Histotripsi ve Litik İlacın Trombolitik Etkinliğini Ölçmek için Bir In vitro Sistem

Tromboz, dolaşımı engelleyen sağlıklı bir kan damarında pıhtı oluşumu durumudur^1,2. Venöz tromboembolizm yıllık sağlık maliyeti 7-10 milyar dolar, Amerika Birleşik Devletleri'nde 375.000-425.000 vaka^{ile 3}. Pulmoner emboli pulmoner arterin tıkanmasıdır ve venöz tromboembolinin en ciddi sonucudur. Pulmoner tıkanıklığın birincil kaynağı, öncelikle iliofemoral venöz segmentlerden⁴,^5,6. Derin ven trombozu (DVT), akciğer tıkanıklıklarının yanı sıra, ağrı, şişlik, bacak ülserasyonları ve uzuv amputasyonları ile sonuçlanan uzun süreli komplikasyonlarla birlikte doğal sekellere sahiptir^7,8,9. Kritik tıkanıklıklar için kateter yönlendirilmiş trombolitikler (CDT) damar rekanalizasyonu için ön cephe yaklaşımıdır^10. CDT'nin sonucu trombüs yaşı, konumu, büyüklüğü, bileşimi, etiyolojisi ve hasta riski kategorisi¹¹dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlıdır. Ayrıca, CDT vasküler hasar, enfeksiyonlar, kanama komplikasyonları ve uzun tedavi süresi ile ilişkilidir¹⁰. Yeni nesil cihazlar mekanik trombektomiyi trombolitiklerle (yani farmakomekanik trombektomi)^{birleştirmeyi amaçlamaktadır 12,13}. Bu cihazların kullanımı, kanama komplikasyonlarının azalmasına yol açan litik dozrayı düşürür ve CDT'ye kıyasla tedavi süresini^12,13,14 kısaltır. Bu cihazlar hala hemorajik yan etkiler ve kronik trombrombinin eksik çıkarılması sorunlarını korur¹⁵. Bu nedenle, trombüsleri daha düşük kanama komplikasyonlarıyla tamamen çıkarabilecek bir yardımcı stratejiye ihtiyaç vardır.

Potansiyel yaklaşımlardan biri histripsi destekli trombolitik tedavidir, lizotripsi olarak adlandırılır. Histotripsi, dokulardaki kabarcık bulutlarını çekirdeklendirmek için odaklanmış ultrason kullanan invaziv olmayan bir tedavi yöntemidir¹⁶. Kabarcık aktivitesi eksojen çekirdekler yoluyla değil, pıhtı^17,18dahil olmak üzere dokulara çekirdek içsel etkinleştirmek için yeterli gerilime sahip ultrason darbelerinin uygulanması ile üretilir. Kabarcık bulutunun mekanik salınımı pıhtıya gerilme verir ve yapıyı hücresel döküntülere ayırır¹⁹. Histotripsi kabarcık aktivitesi, geri çekilen ve geri çekilmemiş kan pıhtılarının hem in vivo hem de in vitro^{20 , 21,22}'nin etkili bir şekilde bozulmasını sağlar. Önceki çalışmalarda^histotripsive liktik rekombinant doku tipi plazminojen aktivatörün (rt-PA) kombinasyonunun sadece litik veya histtripsi ile karşılaştırıldığında tedavi etkinliğini önemli ölçüde artırdığını^{göstermiştir.} Histotripsi kabarcık aktivitesi ile ilişkili iki birincil mekanizmanın iyileştirilmiş tedavi etkinliğinden sorumlu olduğu varsayılmıştır: 1) gelişmiş litik doğuma bağlı olarak artan fibrinoliz ve 2) pıhtı içindeki kırmızı kan hücrelerinin hemolizi. Pıhtı kütlesinin büyük kısmı kırmızı kan hücrelerinden oluşur²⁴ve bu nedenle eritrosit bozulmasını izlemek, numunenin ablasyonu için iyi bir taşıyıcıdır. Diğer oluşan pıhtı elementleri de histotripsi kabarcık aktivitesi altında parçalanır, ancak bu protokolde dikkate alınmaz.

