Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

3.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62113

⸱

26 Aralık 2020

 , 
1Department of Chemistry, Texas A&M University

Bu makalede

Özet

Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Asetillenmiş histone proteinleri, bir mutant kodlayan Escherichia coli'de kolayca ifade edilebilir, Nε-asetil-lizin (AcK)-spesifik Methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ve onun konyak tRNA (tRNAPyl)siteye özgü asetillenmiş histonları ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek için. MmAcKRS1 ve tRNAPyl, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sağlar. Bu teknik, H3 lizin sahalarında ACK'yı dahil etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Pyrrolysyl-tRNA sentezi (PylRS) ayrıca bölgeye özgü protein modifikasyonu veya fonksiyonelleştirme için diğer nonkanonik amino asitleri (ncAA'lar) içerecek şekilde kolayca geliştirilebilir. Burada MmAcKRS1 sistemini kullanarak AcK'yı histone H3'e dahil etmek ve asetillenmiş H3 proteinlerini yeniden inşa edilmiş mononükleozomlara entegre etmek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Asetillenmiş yeniden inşa edilmiş mononükleozomlar biyokimyasal ve bağlayıcı tahlillerde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilir. Modifiye mononükleozomların elde edilmesi, yeni etkileşimler keşfetmek ve epigenetiği anlamakla ilgili deneyler tasarlamak için çok önemlidir.

Giriş

Biz sentezlemek ve siteye özgü asetillelenmiş histonlar ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek içinPylRS ve tRNA Pyl kullandık. PylRS, post translational modifikasyonlara (PTM) sahip proteinler üretmek için genetik kod genişletme aracı olarak paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır ve genetik olarak yaklaşık 200 farklı nTA'yı içerecek şekilde evrimleştirilmiştir. PylRS, çeviri sırasında diğer amino asitlerden kaynaklanan rekabeti ortadan kaldırarak kehribar stop kodonuna dahil olur. PylRS ilk olarak metanojenik arkealarda keşfedilmiştir ve o zamandan beri kimyasal biyolojide yeni reaktif kimyasal grupları proteinlere dahil etmek için1,2.

MmAcKRS1, Methanosarcina mazei PylRS'den evrimleşmiştir ve laboratuvarımızda asetillenmiş proteinlerin sentezi için sıklıkla3, 4,5,6. MmAcKRS1, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sunar. Bu teknik daha önce K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 ve K79 histone H3 lizin sitelerinde Sirtuin 1, 2, 6 ve 7'nin asetilasyonlu mononükleozomlar4,5,6üzerindeki aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Burada asetillenmiş histonları ifade etmek ve asetillenmiş nükleozomları yeniden inşa etmek için bu yöntemi detaylandırıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Plazmid yapımı

