarak, her bir numuneyi dikkatli bir şekilde yeni bir diyaliz cihazına aktarın ve diyaliz cihaz(lar)ında bulunan hacmin en az 1000 katı olan bir depolama tamponu hacmine karşı diyalize edin. Tamponu 2 kez değiştirin ve toplamda 3 kez taze depolama tamponu ile diyaliz gerçekleştirin, böylece diyalizin her tampon değişiminden sonra 15 dakika devam etmesine izin verin.
   8. Bir pipetleyici kullanarak her bir numuneyi dikkatli bir şekilde geri alın, yeni bir tüpe koyun ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kuantum noktaları donma nedeniyle zarar göreceği için -20 °C'de saklamayın.
3. Kuantum nokta işaretli oligonükleotidin biyotinillenmiş oligonükleotide tavlanması
   1. Her bir biyotinile oligonükleotidi 100 μM'lik bir konsantrasyonda depolama tamponunda yeniden süspanse edin. Kullanılmayan numuneleri -20 °C'de saklayın.
   2. Kuantum nokta etiketli oligonükleotid örneğini 10 kat molar fazla biyotinile oligonükleotid ile birleştirin. Kuantum nokta etiketli numunedeki tahmini DNA konsantrasyonu 2 μM olduğundan, bu numunenin her 10 μL'si için 0,2 μL biyotinillenmiş oligonükleotid ekleyin.
   3. Karışımı bir ısı bloğunda 75 °C'ye ısıtın (tamamlayıcı bölge için erime sıcaklığı). Bu sıcaklıkta 5 dakika tutun. Isı bloğunu kapatın ve yavaşça soğumaya bırakın. Tamamlanan yapıyı 4 °C'de saklayın; dondurmayın.

3. Lamellerin yüzey işlevselleştirilmesi

NOT: Bu işlem daha önce diğer JoVE video protokollerinde^{açıklanmıştır 16,17}. Bu protokol, daha küçük bir cam slaytı barındırmak için küçük değişikliklerle prosedürün uyarlanmış bir versiyonunu açıklar. Lamellerin yüzey işlevselleştirmesi için gerekli diğer malzemeler için Malzeme Tablosuna bakınız.

1. Her lamel tutucusuna 5 lamel yerleştirin. Birbirlerine yapışmamaları için her bir lamel çifti arasında bir boşluk atladığınızdan emin olun. Lamelleri tutucularına kapaklı bir kavanoza yerleştirin, lameller kaplanana kadar kavanoza etanol ekleyin ve üst kısmı sıkıca vidalayın. Tüm kavanozu tamamen batırmadan banyo sonikatöründeki suya yerleştirin ve 30 dakika boyunca sonikasyon yapın.
2. Temiz bir beher veya kavanozu ultra saf suyla doldurun. Tutucularındaki lamelleri etanolden çıkarmak için metal cımbız kullanın ve durulamak için suya batırın. Ardından, lamelleri ve tutucuyu 1 M potasyum hidroksit (KOH) çözeltisi içeren bir kavanoza aktarın. Üstünü sıkıca vidalayın, kavanozu sonikatör banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca sonikasyon yapın.
   NOT: Aşındırıcı ve tahriş edici olduğu için KOH solüsyonunu tutarken dikkatli olun.
3. Sonikasyonu etanol ve KOH çözeltisinde tekrarlayın, lamelleri her adım arasında yukarıda açıklandığı gibi suda durulayın.
4. Lamelleri tutucularındaki saf asetonla dolu temiz bir kavanoza aktarın. Kavanozu yukarıda açıklandığı gibi 30 dakika boyunca sonikleştirerek temizliği bitirin. Bu adımdan sonra su ile durulamayın.
5. Metal cımbız kullanarak, lamelleri tutucularındaki 80 mL taze aseton ve mikro ölçekli bir karıştırma çubuğu içeren 100 mL'lik temiz bir behere aktarın. Beheri en az 1.000 rpm'ye ayarlanmış manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Aseton kuvvetlice karıştırılırken,% 2 v / v'lik bir çözelti yapmak için behere 1.6 mL 3-aminopropiltrietoksisilan (APTES) pipetleyin.
   NOT: Aşındırıcı olduğu için APTES'i pipetlerken dikkatli olun.
6. Lamellerin çözelti içinde 2 dakika inkübe kalmasına izin verin, ardından reaksiyonu söndürmek için lamelleri tutucularındaki lamelleri bir su kabına aktarmak için metal cımbız kullanın. Lamelleri iki kez daha durulayın, beherdeki suyu değiştirin.
7. Silanize camı 120 °C fırında 75 dakika kürleyin. Hemen bir sonraki adıma geçmiyorsanız, lamelleri en fazla birkaç gün vakum altında saklayın.
8. N-hidroksisüksinim (NHS) ester türevli polietilenglikolleri (PEG'ler) 100 mM sodyum bikarbonat (pH 8.2) içinde çözün. ~ 100 mg / mL metoksi sonlu PEG ile 10 mg / mL metoksi sonlu PEG ile biyotin sonlu PEG oranı kullanın.
9. 100 μL PEG solüsyonunu kuru silanize lamellerin yarısına pipetleyin ve her birini ikinci bir lamel ile örtün. Lamellerin birbirine yapışmasını önlemek için her köşeye yerleştirilmiş küçük parafilm parçalarını ara parça olarak kullanın.
10. Lamelleri nemli bir ortamda 3,5 saat inkübe edin. Lameli sandviçleri ayırın. Her lameli bol suyla yıkamak ve basınçlı hava ile kurutmak için bir fışkırtma şişesi kullanın.
11. İşlevselleştirilmiş lamelleri vakum altında saklayın. PEG ile tedavi edilen tarafı yukarıda tuttuğunuzdan emin olun, çünkü diğer taraf DNA substratını yakalaymayacaktır.

