Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Monoamin nörotransmitterler çok sayıda nörolojik ve psikiyatrik rahatsızlıkla ilişkilidir. Bu tür koşulların hayvan modelleri monoamin nörotransmitter salınımında ve alım dinamiklerinde değişiklikler göstermiştir. Monoamin fonksiyonunu incelemek için elektrofizyoloji, Hızlı Tarama Döngüsel Voltammetri (FSCV), görüntüleme, in vivo mikrodiyaliz, optogenetik veya radyoaktivite kullanımı gibi teknik olarak karmaşık yöntemler gereklidir. Burada sunulan yöntem, monoamin salınımını incelemek için doku tutucular içeren 48 kuyulu bir plaka kullanarak akut beyin dilimlerinde monoamin salınımını tespit etmek için optimize edilmiş iki adımlı bir yaklaşımdır ve monoamin salınım ölçümü için elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) ile birlikte yüksek performanslı sıvı kromatografisidir. Kısaca, prefrontal korteks, hipokampus ve dorsal striatum dahil olmak üzere ilgi çekici bölgeleri içeren sıçan beyin bölümleri bir doku dilimleyici veya vibratom kullanılarak elde edildi. Bu ilgi alanları tüm beyinden parçalandı ve oksijenli bir fizyolojik tamponda kuluçkaya yatırıldı. Deneysel zaman seyri boyunca uygulanabilirlik 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT) tahlili ile incelendi. Akut olarak parçalanmış beyin bölgeleri, ışınlayıcı (amfetamin) veya ekzosytotik veziküler salınımın (KCl) aktivasyonu yoluyla monoamin salınımını indüklediği bilinen çeşitli ilaç koşullarında inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, süpernatanttaki serbest bırakılan ürünler bir HPLC-ECD sistemi aracılığıyla toplandı ve analiz edildi. Burada akut beyin dilimlerinden HPLC ile bazal monoamin salınımı saptanır. Bu veriler, AMPH ve KCl'nin monoamin salınımı yaptığını gösteren önceki in vivo ve in vitro sonuçları destekler. Bu yöntem özellikle monoamin taşıyıcıya bağımlı salınım ile ilişkili mekanizmaları incelemek için yararlıdır ve monoamin salınımı etkileyen bileşikleri hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde tarama fırsatı sağlar.
Giriş
Nörolojik ve psikiyatrik hastalıkların bolluğu, monoamin nörotransmitterinin (dopamin [DA], serotonin [5-HT], norepinefrin [NE]) homeostazının düzensizliği veya yetersiz bakımı ile ilişkilidir1,2,3. Bu durumlar depresyon1,2, şizofreni2, anksiyete2, bağımlılık4, menopoz5,6,7, ağrı8 ve Parkinson hastalığı3'ü i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan işleme ve doku toplama dahil olmak üzere tüm deneyler, 201508873 (UF) ve 1071 (CCNY) onaylı protokole uyarak Florida Üniversitesi ve New York Şehir Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi. Reaktifler ve arabellek için lütfen Tamamlayıcı Dosya'ya bakın.
1. Akut sıçan beyin dilimleri hazırlayın
NOT: Bu deneyde yetişkin erkek sıçanlar (250-350 g) kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu kurulum farklı gelişim noktaları, dişi sıçanlar ve diğer türler için işlevseldir. Fareler gibi daha küçük bir hayvan kullanıyorsanız, deneyci durum başına farklı sayıda be....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu teknik, hplc kullanarak endojen monoaminlerin salınımını ölçmek için beyin dilimlerinin kullanımını, iç doku tutuculu 48 kuyulu bir plakaya dayanan elektrokimyasal algılama ile açıklar. Deneysel kurulum Şekil 1 ve Şekil 2'de tasvir edilir. Başlangıçta, deney sonunda doku canlılığını sağlamak için bir MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür, bir tetrazol) tahlil yapıldı. Fonksiyonel deneylerden sonra, aku.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Monoamin salınım ölçümleri yıllardır heterolog hücreler, nöronal kültürler, beyin sinaptozomları, ex vivo akut beyin dilimleri ve tüm hayvanlar gibi bir dizi sistemde yapılmaktadır13,20,41,42,58,64,65,66,67,68
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların hiçbir açıklaması yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, J.A.P.'ye Fondecyt Başlatma Fonu N 11191049 ve G.E.T.'ye NIH hibeSI DA038598 tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 48 Kuyulu plaka | NA | NA | Testi |
| Asetonitril | Fischer Scientific | A998-1 | Mobil Faz |
| Kalsiyum Klorür Susuz | Sigma Aldrich | C1016 | Modifiye Yapay Beyin Omurilik Sıvısı VEYA Akış Tamponu |
| Netlik Yazılımı | Anetc | ||
| Sitrik Asit | Sigma Aldrich | Mobil Faz | |
| D- (+) - Glikoz | Sigma | 1002608421 | Diseksiyon Tamponu |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Testi |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobil Faz | |
| GraphPad Yazılımı | Graphpad Yazılımı, Inc | İstatistiksel Analiz | |
| Gliserol | Sigma Aldrich | G5516 | Lizis tamponu |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lizis tamponu |
| HPLC, On Yıl Amperometrik | Anetc | HPLC, LC-EC sistemi | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobik Asit | Sigma Aldrich | A5960 | Diseksiyon Tamponu |
| Magnezyum Sülfat | Sigma | 7487-88-9 | KH Tampon |
| Mikrosantrifüj Filtre Üniteleri UltraFree | Millipore | C7554 | Testi - 6 kuyulu plakaya sığacak 48 |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Testi |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Deneyi; protein tahlili |
| Oktanesülfonik asit | Sigma Aldrich | V800010 | Mobil Faz |
| Pargyline Clorohydrat | Sigma Aldrich | P8013 | Modifiye Yapay Beyin Omurilik Sıvısı VEYA Akış |
| Tamponu Fosforik Asit | Sigma Aldrich | Mobil Faz | |
| Potasyum Klorür | Sigma | 12636 | KH Tampon |
| Potasyum Fosfat Monobazik | Sigma | 1001655559 | KH Tampon |
| Presyoner VF-21-0Z | Precissonary | Kompresiyon | |
| Proteaz İnhibitörü Kokteyli | Sigma Aldrich | P2714 | Lizis tamponu. |
| Sodyum Bikarbonat | Sigma | S5761 | Diseksiyon Tamponu |
| Sodyum Bikarbonat | Sigma Aldrich | S5761 | Diseksiyon Tamponu |
| Sodyum Klorür | Sigma | S3014 | KH Tampon |
| Sodyum Dodesil Sülfat | Sigma Aldrich | L3771 | Lizis tamponu |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Testi / Lizis tamponu |
Kaynaklar
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