  1. Hangi histone proteinin asetilasyona ve hangi lizin bölgesine karar vererek başlayın. Siteye yönlendirilmiş mutagenezi kullanarak siteyi amber stop codon'a (TAG) yönlendirin.
    NOT: Histone proteinlerinin ekspresyonu için daha önce tasarlanmış dört plazmid vardır. Dört histone proteini de N-terminal histidin etiketiyle pETDuet-1 vektörüne klonlandı. Histone H4 ayrıca bir SUMO etiketi, yaklaşık 40 kopya numarasına sahip çoğaltma colE1'in kökeni, ampisiline dayanıklı ve bir T7 promotörü içerir.
    1. Dört histone protein plazmidinden birinde istenen yerde (mevcut bir lizin kodonunu kehribar durdurma kodonu ile değiştirerek) TAG mutasyonu içeren ileri ve ters astarlar tasarlayın.
    2. Plazmid içeren TAG'i yükseltmek için tam plazmid PCR kullanın. Astarlar için uygun bir tavlama sıcaklığı belirleyin. Genel olarak, astarların eksi 5 °C'nin erime sıcaklığı (Tm)yeterli olacaktır. Bir PCR ürünü elde etmekte zorluk yaşanırsa, tavlama sıcaklığını amplifikasyon için optimize etmek için Tm - 5 °C civarında bir sıcaklık gradyanı kullanılabilir.
      NOT: Bu deneyde, aşağıdaki koşullarla 30 döngü boyunca şirket içinde ifade edilen bir PFU polimeraz kullanılmıştır: 30 s (denatürasyon) için 94 °C, 30 s için tavlama sıcaklığı ve 6 dakika (veya kilobase çiftleri başına 1 dk) için 72 °C. Bu tür PCR yöntemi hakkında daha fazla bilgiiçin bkz.
    3. Üreticinin protokolüne uyarak PCR ürününü pcr temizleme kiti ile temizleyin. PCR ürününü agarose jel elektroforezi ve daha sonra ethidyum bromür lekeleme ile analiz edin.
    4. Plazmidi 16 °C'de bir gecede T4 ligaz ile inkübasyon yaparak lige edin.
  2. İlk plazmid (AmpR)içeren TAG'i kimyasal olarak yetkin Escherichia coli'yedönüştürün. Dönüşümden en az 4 koloni seçin ve plazmidi arındırın. Standart yöntemleri kullanarak gliserol ile her birinin hücre stoklarını yapın ve -80 °C'de saklayın. İstenen TAG mutasyonu onaylamak için sıralama için gönderin.
  3. Dizi onaylandıktan sonra, pEVOL-AckRS (ChlR)ile TAG içeren plazmid (AmpR)ile birlikte ısı şoku yöntemini kullanarak BL21 hücrelerinin silinmesini kimyasal olarak yetkin CobB'ye (E. coli.)bilinen tek histone lizin deacetylazı) dönüştürün. pEVOL, düşük kopya numarası p15A kökenli bir orta kopya numarasına sahip bir plazmiddir.
    NOT: pEVOL plazmid serisi, ortogonal aaRS/tRNATyr çiftinin protein kesilmesini azaltmada ve mutant proteinlerin genel verimini artırmada etkili olduğunu gösteren önceki çalışmalara dayanarak inşa edilmiştir8. CobB silme hücrelerine erişilemediyse, kimyasal olarak yetkin BL21 hücreleriyle devam edin. CobB sirtuin benzeri bir histone lizin deacetylazdır ve Nicotinamide alternatif bir yaklaşım olarak CobB'yi inhibe etmek için histone protein ekspresyonu sırasında 5 mM son konsantrasyonda eklenebilir9.
  4. Bir hücre stoğu yapın ve -80 °C'de saklayın.

