Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

4.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62136

⸱

7 Ağustos 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, farelerdeki bir yara enfeksiyonundan bakteriyel dağılımı değerlendirmek için ex vivo ve in vivo yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, topikal antimikrobiyal ve anti-biyofilm tedavilerinin etkinliğini test etmek veya farklı bakteri suşlarının veya türlerinin dağılım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Biyofilme bağlı enfeksiyonlar, iyileşmeyen diyabetik ayak ülserleri, kronik sinüzit, tekrarlayan otitis media ve daha fazlası gibi çok çeşitli kronik durumlara bulaşmıştır. Bu enfeksiyonların içindeki mikrobiyal hücreler, antibiyotiklerin ve konak bağışıklık hücrelerinin enfeksiyonu temizlemesini önleyebilen hücre dışı polimerik bir madde (EPS) ile korunmaktadır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar potansiyel terapötikler olarak dispersiyon ajanları geliştirmeye başladılar. Bu ajanlar biyofilm EPS içindeki çeşitli bileşenleri hedef alarak yapıyı zayıflatır ve teorik olarak antibiyotik gücünü ve bağışıklık açıklığını artırabilen bakterilerin dağılmasını başlatır. Dispersiyon ajanlarının yara enfeksiyonları için etkinliğini belirlemek için, biyofilm dispersiyonunu ölçen protokoller geliştirdik hem ex vivo hem de in vivo . Biyofilm ile ilişkili kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için iyi tanımlanmış bir fare cerrahi eksizyon modeli kullanıyoruz. Dispersiyon in vivoizlemek için, yaralara luciferaz eksprese bakteriyel suşları bulaştırırız. Olgun enfeksiyonlar ortaya çıktıktan sonra, yaraları biyofilm EPS bileşenlerini bozan enzimler içeren bir çözelti ile sularız. Daha sonra elde edilen dağılım seviyesi hakkında bilgi sağlamak için yara ve filtreleme organlarındaki parlaklık sinyalinin yerini ve yoğunluğunu izliyoruz. Biyofilm dispersiyonunun ex vivo analizi için, enfekte yara dokusu biyofilm bozan enzim çözeltisi içine batırılır, daha sonra dokuda kalan bakteri yükü ile çözeltideki bakteri yükü değerlendirilir. Her iki protokol de güçlü ve zayıf yönleri vardır ve dağılım tedavilerinin etkinliğini doğru bir şekilde belirlemeye yardımcı olmak için optimize edilebilir.

Giriş

Dünya çapında antibiyotik direncinin artması, çeşitli bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için antibiyotik seçeneklerinin eksikliğine yol açar1. Antibiyotik direncine ek olarak, bakteriler biyofilm ile ilişkili bir yaşam tarzı benimseyerek antibiyotik toleransı kazanabilir2. Biyofilm, toplu olarak hücre dışı polimerik madde (EPS) olarak adlandırılan polisakkaritler, hücre dışı DNA, lipitler veproteinler 3matrisi ile korunan bir mikroorganizma topluluğudur. Antibiyotik direnci krizi devam ettikçe, antibiyotiklerin kullanımını uzatan veya etkinliğini etkileyen yeni stratejilere şiddetle ihtiyaç vardır. Anti-biyofilm ajanları umut verici bir çözümdür4.

Önerilen farklı anti-biyofilm stratejileri arasında, biyofilm EPS'nin farklı bileşenlerini hedefleyen dispersal ajanların kullanımı terapötik gelişimin ön saflarında yer almaktadır5. Glikozit hidrolazları (GH) bu tür bir dispersiyon maddesi sınıfıdır. GH, EPS'ye yapısal bütünlük sağlayan polisakkaritler içindeki farklı bağların bölünmesini katalİze eden büyük bir enzim sınıfıdır. Grubumuz ve diğerleri, GH'nin biyofilmleri etkili bir şekilde bozabileceğini, dağılmayı teşvik edebildiği ve hem in vitro hem de in vivo6 , 7 ,8,9,10,11gibi bir dizi farklı bakteri türü için antibiyotik etkinliğini artırabileceğini göstermiştir.

Biyofilm dispersiyona artan bir ilgi ile, dispersiyon etkinliğini değerlendiren etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Burada, farelerde bir dispersiyon ajanı ile biyofilm ilişkili yara enfeksiyonlarının tedavisi ve dağılım etkinliğinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, in vivo ve ex vivo. Genel amaç, biyofilm dağılımını etkili ve verimli bir şekilde ölçmek için preklinik modellerle kullanılabilecek etkili yöntemler sağlamaktır.