Burada, DVT in vitro'yu lizotripsi ile tedavi etmek için bir benchtop yaklaşımı özetlenmiştir. Protokolde histotripsi kaynağının kritik çalışma parametreleri, tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi ve görüntü rehberliği açıklanmaktadır. Protokol, iliofemoral venöz bir segmenti taklit etmek için bir akış kanalı tasarlamayı ve insan bütün kan pıhtılarını üretmeyi içerir. Deneysel prosedür, akış kanalına yerleştirilen pıhtı boyunca histtripsi maruziyetini elde etmek için histtripsi kaynağının ve görüntüleme dizisinin konumlandırılmasını özetlemektedir. Pıhtı bozulmasına ve hedef dışı kabarcık aktivitesini en aza indirmek için ilgili insonasyon parametreleri tanımlanmıştır. Kabarcık aktivitesinin yönlendirilme ve değerlendirilmesi için ultrason görüntülemenin kullanımı gösterilmiştir²⁴. Pıhtı kütle kaybı, D-dimer (fibrinoliz) ve hemoglobin (hemoliz) gibi tedavi etkinliğini ölçmek için metrikler^{23 , 24,25,26,27}olarak özetlenmiştir. Genel olarak, çalışma DVT tedavisinde lizotripsi etkinliğini yürütmek ve değerlendirmek için etkili bir araç sağlar.

Burada sunulan sonuçlar için, yerel iç inceleme kurulundan (IRB #19-1300) onay alındıktan sonra pıhtı oluşturmak için venöz insan kanı çekildi ve gönüllü bağışçılar tarafından sağlanan yazılı bilgilendirilmiş onay²⁴. Bu bölümde, lizotripsi etkinliğini değerlendirmek için bir tasarım protokolü özetler. Protokol, Bollen ve ark.^24'ünönceki bir çalışmasına dayanmaktadır.

1. Pıhtı modellemesi

NOT: Pıhtı stabilitesini sağlamak ve geri çekilmeyi en üst düzeye çıkarmak için pıhtıları 2 hafta içinde ancak deney gününden 3 günden daha önce hazırlayın²⁸. Pıhtıyı yerel kurumsal inceleme kurulundan onay aldıktan sonra hazırlayın.

1. Kanı depolamak için borosilikat Pasteur pipeti hazırlayın (pipet özellikleri için Malzeme Tablosu'na bakın). Trombosit aktivasyonunu ve pıhtı geri çekilmesini destekleyen malzemenin hidrofilik yapısı nedeniyle borosilikat tüpler kullanılır^29. Pipet ucunu bir Bunsen brülörü üzerinde ısıtma yoluyla kapatın.
2. Taze insan venöz kanı çizin. İstenen pıhtı başına 2 mL artışlarla çekilen toplam kanı aliquot. Her 2 mL aliquot'ı bir Pasteur pipete aktarın.
   NOT: Pipetlere aktarmadan önce kanın pıhtılaşmaması için 1.2 adımını yaklaşık 3 dakikalık kan çekimi içinde uygulayın. Ayrıca, gönüllü donörün pıhtılaşma kaskadını değiştirebilecek herhangi bir ilaç kullanmamasını sağlayın (örneğin kan sulayıcılar veya trombosit inhibitörleri).
3. Pipetlerin içindeki kan aliquotlarını (gerekli pıhtı sayısına eşit) 37 °C'de 3 saat boyunca bir su banyosunda kuluçkaya yatırın.
4. Pıhtıların geri çekilmesine izin vermek için pipetleri 4 °C'de en az 3 gün saklayın²⁸. Pıhtılar geri çekilirken, serumun pipet içindeki pıhtının üstünde biriktiği gözlenecektir. Pıhtıların RT-PA yanıtı geri çekilmeden sonra 2 hafta boyunca sabit kalır²⁸.

2. Su deposu hazırlama

1. Su haznesini ters ozmos suyu ile doldurun. Tedavinin veya görüntüleme ultrason darbelerinin yansımasını azaltmak için tankın alt yüzeyini akustik bir emici malzeme ile hizalayın. Kabarcık çekirdeğini en aza indirmek için suyu gazdan arındırmak ve filtrelemek için bir su taşıma sistemi kullanın.
   NOT: Suyu filtrelemenin bir yolu satır içi filtre kullanmaktır. Temsili sonuçların oluşturulmasında kullanılan torbanın özellikleri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
2. Tankın alt yüzeyine iki ısıtma elemanı yerleştirin. Maksimum liktik enzmatik aktiviteyi elde etmek için suyu 37,3 °C'ye ısıtın³⁰.
3. Şekil 1A'da gösterildiği gibi bir akış kanalı kur. Akış kanalı, bir iliofemoral damarın malzeme ve geometrik özelliklere sahip bir model kap, plazma rezervuarı ve rezervuarın distal en ucunda bir şırıngdan oluşur (Malzeme Masası). Şırınna, deney sırasında kanaldan bir akışı düzenlemek için bir pompaya bağlanır.
4. Gaz giderme/filtreleme/ısıtma aşamasında (adım 2.1 ve 2.2) kanalı fizyolojik sıcaklığa getirmek için akış kanalını su deposuna manuel olarak batırın.