2. Asetillenmiş histone protein ekspresyonu

  1. Bir kültür şişesinde 1 L otomatik kapatılmış 2YT ortamı (veya seçim hacmi) hazırlayın.
  2. TAG içeren plazmid (AmpR)ve pEVOL-AckRS (Chl R) içeren ve 37 °C ila OD = 0,6(4-6 h) arasında büyüyen ortak dönüştürülmüş hücre stoğu ile uygun antibiyotikleri içeren 2YT ortam 20 mL aşıla.
  3. 1 L otoklavlı 2YT ortama uygun antibiyotikleri ekleyin ve 20 mL başlangıç kültürü ile aşıleyin. 37 °C'de OD = 0,6-0,8 (2-3 saat) arasında büyüyün.
  4. IPTG 1 mM, %0,2 arabinoz ve AcK 5 mM'nin son konsantrasyonlarına indükleme ajanları ve asetilsin (AcK) ekleyin.
  5. Kültürü 37 °C'de 6-8 saat büyütün.
  6. Pelet hücreleri 15 dakika boyunca 2.700 x g'da.
  7. Hücre peletini gece boyunca -80 °C'de saklayın.
  8. Bu adımdan itibaren numuneyi her zaman buzda tutun. Hücre peletini 1 L kültür başına 50 mL histone lizis tamponunda çözün.
  9. Aşağıdaki döngüye göre sonicate: 1 s açık, 1 s kapalı, toplam zamanında: 3 dk% 60 genlik.
  10. Pelet dahil vücutları 45 dakika boyunca 41.600 x g'da.
  11. 30 mL histone liziz tamponunda süpernatant ve resuspend inklüzyon gövdelerini atın. Pelet içerme 30 dakika boyunca 41.600 x g'dadır.
  12. Süpernatant atın ve 30 mL pelet yıkama tamponunda dahil etme gövdelerini yeniden dirsindirin. Pelet dahil vücutları 30 dakika boyunca 41.600 x g'da.
  13. Süpernatant atın ve 6 M Guanidine Hidroklorür (GuHCl) tamponunun 25 mL'sinde dahil etme gövdelerini çözün. 1 saat boyunca 37 °C'de ajitasyon ile kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Gerekirse, dahil etme organları 4 °C'de bir gecede ajitasyon ile inkübe edilebilir.
  14. Pelet içerme 45 dakika boyunca 41.600 x g'dadır. 2 saat boyunca 6 M GuHCl tamponu ile dengelenmiş 1 mL Ni-NTA reçinesi ile süpernatantı kuluçkaya yaslanın.
  15. Denatüre koşullar altında Ni-NTA saflaştırma ile devam edin. Sütunu 3 sütun hacminde sütun yıkama arabelleğiyle yıkayın. Elute asetillenmiş histone proteini 10 mL elüsyon tamponu ile.
    NOT: Proteini burada konsantre etmeye çalışmak bir seçenektir, ancak asetillenmiş histonlar çok öngörülemezdir ve kolayca çökelebilir. Toplam hacimde 2 mL'yi geçmeniz önerilmez.
  16. Tuzları çıkarmak için asetilasyonlu histone proteinini% 5 asetik asit tamponuna karşı kapsamlı bir şekilde dialyze edin. Dialyze 4 °C'de bir seferde 3 saat, en az 6 kez taze tampon alışverişi.
    NOT: Geliştirilmiş protein saflığı için saf suya karşı diyalze etme seçeneği vardır. Bununla birlikte, bu, düşük verimli asetillenmiş histone proteinleri için istenmeyen önemli yağış ve verim azalmasına neden olur.
  17. Aliquot ve lyophilize protein, ve süresiz olarak -80 °C depolayın. Yabani tip histone proteinleri genellikle 10-50 mg/L verim, asetilasyonlu histone proteinlerisse özgü lizin bölgesine bağlı olarak 10 mg/L'den az verim verir. Örneğin, H3K79Ac ortalama 5 mg/L' dir.

3. Vahşi tip histon proteini ekspresyonu

  1. Tam nükleozomları birleştirmek için, 4 histone proteinini de ifade edin. Vahşi tip histonları ifade ederken ve arındırırken protokol, aşağıdakiler dışında asetilen histonları ile aynıdır:
    1. Birlikte dönüştürme gerçekleştirmeyin. Vahşi tip histone ifadesi için pEVOL-AcKRS kullanmayın. Antibiyotikleri buna göre ayarlayın.
    2. Hücresel ifadenin indüksiyonu sırasında CobB silme hücresi hattı kullanmayın veya Nikotinamid, AcK veya arabinoz eklemeyin.

4. 601 DNA'nın hazırlanması

NOT: Nükleozom konumlandırmasını yönlendirmek için önceden tasarlanmış optimize edilmiş bir DNA dizisi, yüksek verimli mononükleozom üretmek için histone oktamers ile birleştirilir. Bu dizi 601 DNA veya Widom dizisi olarak adlandırılır. Bu dizi, kromatin remodeling testlerinden tek molekül ölçümlerine kadar nükleozomların in vitro çalışmaları için standart DNA dizisi haline gelmiştir10.