Bu çalışmalarda biyofilm ilişkili bir enfeksiyon oluşturmak için bir murine cerrahi eksizyon enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Biz 15 yılı aşkın bir süredir bu modeli kullandık ve gözlemlerimizi kapsamlı bir şekilde yayınladık7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Genel olarak, bu, bakterilerin yara yatağına lokalize kaldığı ve biyofilm ile ilişkili olduğu (EPS ile çevrili agregalarda görülen bakteriler), 3 haftaya kadar süren kronik bir enfeksiyon oluşturan ölümcül olmayan bir enfeksiyon modelidir. Bununla birlikte, fareler bağışıklık sistemik olarak (örneğin Tip 1 diyabet ile) bağışıklık kazanırsa, bu modelde ölümcül bir sistemik enfeksiyon geliştirmeye daha duyarlı hale gelebilirler.

Bu raporda, hem in vivo hem de ex vivo bir yaradan bakterilerin dağılımını değerlendirmek için protokoller sunuyoruz. Her iki protokol de bir dağılım ajanının etkinliğini incelemek ve kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip olmak için kullanılabilir. Örneğin, dağılım in vivo'nun değerlendirilmesi, bakterilerin dağıldıktan sonra vücudun diğer bölgelerine yayılması ve konağın nasıl tepki verdiği hakkında önemli, gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Öte yandan, dispersiyon ex vivo'nun değerlendirilmesi, doku ayrı ayrı test edilebilen birden fazla bölüme ayrılabileceğinden, gerekli fare sayısını azaltabileceğinden, birden fazla ajanın, dozun veya formülasyonun taranması için daha arzu edilebilir. Birden fazla ajanı değerlendirirken, genellikle daha önce açıklandığı gibi dispersiyon ilk in vitro ölçüldü 6,9,22. Daha sonra en etkili ex vivo'yu test ediyoruz ve sınırlı sayıda çok umut verici ajan için in vivo testini ayırıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu hayvan protokolü Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası 07044) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Fare enfeksiyonlarına bakteri hazırlama

NOT: Burada fareleri sadece Pseudomonas aeruginosaile enfekte etmeyi açıklıyoruz. Bununla birlikte, enfeksiyona neden olmak için diğer bakteri türleri kullanılabilir. Bakteriyel suşlar ve malzemeler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak yer almaktadır.

  1. Daha önce açıklandığı gibi bu deneyler için lüminesans plazmid pQF50-lux23 taşıyan Pseudomonas aeruginosa vahşi tip suşu PAO1 kullanın7.
  2. 16 ila 20 saat boyunca 37 °C'de Luria-Bertani (LB) suyunda, 200 rpm'de sallanarak, şaşkın Erlenmeyer şişelerinde P. aeruginosa suşlarını yetiştirin. Plazmid'in bakımı için PAO1(pQF50-lux) geceleme kültürüne 100 μg/mL ampisilin son konsantrasyonu ekleyin.
  3. Alt kültür P. aeruginosa, 100 μg/mL ampisilin konsantrasyonuna sahip 10 mL LB suyu içeren bir Erlenmeyer şişesine 100 μL geceleme kültürü ekleyerek. Daha sonra sallama ile 37 ° C'de 2-2.5 saat boyuncabüyüyün, 0.4'ün 600 nm'si bir OD'ye ve ardından yaklaşık 10 4 hücreli bir enfekte doz için üç kez seri olarak seyreltin (1:10).

2. Biyofilm dispersiyon enziminin hazırlanması

NOT: Bu çalışma için dispersiyon tedavisi için "GH" olarak adlandırılacak eşit parça amilaz ve selüloz (her birinin% 5'i) %10'luk bir çözelti kullanıyoruz.

  1. 1x fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş% 10 GH çözeltisi (bacillus altyazısından)ve mantar selülalü (Aspergillus nijer'den)kullanın. Araç kontrol tedavisi olarak PBS kullanın.
  2. Enzim aktivasyonu için tüm tedavileri 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın.

3. Deneysel hayvanlar ve ameliyat öncesi kurulum

  1. Ev fareleri, kafes başına 5 çöp arkadaşı, çevre kontrollü koşullarda, 12 saat açık / karanlık döngüler ve yiyecek ve suya uygun erişim.
  2. Tercihen, 8 ila 10 haftalık dişi İsviçre Webster fareleri kullanın.
  3. Uygulanacak uygun anestezi miktarını belirlemek için fareleri tartın.
  4. 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazinin intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulayın.
  5. Kuruluğu azaltmak için pamuklu çubuk kullanarak göze dikkatlice göz kremi (örneğin, Tazele P.M.) uygulayın.
  6. Ameliyat boyunca solunum hızı, cilt renklendirmesi ve vücut ısısı dahil olmak üzere fizyolojik parametreleri izleyin.

