Bu makalede, sürekli olarak bütün ve bozulmamış tat tomurcukları (içlerini saran sinir lifleri dahil) veren ve tat tomurcukları ile çevresindeki papilla içindeki yapılar arasındaki ilişkileri koruyan tüm mantar formu, sirküvallat ve damak tadı tomurcuklarının doku hazırlama, boyama ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Tat tomurcukları, ağız boşluğundaki kimyasal uyaranların alt kümelerini tespit etmek için uzmanlaşmış tat dönüştürücü hücrelerin koleksiyonlarıdır. Bu transdüksiyon hücreleri, bu bilgiyi beyne taşıyan sinir lifleriyle iletişim kurar. Tat alıcı hücreler sürekli olarak öldüğünden ve yetişkinlik boyunca değiştirildiğinden, tat alma ortamı hem karmaşık hem de dinamiktir ve hücre türlerinin, konumlarının ve aralarındaki fiziksel ilişkilerin ayrıntılı analizlerini gerektirir. Ayrıntılı analizler, antikor geçirgenliğini önemli ölçüde azaltan dil-doku heterojenliği ve yoğunluğu ile sınırlanmıştır. Bu engeller, ölçümlerin yalnızca yaklaşık olması ve hücre ilişkilerinin kaybolması için tat tomurcuklarının bölümler arasında bölünmesiyle sonuçlanan bölümleme protokolleri gerektirir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, burada açıklanan yöntemler, üç tat bölgesinden tüm tat tomurcuklarını ve bireysel terminal çardaklarını toplamayı, görüntülemeyi ve analiz etmeyi içerir: mantar biçimi papilla, circumvallate papillae ve damak. Bütün tat tomurcuklarını toplamak önyargıyı ve teknik değişkenliği azaltır ve tat alma hacmi, toplam tat alma iç yüksekliği, dönüştürücü hücre sayıları ve bireysel terminal çardaklarının morfolojisi gibi özellikler için mutlak sayıları bildirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajlarını göstermek için, bu makale genel bir tat alma işareti ve tüm tat lifleri için bir etiket kullanarak mantar formu ve circumvallate tat tomurcukları arasındaki tat tomurcukları ve innervasyon hacimlerinin karşılaştırmalarını sağlar. Tat nöronlarının seyrek hücreli genetik etiketlemesinin (tat dönüştürücü hücrelerin etiketli alt kümeleri ile) kullanımı için bir iş akışı da sağlanmaktadır. Bu iş akışı, görüntü analizi yazılımı kullanarak bireysel tat-sinir çardaklarının yapılarını, hücre türü numaralarını ve hücreler arasındaki fiziksel ilişkileri analiz eder. Birlikte, bu iş akışları hem tüm tat tomurcuklarının hem de içsel çardaklarının tam morfolojisinin doku hazırlanması ve analizi için yeni bir yaklaşım sağlar.
Giriş
Tat tomurcukları, ağız boşluğunda bulunan kimyasal tat uyaranlarının alt kümelerini bağlayan 50-100 özel epitel hücresinin koleksiyonlarıdır. Tat dönüştürücü hücrelerin genellikle tip1, 2 ,3,4,5,6,7,8,9, başlangıçta daha sonra moleküler belirteçlerle ilişkili elektron mikroskopi kriterlerine dayanarak var olduğu düşünülmektedir. Tip II hücreleri fosfolipaz C-beta 2 (PLC....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm hayvanlar, LABORATUVAR HAYVANLARININ İnsani Bakımı ve Kullanımına ilişkin ABD Halk Sağlığı Hizmet Politikası ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak bakıldı. Phox2b-Cre fareleri (MMRRC suşu 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) veya TrkBCreER fareleri (Ntrk2tm3.1 (cre /ERT2)Ddg) tdTomato muhabir fareleri (Ai14) ile yetiştirildi. AdvillinCreER47 Phox2b-flpo48 ve Ai65 ile yetiştirildi. 5-etil-2′-deoksiroridin (EdU) enjeksiyonları için, EdU hazırlandı ve Dozlar Perea-Martinez ve ark.49'ag....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Phox2b-Cre:tdTomato farelerinde 10,51(Şekil 3A)hem tüm tat tomurcuklarını hem de tüm tat tomurcuk innervasyonunu etiketleyen dsRed ve keratin-8 'e (genel bir tat alma tomurcukları) karşı antikorlarlalingual epitelin boyanmasını. Bu tat tomurcuklarını gözeneklerinden tabanlarına görüntüleme en yüksek çözünürlüklü x-y düzlem görüntülerini verdi (Şekil 3A,B). Piksel tabanlı görüntüleme prog.