3. Plazma ve rt-PA karışımının hazırlanması

1. Deney gününden önce
   NOT: -80 °C'de depolandığında, plazma en az 2,5 yıl³¹ ve rt-PA en az 7 yıl³²stabildir. Bu nedenle, iki bileşenin kararlılığını sağlamak için bu süreler içinde her zaman 3.1 adımını uygulayın.
   1. Bir üreticiden elde edilen rt-PA'yı toz halinde steril suda 1 mg/mL'ye seyreltin.
   2. Aliquot 100 μL seyreltilmiş rt-PA 0,5 mL santrifüj tüplere aktarın ve -80 °C'de saklayın.
   3. 50 mL santrifüj tüplerde aliquot 35 mL insan taze dondurulmuş tip O plazma. Tüpleri -80 °C'de saklayın.
2. Deney gününde
   1. Dondurucudan plazma aliquots alın. O gün test edilecek pıhtı sayısı kadar aliquot alın. Donmuş aliquotları çözülmesi için 37 °C'de bir su banyosuna daldırın (~10 dk).
   2. Plazma çözüldükten sonra, ultra saf su ile üç ayda bir durulanan bir kabın içine dökün. Kirlenmeyi önlemek için kabın ağzını alüminyum folyo ile hafifçe kapatın ve beheri su banyosuna yerleştirin. Folyonun, havanın plazmaya temas etmesine izin sağlayacak kadar gevşek olmasına izin verin.
   3. Plazmanın 37 °C'de atmosferik basınca en az 2 saat boyunca dengelensin.
   4. Donmuş rt-PA şişelerini çıkar ve her deney çalışması için bir şişe ile ihtiyaç duyulana kadar buza yerleştirin.
   5. Agarose'u ultra saf suda eriterek 50 mL'lik bir şişede düşük jelleşme agarose (%2) yapın. Analiz edilecek her numune için yaklaşık 2 mL mevcut olacak şekilde toplam agarose çözeltisi miktarını seçin. Çözeltiyi bir mikrodalga fırında kabarcıklı olana kadar şişe halinde ısıtın. Matarayı su geçirmez bir vida kapağı ile sabitleyin. Şişeyi plazmanın yanında su banyosuna batırın.
      NOT: Bu adım, histotripsi inzozyonu sonrasında histoloji analizi için maruz kalan pıhtı segmentlerini güvence altına almak için agarose kullanılabilir olmasını sağlar.