4. Mikroakışkan cihaz yapımı

NOT: Mikroakışkan cihazın yapımı için gerekli diğer malzemeler için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Konik bir elmas uçlu tekerlek ucu ile donatılmış el tipi bir döner çok amaçlı alet kullanarak, giriş ve çıkış görevi görmesi için kuvars sürgünün zıt köşelerine iki delik açın. Delme sırasında sürgüyü yerine sabitlediğinizden, ucu yağladığınızdan ve sürekli su ile kaydırdığınızdan emin olun. Her deneyden sonra, yapıştırıcıyı ve epoksiyi çözmek için kullanılmış bir cihazı asetona batırarak hazırlanan kuvars slaytı yeniden kullanım için geri kazanın; Kalan bileşenleri atın.
   NOT: Delme elle yapılabilir, ancak çok amaçlı alet için pres tarzı bir tutucunun kullanılması işlemi kolaylaştırır.
2. 25 μL streptavidin çözeltisini 80 μL PBS ve 20 μL bloke edici tampon ile birleştirin. PEG ile muamele edilmiş bir lamel bu karışımla kaplayın ve nemli bir ortamda 30 dakika inkübe edin.
3. Lamelin inkübasyonu sırasında, bir akış kanalı oluşturmak için görüntüleme ara parçasını hazırlayın. 1 inç kare karelik bir görüntüleme ara parçası parçası kesin, ardından kuvars slaytta açılan deliklerin uçlarına hizalanmış 2 mm genişliğinde bir kanal işaretleyin (Şekil 2). Kanalı bir neşter ile ara parça malzemesinden kesin.
4. Desteğin bir tarafını görüntü aralayıcısından soyun ve giriş ve çıkış deliklerini kapatmamaya dikkat ederek dikkatlice kuvars slaytın üzerine yerleştirin. Önceki deneylerden kalan yapışkan kalıntılarını gidermek için kuvars slaytı asetonla iyice temizlediğinizden emin olun.
5. Lameli suyla yıkayın ve basınçlı hava ile kurulayın. Desteğin diğer tarafını görüntüleme ara parçasından çıkarın ve düzeneği birbirine bastırmak ve yapıştırıcıdaki hava kabarcıklarını çıkarmak için plastik cımbız kullanarak kuvars lam ile işlevselleştirilmiş, streptavidin kaplı lamel arasına sıkıştırın.
6. Kuvars slayttaki her deliğe 30 cm uzunluğunda bir polietilen boru yerleştirin. Çözeltinin serbest akışını sağlamak için borunun uçlarını belirli bir açıyla kestiğinizden emin olun. Tüpleri yerinde tutmak için bir tüp rafı veya başka bir destek kullanın ve tüpleri yerine ve monte edilen cihazın kenarlarını epoksi ile kapatın.
   NOT: Cihazı, epoksi sertleştiğinde alttan kolayca soyulabilen bir parafilm parçası üzerine inşa etmek iyi çalışır.
7. Epoksi sertleştikten sonra, boş şırınga üzerindeki kör iğneyi cihazın çıkış borusuna yerleştirin ve giriş borusunun ucunu bloke edici tamponla dolu bir kaba daldırın. Cihazı bloke edici tamponla doldurmak için şırınga pistonunu geri çekin. Kullanmadan önce cihazı en az 30 dakika inkübe etmeye bırakın.