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Üç ağız boşluğu tat bölgesinden (mantar formu, circumvallate ve damak) bütün tat tomurcuklarını sürekli olarak toplamak ve lekelendirmek için bir yaklaşımın geliştirilmesi, tat dönüştürücü hücreleri analiz etmek, yeni birleştirilmiş hücreleri izlemek, innervasyon ve bu yapılar arasındaki ilişkileri izlemek için önemli iyileştirmeler sağlar. Ek olarak, etiketli bir popülasyonun içinde veya dışında potansiyel bir ikincil nöron işaretleyicisinin lokalizasyonunu kolaylaştırır50. Bu, gustatory papillae.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Doku lekeleme ve circumvallate tat tomurcuklarının görüntülenmesine yaptığı katkılar için Kavisca Kuruparanantha'ya, papillaya innervasyon lekesi ve görüntülemesi için Jennifer Xu'ya, hayvan bakımı ve genotipleme için Kaytee Horn'a ve yumuşak damak tadı tomurcuklarının doku lekesi için Liqun Ma'ya teşekkür ederiz. Bu proje R21 DC014857 ve R01 DC007176 tarafından R.F.K ve F31 DC017660 için L.O.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoetanol | ACROS Organikler | AC421430100 | |
| 2-Metilbütan | ACROS | 126470025 | |
| AffiniPure Fab Parçası Eşek Anti-Tavşan IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-007-003 | 15.5μ L / mL |
| Alexa Fluor > 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson İmmüno Araştırması | 712-605-150 | (1: 500) |
| AutoQuant X3 yazılımı | Medya Sibernetik | ||
| Künt Uçlu Forseps | Güzel Bilim Araçları | FST 91100-12 | |
| Tıkla-iT&ticaret; Plus EdU Hücre Proliferasyon Kiti | Moleküler Problar | C10637 | Kit talimatlarını izleyin |
| Coverglass | Marienfeld | 107242 | |
| Sitokeratin-8 | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB), (RRID: AB_531826) | Troma1 süpernatanı | (1:50, 4 derecede saklayın; C) |
| Diseksiyon Makası (kaba) | Roboz | RS-5619 | |
| Diseksiyon Makası (ince) | Moria | MC19B | |
| Eşek anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | (1:500) |
| Eşek anti-Tavşan, Alexa Fluor® 555 | ThermoFisher Scientific | A31572 | (1:500) |
| DyLight ve ticaret; 405 AffiniPure Fab Fragment Sığır Anti-Keçi IgG | Jackson İmmüno Araştırma | 805-477-008 | (1: 500) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Cam slaytlar | Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slaytları) | 12-550-15 | |
| Keçi anti-Car4 | R& D Sistemleri | AF2414 | (1:500) |
| Imaris | Bit düzlemi | piksel tabanlı görüntü analiz yazılımı | |
| Neurolucida 360 + Explorer | MBF Biosciences | 3D vektör tabanlı görüntü analiz yazılımı | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Normal Tavşan Serumu | Equitech-Bio, Inc | SR30 | |
| Olympus FV1000 | (458, 488, 515 dalga boylarına sahip çoklu Argon lazer ve 543 ve 633 yayan ek HeNe lazerler) | ||
| Paraformaldehit | EMD | PX0055-3 | 0.1M PB |
| Tavşan anti-dsRed | Living Colors DsRed Poliklonal Antikor; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) | 632496 | (1:500) |
| Tavşan anti-PLC ve beta; 2 | Santa Cruz Biyoteknoloji | Kedi # sc-206 | (1: 500) |
| Sodyum Fosfat Dibazik Susuz | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodyum Fosfat Monobazik | Fisher Scientific | BP330-500 | |
| tert-Amil alkol | Aldrich Chemical Company | 8.06193 | |
| Doku Kalıpları Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 70180 | |
| Doku-Tek® O.C.T. Bileşik | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | BIO-RAD | # 161-0407 | |
| Zenon ve ticaret; Alexa Flor ve ticaret; 555 Tavşan IgG Etiketleme Kiti | ThermoFisher Scientific | Z25305 | Kit talimatlarını izleyin |
Kaynaklar
- Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7(2006).
- Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