4. Histotripsi kaynağı ve görüntüleme dizisinin kurulması

1. Motorlu konumlayıcıların, üretici tarafından sağlanan yol tarifleri ve komutlar kullanılarak bir programlama platformunun çalışma zamanı ortamından kontrol edilebildiğinden emin olun. Sistemin motorlarının çalışma zamanı ortamıyla bilgisayarın uygun bağlantı noktasına bağlı olup olmadığını kontrol edin.
2. Histotripsi kaynağını Şekil 1B'degösterildiği gibi motorlu konumlandırma sistemine monte edin.
3. Histotripsi kaynağını, üretici tarafından belirtilen uygun konektörler (örneğin, BNC kabloları) aracılığıyla sürüş elektroniği (örneğin, güç amplifikatörü ve fonksiyon jeneratörü) bağlayın.
   NOT: Histotripsi kaynağının sürüş elektroniği, 4.1 adımında kullanılan çalışma zamanı ortamı üzerinden kontrol edilebildiğinden emin olun.
4. Görüntüleme dizisini bir prob kapağı ile örtün ve şekil 2'degösterildiği gibi diziyi histotripsi kaynağının diyaframına koaksikal olarak yapıştırın. Histotripsi kaynağının yönüne göre görüntüleme düzleminin yönünü anladığından emin olun.
5. Görüntüleme dizisini ultrason tarama sistemine bağlayın. Bu sistemin görüntüleme dizisinin çalışmasını ve tetiklemesini denetleyebildiğinden ve tarayıcının üreticisi tarafından sağlanan komutlara göre görüntüleme verilerini toplayabildiğinden emin olun.
6. Şekil 1A'dagösterildiği gibi gazdan arındırırken histotripsi kaynağını/görüntüleme dizisini tanka batırın. Histotripsi kaynağının veya görüntüleme dizisinin yüzeyinden bir şırıng kullanarak hava kabarcıklarını yavaşça çıkarın.
   NOT: Operasyondan önce histotripsi kaynağını ve görüntüleme dizisini tamamen suya batırın. Histotripsi kaynağının yüzeyine dokunmaktan kaçının.
7. Görüntüleme dizisini ve tarayıcının yerleşik komutlarını kullanarak saniyede 20 kare hızında B modu görüntüler elde edin. Bu gerçek zamanlı görüntülerde histotripsi kaynağının odağının görselleştirilmesini sağlamak için görüntüleme penceresini ayarlayın.
   NOT: Terapötik kaynağın odak bölgesinin boyutlarının bilindiği varsayılıyor.
8. Histotripsi kaynağının çalışma parametrelerini ayarlayın, temel frekans (örneğin, 1,5 MHz), darbe tekrarlama frekansı (örneğin, 20-100 Hz), darbe süresi (örneğin, nabız başına 1-20 döngü) ve konum başına toplam darbe sayısı (örneğin, 100-2.000)^18,23,24,33. Yeterli pıhtı lizisi elde edilemezse veya kabarcık aktivitesi model kabın lümeninin ötesine uzanıyorsa bu parametreleri değiştirin. Bu parametreleri ayarlamak için, kaynağın üreticisi tarafından sağlanan protokolü kullanın veya kaynakla iletişim kurabilen bir programlama platformu kullanın (Adım 4.3).
9. 4.8. adımda kullanılan üreticinin protokolünü veya programlama platformunu kullanarak, histotripsi kaynağını ayarlanan parametrelerde, çevrede herhangi bir engel olmadan, yalnızca gazsız suda çalıştırın. Bir kabarcık bulut oluşana kadar histotripsi kaynağına uygulanan voltajı artırın.
10. 4.7 adımının gerçek zamanlı görüntülemesini kullanarak, kabarcık bulut yaklaşık olarak görüntü penceresinin ortasına yerlenene kadar görüntüleme dizisinin konfokal dönüştürücü açıklığının içindeki konumunu ayarlayın. Kabarcık bulut, görüntüleme düzleminde hiperekoik piksellerin bölgesidir (Şekil 3). Görüntüleme dizisini dönüştürücü açıklığında sıkıca tutmak için vidaları sıkın.
    NOT: Dizi düzgün hizalanmışsa, kabarcık bulutunun azimuthal konumu görüntüleme düzleminde yaklaşık 0 mm olmalıdır. Görüntüleme dizisi terapi kaynağının iç yüzeyinden biraz yansıtılabilir ve bu nedenle kabarcık bulutunun aralık konumu kaynağın odak uzunluğundan farklı olabilir.
11. Görüntüleme düzleminde kabarcık bulutunun konumunu tanımlayın. Histotripsi kaynağının odağını kabarcık bulutunun merkezi olarak atayın (Şekil 3).
12. Algılanan odak konumunu (adım 4.11) görüntüleme penceresine kaydedin (Şekil 3). Odak konumunu işaretlemenin olası bir yolu, görüntüleme platformunda varsa, görüntüleme penceresindeki konumu not etmek için bir imleç yerleştirmektir.
13. İnzotasyonu durdurun ve histotripsi kaynağına uygulanan voltajı 0 V olarak ayarlayın.

5. Pıhtı hazırlığı

1. Kapalı ucu pense ile keserek pipetten pıhtıyı çıkarın. Pıhtının serumla birlikte bir Petri kabına kaymasına izin verin. Pıhtı yerinden çıkmazsa, pıhtıyı çıkarmak için salin yıkama yoluyla pipetin diğer ucundan hafifçe basınç uygulayın.
2. Pıhtıyı neşter kullanarak 1 cm uzunluğa kesin, merkezden tek tip bir parça hedefleyin (yani pipet üst veya alt kısmında oluşan pıhtı bölümlerinden uzağa).
3. Fazla sıvıyı çıkarmak için pıhtının kesilmiş bölümünü hafifçe lekelamak için bir temizleme mendili kullanın.
4. Cımbız kullanarak pıhtı bölümünü hafifçe tartım ölçeğine yerleştirin ve ağırlığı kaydedin.
5. Akış kanalını su deposundan manuel olarak çıkarın ve model kabı akış kanalından çıkarın.
6. Pıhtıyı cımbız kullanarak model kabına yerleştirin ve model kabı tekrar akış kanalına takın.
   NOT: Pıhtının akış nedeniyle akıntıya karşı hareket etmesini önlemek için model kabın içine bir naylon çubuk yerlenebilir.
7. Akış kanalını, hazneye göre sahnenin proksimal ucu distal tarafa göre düşük olacak şekilde tanka ovan. Aşamanın bu şekilde anglingi, 6.1. adımda plazma akış kanalından çekildiğinde kabarcıkların model kapta sıkışmasını önler.
8. Bir pipet kullanarak rezervuara 30 mL plazma ekleyin ve sıcaklığı en az 36 ° C'ye ulaşana kadar izleyin.
9. Rt-PA'yı (30 mL plazmada 80,4 μg, plazma rezervuarına 2,68 μg/mL) dağıtmak için bir pipet kullanın. Rezervuar içinde düzgün bir rt-PA dağılımı sağlamak için plazmayı pipetle karıştırın.