4. Dorsal tam kalınlık eksizyon cerrahisi

  1. Anestezinin cerrahi düzlemini parmak sıkışması ve solunum hızı ve çabasının izlenmesi ile değerlendirin. Sırt yüzeyini tıraş edin ve cildin kurumasını sağlamak için 10 dakika (veya ürünün talimatlarına göre) bir depilatör krem uygulayın, ardından hafifçe çıkarın.
  2. Ağrı yönetimi için, eksize edilecek bölgeye 0,05 mL lidokin deri altı uygular ve boynun scruff'ına deri altından 0,02 mL buprenorfin enjekte edin. Ağrı yönetimine ulaşıldığından emin olmak için 10 dakika bekleyin.
  3. Eksizyondan önce, dorsal yüzeyi bir alkol çubuğu kullanarak dezenfekte edin ve sırtın arka kısmına doğru 1,5 cm çapında bir daire çizin. İşlem boyunca steril bir cerrahi alan sağlayın ve otoklavlı aletler ve steril eldivenler kullanın. Kontaminasyonu sınırlamak için, ameliyatı aydınlatılmış bir Bunsen brülörü ile yapın ve her hayvan için temiz aletler kullanın.
  4. Cerrahi makasla panniculus kas seviyesine tam kalınlıklı, eksizyonel bir cilt yarası sürün.
  5. Eksizyondan sonra, yaraları hemen yarı geçirgen bir poliüretan pansuman ile örtün.
  6. Bir enfeksiyon oluşturmak için pansumanın altındaki 100 μL PBS'de yaklaşık 104 CFU bakteriyi yara yatağına enjekte edin.
    NOT: Yaralar aynı anda birden fazla bakteri ve/veya mantar türüyle veya19yaşındaki hastalardan çıkarılan önceden oluşturulmuş biyofilmler12veya hatta debridman dokusunu yara yatağına yerleştirerek de enfekte olabilir.
  7. Enfeksiyondan sonra, fareleri ısıtma pedleri ile kafese yerleştirin ve sağ reflekslerini geri kazanana kadar izleyin.
    NOT: Farelerin üşümediğine emin olun, çünkü bu ölüme yol açabilir.
  8. 48 saat boyunca yara enfeksiyonları oluşturun.
  9. Yapışkan pansumanları her gün gözyaşı ve yapışmama alanları için inceleyin ve gerekirse değiştirin.

5. In vivo dispersal tedavi

NOT: Burada 3 topikal yara sulama solüsyöyleri serisi uygulayarak dispersiyon maddelerinin yönetimini açıklıyoruz (Şekil 1). Bununla birlikte, protokol jellerin, kremlerin veya pansumanların uygulanması gibi diğer teslimat türleri için uyarlanabilir.

  1. Tedavileri uygularken fareleri izofluran anestezisi altına (% 3 ve dakikada 1 L oksijen) yerleştirin.
  2. Her fare için 200 μL tedavi içeren 25 G iğneli üç adet 1 mL şırınga hazırlayın.
  3. Cildi dikkatlice kaldırarak ve forsepsle sıkıştırarak, yaranın biraz üzerinde hayvanın başına doğru 200 μL enzim çözeltisi veya PBS kontrolü enjekte edin. Şırınnayı kaldırılan deriden dikkatlice delin ve çözeltiyi pansuman ile yara yatağı arasına yavaşça enjekte edin. Bu çalışmada kullanılan pansuman genellikle hem yara yatağına hem de çevre dokuya yapışır.
    1. Tüm yara yatağının çözelti ile kap olduğundan emin olmak için, çözeltiyi yavaşça enjekte ederken, pansumanı forsepsle hafifçe kaldırın, yara yatağından çekin.
  4. Tedaviden sonra, fareleri 30 dakika boyunca kafeslerine geri yerleştirin.
  5. Tedaviye 30 dakika maruz kaldıktan sonra, fareleri izofluran ile yeniden uyuşturun ve çözeltiyi bir şırınna ile epire edin, daha önce olduğu gibi aynı bölgede delinmeyi unutmayın.
    NOT: Bu aspire edilmiş çözelti, çeşitli aşağı akış analizleri için kaydedilebilecek dağınık bakteri hücreleri içerir.
  6. her seferinde yeni bir şırıng kullanarak ikinci ve üçüncü sulama arıtmalarını birinci olarak uygulayın.