  1. Nükleozom montajı için önemli miktarlarda 601 DNA hazırlamak için pGEM-3z/601'i Top 10 hücrelerine dönüştürün ve plazmid amplifikasyon ve ekstraksiyon için 10 mL kültür yetiştirin. Plazmid çıkarma kiti kullanın ve üreticinin tavsiyesine uyun.
  2. Bu amplifikasyon protokolü için şirket içinde ifade edilmiş bir PFU polimeraz (daha verimli) kullanın. PCR reaksiyonsu ayarlama: 250 μL reaksiyon için, 207.5 μL otoklavlı MQ H2O, 25 μL 10x PFU Tampon, 5 μL İleri Astar: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Ters Astar: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP karışımı, 2.5 μL PFU enzimi kullanın. Genellikle aynı anda 60 reaksiyon çalıştırarak bir araya yetecek kadar DNA elde ederiz.
  3. PFU polimeraz kullanıyorsanız, 30 s için 52 °C tavlama sıcaklığı ve 30 s uzatma süresi kullanın. Aksi takdirde üreticilerin önerdiği koşulları izleyin.
  4. PCR yapıldıktan sonra, PCR ürününü saflaştırmak için tercih edilen bir PCR temizleme kiti kullanın.

5. Histone oktamer montajı

  1. H2A, H2B, H3 ve H4 histone protein peletlerinin aliquotlarını çözün, böylece GuHCl Buffer'daki her histone proteininin ayrı bir stoğu vardır ve toplam hacmi 100 μL'dir.
  2. A280 emiciliği ölçerek her bir histon proteininin konsantrasyonunu hesaplayın.
  3. Emicilik herhangi bir protein için 1'den büyükse, daha doğru bir konsantrasyon elde etmek için GuHCl tamponu ile seyreltin.
  4. H2A ve H2B proteinlerini 1:1 molar oranında birleştirin ve toplam 4 μg/μL protein konsantrasyonuna seyreltin.
  5. Dialyze bir gecede 2 M TE arabelleğe karşı 4 °C'de sırayla, 2 h için 1 M TE arabellek ve 5 saat için 0,5 M TE arabellek.
    NOT: Diyalizin ikinci ve üçüncü adımları, çökeltmek için kararsız protein uyumlarına neden olur. Bu adımlarda yoğun yağış görülmesi bekleniyor.
  6. 4 °C'de 16.800 x g'da santrifüjleme ile çökeltmeleri çıkarın.
  7. Yine, A280 emiciliğini ölçen histone dimer (H2A/H2B karışımı) ve tetramerlerin (H3/H4 karışımı) konsantrasyonunu hesaplayın.
  8. Dimerleri ve tetramerleri 1:1 molar oranında karıştırın ve katı NaCl ilavesi ile NaCl'i 2 M'ye ayarlayın.
  9. Histone oktamer 4 °C'de saklanabilir ve dimer ve tetramerlerden daha kararlıdır. Demonteye neden olabileceği için asla histone oktamerini dondurmayın.
  10. Asetillenmiş histonlarla bir araya getiriyorsanız, vahşi tip proteini prosedürdeki asetilasyonlu proteinle değiştirmenız yeterlidir.