6. Akış kanalının astarı

1. Plazma, model kabı doldurana kadar şırınna pompası aracılığıyla rezervuardan akış kanalına plazma çekin.
   NOT: Pıhtı naylon çubukla yıkanmazsa, plazmayı pıhtıyı aşağı doğru zorlamaya veya şırınnayı manuel olarak çekmeye çalışmak için 60 mL / dak'ta kısa pompa çekmeleri kullanın. Bu işlemde çekilen plazma miktarını sınırlayın veya akış kanalında 30 mL çözelti sağlamak için ek plazma/rt-PA kullanarak rezervuarı yeniden doldurun.
2. Motorlu konumlayıcıları kullanarak, görüntüleme komut dosyasını kullanarak görüntüleme dizisini pıhtının uzunluğuna paralel hizalayın (adım 4.7). Paralel hizalama, kullanıcının pıhtının uygun şekilde yerleştirilmesini ve model kabın içindeki kabarcıkların yokluğunu görsel olarak sağlamasını sağlar.
3. Modelleme penceresini kullanarak model kabını manuel ve görsel olarak düzleştirmeyin ve hava kabarcıklarının bulunmadığından emin olun (adım 4.7).

7. Deney prosedürü

1. Ön tedavi
   NOT: Bu adım, pıhtı uzunluğu boyunca tek tip histtripsi maruziyeti için histotripsi kaynağı/görüntüleme dizisi için bir yol planlamaktır.
   1. Görüntüleme düzlemini pıhtının kesitine paralel olacak şekilde motorlu konumlayıcıları kullanarak görüntüleme dizisini hizalayın (yani, adım 6.2'de açıklanan yönlendirmeye dik).
   2. Görüntüleme penceresi (adım 4.7) aracılığıyla rehberlik altında, motorlu konumlayıcıları kullanarak histtripsi kaynağını pıhtının proksimal ucuna doğru hareket ettirin. Bu noktada, histotripsi kaynak konumunu, adım 4.12'deki işaretli odak noktasının pıhtının merkeziyle hizalanacak şekilde ayarlayın.
   3. Pıhtı uzunluğu boyunca insonasyon yolunu belirleyin. Bu yolu tanımlamak için, pıhtının uzunluğu boyunca üç yol noktası (yani histotripsi kabarcık aktivitesinin pıhtı içinde bulunduğu motorların konumları) 5 mm'lik artışlarla ayarlayın. Yol noktalarını, histotripsi kaynağının yol boyunca genel hareketinin sistemdeki akışla antegrad olacak şekilde hizalayın (yani, ilk yol noktası pıhtının rezervuara göre en proksimal ucundadır ve üçüncü ara nokta rezervuara göre distal konumdadır).
   4. Her bir ara noktayı tamamlamadan önce, histotripsi kaynağından 4.8. Pıhtı içinde kabarcık aktivitesi içermek için gerekirse motorlu pozisyonerleri kullanarak histotripsi kaynağının konumunu ayarlayın.
   5. Her ara noktada, 4.1 adımına benzer şekilde üretici tarafından sağlanan komutları kullanarak motor konumlarını kaydedin.
2. Muamele
   NOT: Bu adım, pıhtıyı tedavi öncesi adımda tanımlanan yola göre uzunluğu boyunca tedavi etmek için prosedürü tanımlar.
   1. Şırıng pompasını 0,65 mL/dk'da çalıştırın ve plazmanın menisküslerinin hareket etmesini bekleyin. Bu akış hızı, iliofemoral vaskülatın neredeyse toplam tıkanmasını taklit eder^24,34.
   2. 7.1.3 adımında oluşturulan yolu, sabit adım boyutuna (örneğin, 0,5 mm) sahip yerleşik ara noktalar arasındaki ara adımlarla enterpolasyona geçin. Adım boyutu, pıhtı uzunluğu (görüntüleme dizisinin yükseklik yönü) boyunca ölçülen odak bölgesinin genişliğinin yarısından daha küçük olacak şekilde seçilir. Histotripsi kaynağını, adım 4.8'de tanımlanan insonasyon parametreleriyle her yol konumunda motorlu konumlayıcılar kullanarak hareket ettirin.
   3. Görüntüleme penceresini kullanarak her yol konumunda histotripsi darbesinin uygulanması sırasında monitör/görüntü kabarcık aktivitesi (adım 4.7). Azimut ve aralıkta 15 mm'yi kaplayan görüntü boyutlarıyla görüntüyü histotripsi odağında ortala. Her yerde histotripsi darbesinin uygulanmasından önce, bir programlama platformunda bir komut dosyası oluşturarak pıhtı ve model kabının görselleştirilmesini sağlamak için B modu bir görüntü elde edin. Komut dosyasının üreticinin komutlarını kullanarak tarayıcıyla iletişim kurduğundan emin olun.
   4. Histotripsi darbesinin uygulanması sırasında, geçici³⁵sonrası pasif kavitasyon görüntüleri oluşturmak için 7.2.3 adımında senaryoda akustik emisyonların edinimini uygulayın. Her 10 tedavi darbeden sonra bir pasif kavitasyon görüntüsü alın. Görüntüleme derinliğinin sonuna kadar 8 artımlı derinlikte 50 sabit zaman kazanç telafisi uygulayın. Pıhtıdan gelen sinyalin tamamının pencereleme nedeniyle minimum enerji kaybı ile yakalanması için uygun bir alım penceresi boyutu seçin³⁵.
   5. Hedef dışı kabarcık bulutları varsa, dönüştürücü konumunu motorlu konumlayıcılarla yerinde ayarlayın.
      NOT: Görüntüleme dizisinin kaçırılan tetikleyicilerini izleyin. Sonraki tetiklemeden önce verilerin depolanmasının tamamlandığından emin olmak için alınan görüntüleme veri kümelerinin sayısını ayarlayın.