6. In vivo dispersiyon görüntüleme ve analizi

NOT: Enfeksiyonu başlatmak için parlak bir bakteri türü kullanılırsa, yara yatağından dağılımı görselleştirmek için bir In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) kullanılabilir.

  1. Görüntü fareleri tedaviden hemen önce ve sonra ve tedavi sonrası 10 ve 20 saat(Şekil 2 ve Ek Şekil 1).
  2. Fareler anestezi altındayken IVIS'e ayrı ayrı yerleştirerek ve her birini 560 nm dalga boyunda 5 sn boyunca görüntüleyerek görüntülemeyi gerçekleştirin. Daha fazla analiz için görüntüleri kaydedin.
    NOT: Optimum dalga boyu ve pozlama süresi, kullanılan muhabire ve IVIS cihazına ve görüntüleme yazılımına bağlı olacaktır.
  3. Analiz için, görüntüleri IVIS yazılımında açın ve Araç Paleti'nde analiz edilecek alanı seçin.
  4. Arka planı hesaba katmak için, bir fotoğrafın arka planına bir daire yerleştirin ve ardından her fare için yara yatağının üzerine aynı büyüklükteki daireyi yerleştirin.
  5. Ölçüm değerlerini karşıya yüklemek için İlgi Alanı (> ROI) ölçümlerini görüntüle'yi seçin ve ölçüm tablosunu bir elektronik tabloya yükleyin. Her numune için lüminesansı hesaplamak için yara yatağı ölçümlerinin her birinden arka plan dairesi okumasını çıkarın. Değişen yüzde lüminesansı hesapla:
    Yatırım getirisi ön tedavi-ROI tedavi sonrası/ YATıRıM GETIRISI ön tedavi) x 100.
    NOT: Görüntü alımını veya parlaklığı etkileyebilecek değişkenler için normalleştirmek için kontrol ve tedavi edilen fareler aynı anda analiz edilmelidir.

7. CFU'yu belirleyerek dağılımın değerlendirilmesi

  1. 100 mg/kg ketamin 10 mg/kg ksilazin ile anestezi altında 0.2 mL pentobarbital sodyum (örneğin Fatal Plus) intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri insanca ötenazi.
  2. Önce pansumanı steril önps ile nazikçe çıkararak yara yatağı dokusunu hasat edin ve ardından steril cerrahi makasla yara yatağının çevresini kesin. Örneği kas tabakasından kesmek /alay etmek için makas kullanırken yara yatağının bir ucunun bir ucunun önps ile hafifçe kaldırın.
  3. Yara yatağındaki dokuyu 1 mL PBS içeren önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 2 mL homojenizasyon tüpüne yerleştirin. Numuneleri yerleştirdikten sonra tüpleri tekrar tartın ve dağınık veya gevşek yapışmış bakterileri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin ve PBS'yi çıkarın. 1 mL taze PBS ekleyin.
  4. Dalakları hasat etmek için, fareleri arka anatomik bir konuma yerleştirin ve ekstremitelerini bir diseksiyon yüzeyine sabitleyerek sabitleyin. Bölgeyi dezenfekte etmek ve kürkün numuneyi kirletmemesi için% 70 etanol ile parçalanacak alanı ıslatın.
  5. Alt karın derminde cerrahi makasla orta çizgiye dik küçük bir kesi yaparak cildi yukarı ve iç organlardan uzaklaştırdığından emin olun. Sternuma ulaşılana kadar kesiği iç kısım boyunca, orta hat boyunca devam ettir. Periton boşluğu açığa çıktıktan ve iç organlar görünür olduğunda, dalağını bağ dokusundan hafifçe ayırın ve ayrı bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
  6. Dalağını tartın ve yara yatağı dokusu için açıklandığı gibi PBS ile durulayın.
    NOT: Diğer ilgi organları da benzer şekilde hasat edilebilir.
    1. İlk kesiği yaparken, bağırsakların veya diğer organların delinmemesine dikkat edin.
  7. Örnekleri 2 mL önceden doldurulmuş boncuk değirmeni tüplerinde 60 sn boyunca 5 m/s'de tezgah üstü homojenizatör kullanarak iki kez homojenize edin.
  8. CFU'yu numaralandırmak için, seçici agar üzerinde örnekleri ve spot plakayı seri olarak seyreltin. Seri seyreltme için, numunenin pipeti 100 μL'yi 1,5 mL'lik bir tüpte 900 μL PBS'ye, girdap ve 5 kez tekrarlayın. Pipet 10 μL her seyreltme şekil 3'tegösterildiği gibi bir agar plakası üzerine.
    NOT: Daha hassas CFU nicelasyonu gerekiyorsa, numunenin her seyreltilmesinden 100 μL'yi ayrı agar plakalara yayın.