5. Kuantum nokta etiketli DNA substratının yüzey bağlantısı

NOT: Yukarıda açıklanan mikroakışkan cihaz, DNA substratı ve bloke edici tamponun yanı sıra, diğer malzemeler için Malzeme Tablosuna ve kuantum nokta etiketli DNA substratlarının yüzey bağlanması için gerekli tamponlar için Tablo 1'e bakın.

1. Mikroakışkan cihazı bantla mikroskop tabla plakasına takın, objektifi cihazın alt kısmı ile temas ettirin ve objektifi, görüş alanı mikroakışkan kanal içinde olacak şekilde konumlandırın.
2. Çıkış tüpünü şırınga pompasına bağladıktan sonra şırınga pistonunu geri çekerek mikroakışkan kanalı yeni engelleme tamponu ile yıkayın. Boruda veya kanalda sıkışmış kabarcık olmadığından emin olmak için kontrol edin.
   NOT: Bu noktadan sonra, cihaza hava kabarcığı girmemesi için giriş borusunun sıvı içinde olduğundan emin olun.
3. Hazırlanan DNA substratının 1 μL'sini 1 mL bloke edici tampona seyreltin. Giriş tüpünü seyreltilmiş DNA substratına yerleştirin ve 800 μL substrat solüsyonunu kanaldan 200 μL / dak hızında akıtan. Akış durduktan sonra DNA çözeltisinin 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden kanalda inkübe edilmesine izin verin.
4. Bağlanmamış DNA'yı kanaldan durulamak için kanaldan 200 μL / dak hızında en az 800 μL bloke edici tampon akıtın.
5. Lazer gücünü, mikroskop odağını ve TIRF açısını, yüzeye bağlı kuantum noktaları net bir şekilde görülebilecek şekilde ayarlayın.
   NOT: Kuantum noktaları hızlı bir şekilde ağartmasa da, yanıp sönmeyi en aza indirmek için gücü mümkün olduğunca düşük tutmak en iyisidir.

6. REaz aracılı DNA bölünmesi

NOT: Malzemeler için Malzemeler Tablosuna ve REaz aracılı DNA bölünmesi için gerekli tamponlar için Tablo 1'e bakın.

1. Kameranın optimum çalışma sıcaklığına soğutulduğundan ve 0,10 sn'lik bir pozlama süresiyle yüksek hızlı akış için ayarlandığından emin olun. ~4 dk boyunca veri toplamaya hazır olun.
2. Mikroakışkan cihazı, 200 μL/dk akış hızında magnezyum içermeyen 800 μL deneysel tampon ile yıkayın.
3. REase'i magnezyum içermeyen bir alikot (1 mL) deneysel tampona ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. 400 birim/mL EcoRV'ye karşılık gelen 4 μL 100.000 birim/mL stok kullanın. Seyreltilmiş enzimin 800 μL'sini 200 μL/dk'lık bir akış hızında kanaldan akıtın.
4. Deneye, magnezyum ve floresein içeren deneysel tamponu 200 μL/dk akış hızında akıtarak başlayın. Şırınga pompasını başlattıktan hemen sonra veri toplamaya başlayın. 800 μL tampon akıttıktan sonra veri toplamayı durdurun.

7. Veri analizi

NOT: Bu protokol için kullanılan veri analiz yazılımı için Malzeme Tablosuna bakın ve farklı bir analiz platformu kullanıyorsanız ayarlamalar yapın.