8. Deney sonrası prosedür

1. Perfüzyonu yerçekimi yoluyla boşaltmak için model kabı su deposundan manuel olarak kaldırın. Pıhtının boşaltma sırasında model damardan aşağı ve dışarı hareket etmesini önlemek için akış kanalını düz tuttuğunuzdan emin olun.
2. Plazma çözeltisini çok düşük bir akış hızında şırınna pompasından geçirerek küçük bir beherde(Şekil 4A)daha fazla analiz için tüm perfüzatı toplayın.
3. Model kabın bağlantısını kesin ve pıhtıyı çıkarın. Gerekirse, pıhtıyı hafifçe yerinden çıkarmak için model kabına az miktarda salin enjekte edin.
4. Pıhtıyı adım 1.2.3'e benzer şekilde silin. Pıhtı kütle kaybını değerlendirmek için pıhtıyı tartım ölçeğinde tartın.
5. D-dimer içeriğini analiz etmek için, bir mikrosantrifüj tüpüne 100 mg aminocaproik asit ekleyin ve ardından 1 mL perfüzyon ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Örnek³⁶içindeki D-dimer'ı ölçmek için lateks immün-türbidimetrik bir test gerçekleştirin.
6. Hemolizi değerlendirmek için santrifüj tüplerine 1 mL perfüzyon ekleyin ve 10 dakika boyunca 610 x g'da (3.500 rpm) döndürün. Şekil 4B'degösterildiği gibi 200 μL'yi kuyu plakalarına aktarın. Absorbansı 540 nm, Şekil 4C'de (Drabkins tahlil³⁷⁾okumak için bir plaka okuyucu kullanın.
7. Histoloji değerlendirmesi
   1. Pıhtının merkezinden bir neşterle yaklaşık 2-3 mm uzunluğunda bir bölüm kesin.
   2. Bölümü bir kasete ekleyin. Histotripsi darbe yayılımının yönüne göre bölümün yönünü koruyun.
   3. Pıhtıyı yerinde sabitlemek için kasete 3.2.5 adımında hazırlanan 2 mL düşük jelleşmeli agarose çözeltisi ekleyin.
   4. Numuneyi 24 saat boyunca %10 formalin olarak sabitle. Numuneyi 24 saat sonra% 70 alkole yerleştirin ve standart hemotoksilin-eosin boyama³⁸gerçekleştirin.

9. Pasif kavitasyon görüntü analizi

1. Histotripsi uyarılması sırasında görüntüleme dizisinden elde edilen sinyalleri (adım 7.2.4), her tedavi yerinde kabarcık bulutu tarafından oluşturulan akustik emisyonların bir görüntüsünü oluşturmak için sağlam Capon beamformer^39'u temel alan bir algoritma kullanarak işleyin.
   NOT: Nicel görüntüler oluşturmak için Haworth ve ark.³⁵'te açıklanan adımları izleyin. Aksi takdirde, görüntüdeki her piksel değeri, ilgili her konumdaki göreli kabarcık bulut akustik enerjisini (V²birimleri) temsil etmelidir.
2. Pıhtıyı temsil eden pikseller ile model kabını ayırt etmek için 7.2.3 adımlarında talep edilen B modu görüntüsünü segmentlere ayırın.
3. Şekil 5B'degösterildiği gibi pasif kavitasyon görüntüsünü B modu görüntüsüyle birlikte kaydedin. Maruz kalma süresi boyunca pıhtı içindeki akustik enerjiyi özetler³⁵.