8. Dağılım ex vivo değerlendirmesi (Şekil 4)

  1. Fareleri yarala ve yukarıda açıklandığı gibi yaklaşık10 4 PAO1 ile enfekte et ve enfeksiyondan sonra 48 saat ötenazi.
  2. Pansumanı steril teknik kullanarak ve yara yatağını bozmadan, asalarla dikkatlice çıkarın.
  3. Yara yatağının bir ucunun kaldırılması için önseçimler kullanarak yara yatağının çevresini enfekte edilmemiş deriden kesmek için steril cerrahi makas ve enfekte olmayan dokunun altındaki kas tabakasından enfekte yara dokusunu çıkarmak için makas kullanın. Yara yatağı örneklerini eşit parçalara bölün veya bütün kullanın.
  4. Yara dokusunu boş, önceden tartılmış 2 mL boncuk değirmeni homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Daha sonra numuneyi ekledikten sonra tüpleri tekrar tartın. Örneğin ağırlığını şu şekilde hesaplayın:
    örnek ekledikten sonra ağırlık - örnek eklemeden önce ağırlık.
  5. 1 mL PBS ekleyin ve numuneyi durulamak ve planktonik hücreleri çıkarmak için tüpü 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
  6. Numuneye 1 mL GH tedavisi (veya negatif kontrol olarak PBS) ekleyin ve 80 rpm'de sallanarak 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
  7. Biyofilm dispersiyon çözeltisini çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Bu dağınık hücreleri içerir.
  8. Kalan doku örneğine 1 mL PBS ekleyin ve kalan dağınık hücreleri durulamak için 3-5 kez hafifçe ters çevirin. PBS'yi çıkarın ve atın.
  9. Kalan dokuya 1 mL PBS ekleyin ve tezgah üstü homojenizatör kullanarak 60 sn boyunca 5 m/s'de homojenize edin.
  10. 1,5 mL'lik bir tüpe 900 μL PBS'ye 100 μL numune yerleştirerek ve toplam 6 seyreltme için beş kez tekrarlayarak dağınık hücrelerin ve homojenize doku örneğinin çözeltisini seri olarak seyreltin.
  11. Spot plaka 10 μL her seyreltme media seçici agar üzerine (örneğin, P. aeruginosaiçin Pseudomonas İzolasyon Agar) ve plakaları bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya yatır.
  12. CFU'ları sayın ve 'dağılan yüzdeyi' (süpernatantta CFU/ (biyofilm dokusunda süpernatant+ CFU'da CFU)) x 100 olarak hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu deneyde, 8-10 haftalık dişi İsviçre Webster farelerine lüminesans plazmid pQF50-lux taşıyan10 4 CFU PAO1 ile enfekte edildi. Yukarıda açıklandığı gibi, biyofilm EPS'yi sindirmek için PBS (araç kontrolü) veya% 10 GH (tedavi) 3 x 30 dakikalık tedavileri uygulamadan önce 48 saat boyunca bir enfeksiyon kurulmasına izin verildi. Fareler tedaviden hemen sonra (0 h) ve tedavi sonrası 10 saat 20 saat olarak görüntülendi. Şekil 2A ve Ek Şekil 1, yara yatağı içinde parla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada biyofilm dispersiyon ajanlarının etkinliğini incelemek için kullanılabilecek protokolleri açıklıyoruz. Bu protokoller, klinik debridman örnekleri de dahil olmak üzere farklı dispersiyon ajanları, bakteri türleri veya ex vivo örnekleri ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu protokol ayrıca dağınık bakteri hücrelerini toplamak ve incelemek için klinik olarak ilgili bir model sağlar. Dağınık bakteri hücrelerinin fenotiplerinin planktonik veya biyofilm hücrelerinden farklıolduğu göste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. ve Jack Denton Wilson Vakfı ve Savunma Bakanlığı'nın (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) hibeleriyle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüFisher14823434numunelerin seri seyreltmelerini tamamlamak için kullanın
Fisher148234341 mL şırıngaya bağlanır
Ampisilin Sodyum TuzuFisherBP1760-550 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapın ve 100 & mikro ekleyin; Hem gece hem de alt kültür için L ila 10 mL LB suyu