1. Sıfır zaman noktası belirleme
   1. Görüntü İşleme Araç Kutusu'ndaki yerleşik bir morfolojik silindir şapka filtreleme işlevi olan imtophat işlevini kullanarak deneysel filmin her karesinden arka plan floresansını çıkarın. Yapılandırma öğesi olarak yarıçapı üç piksel olan bir disk seçin. Filtrelenmiş görüntüyü orijinal görüntüden çıkararak arka plan yoğunluğunu elde edin.
      NOT: Filtre, yalnızca arka plandan daha parlak ve yapılandırma öğesinden daha küçük görüntü özelliklerini korur.
   2. Her film karesi için çıkarılan arka planın ortalamasını alın. Deney için sıfır zaman noktasını belirlemek için bu değerin bir yörüngesini kullanın (Şekil 3A). Ölü hacim akışı sırasında artış hızının değişim oranının standart sapmasının 3 katını aştığı ilk kareyi bularak başlangıç zamanını belirleyin.
      NOT: Her film karesi için çıkarılan arka planın ortalama değerinin değişim oranındaki keskin bir artış, izleyici boyayı içeren son deneysel arabelleğin akış hücresine girdiği zamanı gösterir (Şekil 3B).
2. Kuantum nokta yoğunluğu yörünge hesaplaması ve analizi
   1. İzleyici boyanın gelmesinden önce kaydedilen arka plan düzeltmeli film kareleri kümesi için maksimum yoğunluk projeksiyonunu hesaplayın. Bu projeksiyon görüntüsünde pkfnd gibi bir tepe bulma işlevi kullanarak kuantum noktalarının konumlarını bir piksel hassasiyetinde belirleyin.
   2. Tepe bulma işlevi tarafından döndürülen konumu çevreleyen kenar başına üç piksel karelik bir kare bölgenin her film karesindeki ortalama yoğunluğu hesaplayarak tek tek kuantum noktaları için yoğunluk yörüngeleri oluşturun.
      NOT: Yukarıda açıklanan arka plan düzeltmesi, izleyici boyası tarafından ortaya çıkan artefaktları kaldırır. Ortaya çıkan yoğunluk yörüngeleri nispeten düz olmalı, ancak yine de doğal olarak meydana gelen yoğunluk dalgalanmalarını içermelidir (Şekil 4).
   3. Yoğunluk yörüngelerinin istatistiksel analizi ile kuantum nokta kaybolma olaylarını tanımlayın. Her kuantum nokta yoğunluğu yörüngesi için, yörüngelerde gözlemlenen gürültüye bağlı olarak, o yörünge için maksimum ve minimum değerler arasındaki farkın uygun bir kısmı kadar minimum değerin üzerinde bir eşik yoğunluğu hesaplayın.
      NOT: Kuantum noktası için yoğunluk dalgalanması tipik olarak arka plan dalgalanmasından çok daha büyüktür. Bu değerler karşılaştırılarak uygun bir değer belirlenebilir: seçilen eşik, en yüksek arka plan değerinden daha yüksek olmalı, ancak ideal olarak kuantum nokta floresansı için en düşük değerden daha düşük olmalıdır. Sunulan veriler için, kullanılan eşik, her bir yörünge için minimum değerin üzerinde ve o yörünge için maksimum ve minimum değerler arasındaki farkın üçte biri olacak şekilde hesaplandı. Bir kuantum noktasının, bulunduğu yerde gözlemlenen yoğunluğun bu eşiğin üzerinde olduğu son zaman noktasında kaybolduğu kabul edilebilir.
   4. Varsayılan kaybolma olaylarını onaylayın. Olayları son analize yalnızca gözlemlenen yoğunluk, kaybolma zamanından önceki film karelerinin yarısından fazlası için yörünge için minimum ve maksimum yoğunluk değerleri arasındaki orta noktanın üzerindeyse ve yoğunluk yörüngesinin standart sapması olaydan sonra azaldıysa dahil edin.
      NOT: Yalnızca geçerli kaybolma olaylarının kaydedildiğinden emin olmak için başka istatistiksel testler de kullanılabilir.