Bu çalışmada özetlenen protokol, dvt in vitro kurulumunda venöz pıhtı modellemesi, pıhtı bozulması için lizotripsi ve ultrason görüntülemenin ayrıntılarını vurgulamaktadır. Benimsenen prosedür, rt-PA ve histotripsi kabarcık bulut aktivitesinin kombine etkileri nedeniyle pıhtı bozulmasını değerlendirmek için gerekli adımları göstermektedir. Tezgah üstü kurulumu, venöz iliofemoral damarın özelliklerini taklit etmek için tasarlanmıştır. Şekil 1A, iliofemoral damarın akustik, mekanik ve geometrik özelliklerine sahip bir model damar göstermektedir. Pıhtı, kısmen tıkayıcı bir trombüs taklit etmek için model kabın içine yerleştirilir. Pıhtı, 0,65 mL/ dk hızında bir rezervuardan çekilen plazma ve rt-PA ile perfüzyona edilir. Bu hız, yüksek tıkalı bir gemi34'tekiyavaş akış hızı ile tutarlıdır.

Şekil 1B'de belirtildiği gibi konumlandırma sistemine 9 cm ana eksen, 7 cm minör eksen ve 6 cm odak uzaklığı ( Şekil 2A ) ile1,5MHz temel frekansta eliptik olarak odaklanmış bir dönüştürücü monte edilir. Ultrason jeli ve lateks kapakla kaplı bir görüntüleme dizisi (Şekil 2B, C) histotripsi kaynağının merkezindeki bir açıklık aracılığıyla Şekil 1A'da gösterildiği gibi dönüştürücü ile koaksikal olarak monte edilir. Motorlu pozisyonerler, model damar içindeki pıhtı uzunluğu boyunca tedavi dönüştürücü/görüntüleme dizisini çevirmek için kullanılmıştır(Şekil 1). Histotripsi kaynağına yeterli voltaj uygulanması üzerine, dönüştürücünün odak bölgesinde bir kabarcık bulutu üretilir ve Şekil 3'tegösterildiği gibi ultrason görüntüleme ile görselleştirilir. Odak konumu, görüntüleme düzlemi kullanılarak kabarcık bulutunun merkezi olarak tanımlanır (adım 4.10-4.11).

Şekil 4A iki farklı tedavi durumu için toplanan perfüzyonları göstermektedir. Kontrol olarak etiketlenen beher, sadece plazmaya maruz kalan bir pıhtının perfüzyonını içerir. Tedavi olarak etiketlenen ikinci beher, lizotripsi ile tedavi edilen pıhtının perfüzyonını içerir. Toplanan perfusatlar, protokolde belirtildiği gibi tahliller aracılığıyla hemoglobin (hemoliz metriği) ve D-dimer (fibrinoliz ölçümü) içeriğini değerlendirmek için kullanılır. Perfusates renk farkı, optik absorbans ile ölçülebilen hemoglobin konsantrasyonunda değişkenliğe neden olur. Absorbans değeri ile hemoglobin konsantrasyonu arasındaki ilişki kalibrasyon eğrisi ile belirlenebilir. 0 (boş ölçüm) ile 180 mg/mL arasında bilinen hemoglobin içeriğine sahip çözeltiler kuyu plakasına yerleştirilir ve plaka okuyucu kullanılarak üç taraflı olarak emicilik belirlenir (Şekil 4B,C). Plaka okuyucunun üst absorbans sınırı değişebilir ve çözümlerin kuyu plakasında yapılmasına a priori olarak bilinmeyebilir. Bu nedenle, kuyu plakasında 180 mg / mL'ye kadar hemoglobin konsantrasyonları yapılır, Şekil 4B. Bununla birlikte, burada kullanılan plaka okuyucu sadece 23 mg / mL'ye kadar konsantrasyonlar için emiciliği okuyabilir, Şekil 4C.

Şekil 5A, 7.2.3 adımında belirtildiği gibi histtripsi maruziyeti öncesinde B-mod görüntüleme yoluyla model damar içindeki pıhtının görselleştirilmesini göstermektedir. Bu görüntü, pasif kavitasyon görüntüsünün segmentasyonu için pıhtı konumunu belirlemek için elde edilir. Şekil 5B, histotripsi maruziyeti öncesinde elde edilen B modu görüntüsüyle birlikte kaydedilen pasif kavitasyon görüntüsünü göstermektedir. Bu şekil, histtripsi maruziyeti sırasında akustik enerjinin öncelikle pıhtının içinde bulunduğunu doğrulamaz.