AmilazMP Biyomedikaller2100447%5 w/v solüsyon yapın, vorteks- diğer dağıtıcı ajanlar kullanılabilir
Buprenorfin SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)ZooPharmRX216118Ağrı bakımı olarak kullanın - diğer seçenekleri kullanabilir
SelülazMP Biyomedikal2150583%5 w/v amilaz çözeltisine %5 w/v ekleyin, girdap, 37 ° C'de etkinleştirin; 30 dakika boyunca C - diğer dağıtıcı maddeler kullanılabilir
Tüy dökücü kremWalmart287746Hayvanın sırtındaki saç köklerine masaj yapmak için küçük bir miktar kullanın ve tüyleri çıkarmak için 10 dakika ayırın
Pansuman Forsepsleri, Tırtıklı UçlarFisher12-460-536Diğer forseps formlarını kullanabilir
Erlenmeyer şişeleri şaşkın 125 mLFisher101406Gece boyunca ve bakteri alt kültürlerini büyütmek için kullanın
FastPrep-24 Tezgah Üstü HomojenizatörMP Biyomedikal6VFV9Dokuyu homojenize etmek için 60 saniye boyunca iki kez 5 m/s kullanın
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68Her fare için 0.2 mL intraperitaneal enjekte
Homojenizasyon tüpleri (Boncuk Tüpü 2 mL 2.4 mm Metal)Fisher15340151İlaçları kaplamak için numuneleri homojenize etmek için kullanılır
Ketamin hidroklorür / ksilazin hidroklorür çözeltisi C-IIINSigma AldrichK4138Anasetik olarak kullanın - anasethia
LB suyu, MillerFisherBP1426-2'nin25 g / L ve otoklav ekleyin
Lidokain% 2 Enjekte EdilebilirElmas Sırtlı İlaçlar2468İşaretli yara yatağı alanının yanından 0.05 mL enjekte edin, böylece işaretin merkezinde biriktirilir. Kesmeden 10 dakika önce ayırın
MeropenemSigma AldrichPHR1772-500MGTopikal olarak uygulanacak GH çözeltisine eklemek için 5 mg / mL ve intraperitaneal enjekte etmek için 15 mg / mL çözelti yapın tedaviden 4 saat önce ve 6 saat sonra
Steril olmayan pamuklu gazlı bez süngerlerFisher13-761-52Tüy dökücü krem
PAO1 pQF50-lux bakteri türünüRef [13]N/APAO1 pgF50-lux, bu makalenin temsili sonuçlarında ilgilenilen P. aeruginosa suşu olarak kullanılmıştır
Petri kaplarıFisherPHR1772-500MG
Fosfat Tamponu Salin 10xFisherBP3991Kullanmadan önce 10x ila 1x seyreltin
Poliüretan pansumanMckesson66024007Yuvarlatılmış kenarı kesin ve kalan kareyi 4 eşit parçaya kesin
Pseudomonas izolasyon agarVWR90004-394Suya, otoklava 20 mL/L gliserol ve 45 g/mL ekleyin ve 20 mL'yi petri kaplarına dökün
P.M.Walmartİşlem sırasında kuruluğu azaltmak için gözlerde kullanın.
Steril Alkol Hazırlama PedleriFisher22-363-750Alanı dezenfekte etmek için yaralamadan hemen önce cildi temizlemek için kullanın
Düz HassasMakas Fisher89515Kavisli makas da kullanabilir
İsviçre Webster fareleriCharles River551NCISWWEBDiğer fare suşları kullanılabilir
Şırınga Kayma Ucu 1 mLFisher14823434İlaçları uygulamak için kullanılır ve Enzim tedavisi
İğnede 25G 58 edin İzofluran Elmas Sırtlı cerrahi alanını elde etmek için diğer seçenekler de kullanılabilir. çıkarmak için kullanın

Kaynaklar

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738(2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632(2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379(2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317(2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518(2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129(2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079(2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462(2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fare Yara ModeliKronik Yara EnfeksiyonuDağıtıcı AjanlarEkstraselüler Polimerik MaddeIn Vivo GörüntülemeBakteriyel Yük KantifikasyonuEx Vivo AnalizPolimikrobiyal EnfeksiyonEnzim Tedavisi
Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.