6. Nükleozom montajı

  1. 601 DNA'yı 2M TE arabelleğe ayarlamak için 100x TE arabellek ve katı NaCl kullanın. 2M TE tampondaki 601 DNA'yı 0.85:1 ila 0.90:1 molar oranında histone oktamerine ekleyin. Jel kayma analizinde serbest DNA varsa daha düşük bir DNA oranı eklenebilir.
  2. DNA-histon karışımını bir diyaliz torbasına aktarın ve yaklaşık 200 mL 2M TE tampona (veya birden fazla numuneyi monte ediyorsanız daha fazla) yerleştirin ve 4 °C'de çok hafifçe karıştırın.
  3. Tuz TE tamponunda yavaşça damlatmak için temizlemek için peristaltik bir pompa ayarlayın. Hacim kabaca iki katına çıktığında, hacmin yarısını dökün. Bunu toplamda en az 4 kez yapın. Bir pompa ile bu, başlangıç hacmine bağlı olarak 4-8 saat sürebilir. Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldüğünde nükleozomlar oluşur (tuzluluk ölçer ile ölçülür).
  4. Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldükten sonra, bir gecede 20 mM TE tampona karşı dialyze edin.
  5. Çökeltme ile çökeltmeleri çıkarın ve bir plaka okuyucu kullanarak nükleozomların konsantrasyonunu A260 okuma ile ölçün.
  6. His-TEV proteazını ekleyin (TEV: nükleozom 1:30, w:w) ve tüm histidin etiketlerini kaldırmak için 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Ni-NTA reçinesi aşağı çekerek nükleozom çözeltisinden histidin etiket safsızlıklarını çıkarın.
  7. Nükleozomları konumlandırmak ve numuneyi homojenize etmek için 1 saat boyunca 60 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Özellikle kararsız olan asetillenmiş siteler için bu adım tavsiye edilmeyebilir.
  8. Nükleozomları 4 °C'de kısa süreli (birkaç hafta) saklayın.
  9. Uzun süreli depolama için, nükleozomları depolama tamponuna karşı dialyze edin ve -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Dimerler, tetramerler ve oktavlar% 12 SDS PAGE jeli (Şekil 1 ve Şekil 2)çalıştırılarak değerlendirilebilir. Burada, bazı asetilasyonlu tetramerlerin diğerlerinden daha düşük verime sahip olduğunu görebilirsiniz (Şekil 1). Aslında, çekirdek bölgeye ne kadar yakınsa, verim o kadar düşük gözlenir. Bu büyük olasılıkla, tetramer montajına müdahale eden asetilasyondan kaynaklanmaktadır. Octamers monte edil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir deney sırasında bu protokolü her ayrıntıya uymak önemlidir. Nükleozomlar çok kararlı değildir ve bu protokolün belirlenmesinde çok fazla deneme yanılma olmuştur. Partiküller montaj işlemlerine kolayca müdahale edebileceğinden, her adımda (veya gözlendiği zaman) çökeltileri kaldırmak anahtardır. Her zaman ton örneklerini buzda tut. Nükleozomlar 4 °C'de çok uzun süre saklanırsa, kendiliğinden sökülebilirsiniz. Herhangi bir denemede kullanılmadan önce 2 haftadan uzun bir süre 4 °C'de saklanırsa, herhangi bir örneği Nati...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbiri tarafından beyan edilen rakip finansal çıkarlar yoktur.

Teşekkürler

Dr. Wesley Wang'a bu protokole ve değerli akıl hocalığına zemin hazırlayıp verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GrantS R01GM127575 ve R01GM121584) ve Welch Foundation (Grant A-1715) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 m TE tamponNANA 0,5 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 m TE tamponNANA 1 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x TE tamponNANA
2 m TE tamponNANA2 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM TE tamponNANA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl6M guanidinyum klorür, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Asetillisin
Kolonu Yıkama TamponuNANA 6M üre, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazol pH 7.8
Elüsyon TamponuNANA Fisherbrand
  Değişken Akışlı Kimyasal Transfer PompasıFischer Scientific15-077-67
His-TEV proteaz
Histon Lizis TamponuNANA60 mM Tris, 100 mM NaCl, %0.5 Triton-X100 (h/h), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Reçine6 M üre, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7.8
PCR Temizleme KitiEpoch Life Sicences2360050
Pelet Yıkama TamponuNANA60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRSAddgene137976
pGEM-3Z/601Addgene26656
Depolama TamponuNANA20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, %20 gliserol, pH 7.8
Termodöngüleyici

Kaynaklar

  1. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  2. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  3. Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
  4. Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
  5. Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
  6. Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
  7. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).
  8. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  9. Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
  12. Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
  13. Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
  14. Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
  15. Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
  16. Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Histon AsetilasyonuEscherichia Coli EkspresyonuB lgeye zg AsetilasyonMonon kleozom MontajKanonik Olmayan Amino AsitlerPirrolizil tRNA SentetazHiston OktameriTranslasyon Sonras Modifikasyon
Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.