Histtripsi ve litik nedeniyle tipik pıhtı bozulması Şekil 6'da belirtilmiştir. Şekil 6A,B sırasıyla tedavi edilmemiş ve lizotripsi tedavi edilen pıhtı görüntülerini göstermektedir. Histoptripsi maruz kalan örnekler için, bozulma öncelikle pasif kavitasyon görüntüleme ile izlenen kabarcık aktivitesinin gözlemlenen konumları ile tutarlı olarak pıhtı merkezi ile sınırlıdır (Şekil 5B). Bununla birlikte, litik ilavesiyle, pıhtının çevresine daha yakın bölgelerde de kitle kaybı meydana gelir. Bu ek kütle kaybının, kabarcık aktivitesi altında litiğin gelişmiş sıvı karıştırmasına bağlı olduğu varsayılır. Sıvı karıştırma, litiğin pıhtıya dağılımını ve penetrasyon derinliğini arttırır. Litik fibrinolizden sorumlu olduğundan40, kitle kaybı artar. Fibrinoliz, perfüzyon41'dekiD-dimer içeriği ölçülerek ölçülebilir.

Şekil 1: İnsan kanı pıhtısının lizotripsi için deneysel kurulum. (A)Kurulumun bileşenleri (1) eliptik geometriye sahip odaklanmış histotripsi kaynağı, (2) lateks kaplı görüntüleme dizisi, (3) akış kanalına bağlı model kap, (4) akış kanalı, (5) rezervuar, (6) akustik emici malzeme, (7) ısıtma elemanı ve (8) gazsız ve ısıtılmış ters ozmos suyu ile dolu su deposudur. Görüntüleme düzleminin azimut boyutu, yükseklik ve aralık boyutlarına (sayfaya) diktir. (B) Motorlu konumlandırma sistemine monte edilen histotripsi kaynağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ultrason kaynağı ve görüntüleme bileşenleri. (A)odaklı histotripsi kaynağı, (B) görüntüleme dizisi ve (C) görüntüleme dizisinin ultrason jeli ve lateks kapaklı bireysel yakınlaştırılmış görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Histotripsi kabarcık bulut görüntüleme dizisi kullanılarak görselleştirilmiştir. Histotripsi kaynağının odak bölgesinde bir kabarcık bulutu oluşturulur ve bir görüntüleme dizisi kullanılarak görüntülenmiştir. Haç olarak gösterilen belirlenen odak, tedavi planlaması için kaydedilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Pıhtı lizisi nedeniyle salınan hemoglobin nicelemesi. (A) Sadece plazma ile yapılan kontrol çalışmasının ardından toplanan perfüzat örnekleri (histotripsi veya litik yoktur) ve tedavi kolu, histtripsi (örneğin, 35 MPa tepe negatif basınç, 5 çevrim darbe süresi, 1,5 MHz temel frekans) ve 2,68 μg/mL lytik maruziyet. (B) 180 mg/ mL (üst sıra, en sol-en köşe) ila 0 mg / mL (alt sıra, en sağ köşe) arasında bilinen hemoglobin konsantrasyonlarının seyreltmelerini içeren kuyu plakası. Ok ucu hemoglobin konsantrasyonu azalmaya işaret eder. (C) Bu örnekler spektrofotometri yoluyla histotripsi maruziyeti nedeniyle üretilen hemoglobiyi ölçmek için standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. 0 ile 23 mg/mL arasında değişen hemoglobin konsantrasyonları için absorbans eğrisi, plaka okuyucunun daha yüksek konsantrasyonları analiz etmedeki sınırlaması nedeniyle elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tedavi sırasında pıhtının görüntüleri. (A) Tedavi darbesi başlamadan önce elde edilen B-mod görüntüsü, model damar içindeki pıhtı pozisyonunu gösterir. (B) Histotripsi darbesinin uygulanmasından önce elde edilen pıhtının B modu görüntüsü ile birlikte kaydedilen sıcak renk haritasında gösterilen pasif kavitasyon görüntülemesinden hesaplanan geçici enerji emisyonunun geçici görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Ablated pıhtının farklı tedavi koşullarında histolojisi. (A) Tedavi olmadan pıhtıyı kontrol edin. (B) Lizotripsi ile tedavi edilen pıhtı (örneğin, 35 MPa tepe negatif basınç, tek çevrim darbe süresi, 1,5 MHz temel frekans). Histotripsi darbesi bu görüntüde yukarıdan aşağıya doğru yayıldı. Pıhtının uzunluğu boyunca histotripsi kaynağının yolu (yani burada gösterilen görüntünün düzlemine dik) 7.2.3 adımında tanımlanmıştır. Mikrografların ölçeği 2 mm'dir. Burada elde edilen pıhtı bozulması derecesinin, daha uzun nabız süresine sahip insonasyon şemalarına kıyasla azaltılacağını unutmayın24. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.