Akış hücresi, objektif TIRF görüntüleme için lazer aydınlatması ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde yüksek sayısal açıklıklı yağa daldırma 60x büyütme objektifine doğrudan bağlanır (Şekil 5A). DNA substratını tanıttıktan ve fazla DNA ve kuantum noktalarını yıkadıktan sonra, bir görüş alanında tipik olarak binlerce bireysel kuantum noktası vardır (Şekil 5B). Bu kuantum noktaları, cam yüzeye kararlı bir şekilde tutturulur ve deneyin zaman ölçeği boyunca gözle görülür bir karartma veya önemli bir ağartma geçirmezler. Bununla birlikte, hem magnezyum hem de uygun bir REaz içeren bir tampon akış kanalından geçirilirse, tipik bir dört dakikalık gözlem süresinin sonunda, bir deneyin başında bulunan kuantum noktalarının en az% 30'u görüş alanından kaybolmuş olacaktır. Magnezyum gereksinimini teyit etmek için, REase magnezyum yokluğunda kanaldan aktığında, deneyin başında mevcut olan kuantum noktalarının en az% 95'i gözlem süresinin sonunda hala görülebilir (Şekil 5C). Bununla birlikte, magnezyum içeren tampon, magnezyum yokluğunda REaz'ın yüzeye bağlı DNA'yı bağlamasına izin verildikten hemen sonra akıtıldığında, kuantum noktalarının yarısına kadarı gözlem süresinin sonunda kaybolmuş olacaktır (Şekil 5D), REaz ve magnezyum kanaldan birlikte aktığında gözlemlenene benzer şekilde. Olayların kesin verimi, kullanılan koşullar altında enzimin verimliliğine bağlı olacaktır. Magnezyum içeren tampon, daha önce uygun REase'yi akış kanalına sokmadan akıtıldığında, gözlem süresi boyunca kuantum noktalarının %5'inden daha azı kaybolur ve olayların histogramı için fark edilebilir bir tepe noktası yoktur. Bu sonuç, önceden bağlanmış REaz moleküllerinin, kuantum noktalarını cam yüzeye bağlayan DNA'nın bölünmesine aracılık ettiğini ve bu DNA bölünmesinin, bu deneylerde gözlemlenen kuantum nokta kaybolma olaylarının büyük çoğunluğundan sorumlu olduğunu göstermektedir.

Kuantum nokta kaybolması hızlı bir şekilde gerçekleşir ve yoğunluk yörüngesinde keskin bir azalmaya neden olur, bu da belirli bir DNA molekülünün parçalandığı zamanın net bir göstergesini sağlar (Şekil 5E). Olay sürelerinin belirlenmesi, yoğunluk yörüngelerinin matematiksel analizi ile gerçekleştirilir. Tek kuantum noktaları, kullanılan görüntü koşulları altında arka plandan önemli ölçüde daha yüksek varyansa sahip yoğunluk yörüngeleri oluşturur, bu nedenle yoğunluk yörüngesinin varyansı, gözlemlenen yoğunluk düşüşünden sonra arka planın varyansı ile karşılaştırılabilir bir seviyeye düştüğünde varsayılan olaylar doğrulanır. Ek olarak, varsayılan bir kaybolma olayından önce büyük ölçüde göz kırpma içeren yörüngeler son analizden çıkarılır. Bununla birlikte, tipik bir deney, bu kriterleri karşılayan yüzlerce olayla sonuçlanır ve birden fazla deneyin sonuçları, doğrusal olmayan en küçük kareler eğrisi uydurma veya maksimum olabilirlik parametresi tahmini ile N ve β parametrelerinin tahmin edilmesine izin vermek için yeterli istatistikler sağlamak üzere bir araya getirilebilir.

Sunulan temsili veriler, bu deneyin iyi çalışılmış Tip IIP REase, EcoRV ile yapılmasıyla toplanmıştır (Video 1). 60 bp uzunluğundaki dubleks DNA substratı, dubleksin bir zincirinin 5' ucunda bir biyotin molekülü ve diğer ipliğin 5' ucuna kovalent olarak bağlı bir kuantum noktası ile inşa edilir. DNA substratı, aşağı ok (↓) ile gösterildiği gibi, ortada EcoRV tarafından parçalanan tanıma dizisinin tek bir kopyası olan GAT↓ATC'yi içerir. EcoRV, magnezyum yokluğunda DNA substratına önceden bağlandı ve daha sonra DNA bölünmesini başlatmak için magnezyum içeren tampon akıtıldı. Temsili veriler, toplam 3451 gözlemlenen bölünme olayı veren beş ayrı deneyin havuzlanmış sonuçlarını içerir. Sıfır zaman noktasından önce veya öne çıkan etkinlik zirvesinin dışında meydana gelen olaylar hariç tutulduktan sonra, 2987 olay kaldı ve bu da bir histogramı bir saniyelik bölmelerle doldurmak için yeterliydi. Verilerden N ve β değerlerini çıkarmak için hem doğrusal olmayan en küçük kareler eğrisi uydurma hem de maksimum olabilirlik parametre tahmini kullanıldı. İki parametre tahmin yöntemi uyum içindeydi (Şekil 6A), N

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur