Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Beyin gelişimi ve olgunlaşma sırasında meydana gelen kısa ömürlü değişiklikleri anlamak, hücresel ve hücre altı çözünürlükte uzay ve zamanda ayrıntılı yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir. Moleküler ve görüntüleme teknolojilerindeki gelişmeler, şeffaf zebra balığı embriyosunda beyin gelişiminin hücresel ve moleküler mekanizmaları hakkında çok sayıda ayrıntılı içgörü elde etmemizi sağladı. Son zamanlarda, döllenmeden birkaç hafta sonra daha sonraki larva aşamalarında meydana gelen nöronal bağlantının iyileştirilmesi süreçleri, örneğin sosyal davranış, karar verme veya motivasyon odaklı davranışların kontrolü, araştırma odağına taşınmıştır. Bu aşamalarda, zebra balığı derisinin pigmentasyonu beyin dokusuna ışık penetrasyonunu engeller ve embriyonik aşamalar için çözümler, örneğin pigmentasyonun farmakolojik inhibisyonu artık mümkün değildir.
Bu nedenle, uyanık zebra balıklarının beynine mikroskopi erişimi için elektrofizyolojik yaklaşımlardan elde edilen minimal invaziv bir cerrahi çözüm sağlanır. Teleostlarda, cilt ve yumuşak kafatası kıkırdağı, bu katmanların mikro soyulmasıyla, alttaki nöronların ve aksonal yolların hasar görmeden açığa çıkarılmasıyla dikkatlice çıkarılabilir. Bu, sinaptik yapılar ve moleküler içerikleri de dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydedilip Ca2+ geçici veya hücre içi taşıma olayları gibi fizyolojik değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca bu süreçlerin farmakolojik inhibisyon veya optogenetik manipülasyon ile sorgulanması mümkündür. Bu beyin maruziyeti yaklaşımı, nöronlardaki yapısal ve fizyolojik değişikliklerin yanı sıra bu olayların canlı beyin dokusunda dakika veya saat aralığında korelasyonu ve birbirine bağımlılıkları hakkında bilgi sağlar. Teknik, şimdiye kadar test edilen en son gelişim aşaması olan döllenmeden 30 güne kadar zebra balığı larvalarının in vivo beyin görüntülemesi için uygundur. Bu nedenle, sinaptik arıtma ve ölçekleme, aksonal ve dendritik taşıma, sitoskeletal kargonun sinaptik hedeflemesi veya yerel aktiviteye bağımlı ifade gibi önemli sorulara erişim sağlar. Bu nedenle, bu montaj ve görüntüleme yaklaşımı için geniş bir kullanım beklenebilir.
Giriş
Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) embriyonik ve larva gelişimsel çalışmalar için en popüler omurgalı model organizmalardan biri olarak evrimleşmiştir. Zebra balığı dişilerinin büyük doğurganlığı, embriyonun hızlı ex utero gelişimi ve erken embriyonik gelişim aşamalarında şeffaflığı ile birleştiğinde, zebra balığını gelişimsel soruları ele almak için güçlü bir model organizma haline getiren sadece birkaç temel faktördür1. Moleküler genetik teknolojilerdeki gelişmeler, yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme çalışmaları ile birlikte, gelişimsel süreçlerin altında kalan hücre biyolojik mekanizmalarının ele alınmasına izin verilir2. Özellikle, nöronal farklılaşma, fizyoloji, bağlantı ve işlev alanında zebra balığı, moleküler dinamiklerin, beyin fonksiyonlarının ve organizma davranışlarının benzeri görülmemiş ayrıntılarla etkileşimine ışık tutmaktadır.
Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu, sinir sistemi dokusunun şeffaflığı giderek kaybolduğundan, gelişimin ilk haftasında embriyonik ve erken larva aşamaları ile sınırlıdır. Bu aşamalarda, kafatası farklılaşması ve pigmentasyon ile korunan yüksek çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımları ile beyin dokusunun erişimi engellenir3.
Bu nedenle, nöronal farklılaşma, olgunlaşma ve nöronal bağlantının iyileştirilmesi veya sinaptik ölçekleme gibi plastisite ile ilgili temel soruların incelenmesi zordur. Bu hücresel süreçler, örneğin sosyal davranış, karar verme veya motivasyona dayalı davranış gibi hücresel mekanizmaları tanımlamak için önemlidir, zebra balığının birkaç haftalık larvalar üzerinde yaptığı araştırmaların son zamanlarda davranışsal çalışmalara dayanan temel bulgulara katkıda bulunduğu alanlar4.
Zebra balığı larvalarında pigmentasyonu birkaç hafta boyunca inhibe etmek için farmakolojik yaklaşımlar zar zor uygulanabilir veya hatta zararlı etkilere neden olabilir5,6,7,8. Casper9 veya kristal10gibi spesifik pigmentasyon kusurlarına sahip çift veya üçlü mutant suşları, çok değerli araçlar haline gelmiştir, ancak üremede zahmetlidir, az sayıda yavru sağlar ve aşırı akraba evliliği nedeniyle genetik malformasyonların birikmesi tehlikesi oluşturur.
Burada, herhangi bir zebra balığı türü için geçerli olan alternatif olarak minimal bir invaziv prosedür sağlanır. Bu prosedür, canlı ve uyanık zebra balığı larvalarında nöronal aktiviteyi kaydetmek için elektrofizyolojik çalışmalardan uyarlanmıştır. Teleostlarda, deri ve yumuşak kafatası kıkırdağı, beyin vaskülatıyla sıkıca iç içe olmadıkları için bu katmanların mikro soyulmasıyla dikkatlice çıkarılabilir. Bu, nöronlar ve aksonal yollar içeren beyin dokusunun hasar görmeden açığa çıkıp sinaptik yapılar ve moleküler içerikleri de dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydedillenmesine izin verir, bu da Ca2+ geçicileri veya hücre içi taşıma olayları gibi fizyolojik değişikliklerin birkaç saate kadar gözlemini içerir. Ayrıca, tanımlayıcı nitelemelerin ötesinde, beyin dokusuna doğrudan erişim, nörofarmakolojik madde yönetimi ve optogenetik yaklaşımlar yoluyla olgun nöronal fonksiyonların sorgulanmasını sağlar. Bu nedenle, bu beyin maruziyet stratejisi kullanılarak yavru zebra balığı beyninde gerçek yapı fonksiyon ilişkileri ortaya çıkarılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm hayvan çalışmaları yasal düzenlemelere uygundur (AB Direktifi 2010/63). Balıkların bakımı ve elleçlenimi yerel yetkililer ve Technische Universität Braunschweig hayvan refahı temsilcisi tarafından onaylanmıştır.
1. Yapay serebro omurilik sıvısının (ACSF), düşük erime agarose ve keskin cam iğnelerin hazırlanması
- Listelenen kimyasalları damıtılmış suda aşağıdaki konsantrasyonlarda eriterek ACSF'yi hazırlayın. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,9 mM 2 mM MgCl2 6x H2O (203.3 g/mol), 10 mM HEPES (238.31 g/mol) ve 10 mM d-Glikoz (180.16 g/mol).
NOT: MgCl2,CaCl2ve KCl için, 1 M stok çözeltileri tuzdan arındırılan steril suda hazırlanır ve daha sonra taze ACSF hazırlamak için 4 °C'de saklanır. Glikoz, HEPES ve NaCl, taze ACSF çözeltisinde katı bileşikler olarak çözülür. Kimyasalları çözmek için üreticinin talimatlarına uyun. - ACSF'nin pH'ını 10 M NaOH ile 7,8'e ayarlayın. ACSF'nin hazırlanması, beyin omurilik sıvısının yerini alması ve nöronların tamamen işlevsel olması için gerekli fizyolojik koşulları koruduğu için kimyasalların hassas bir şekilde ölçülmesini ve pH'ın ince ayarını gerektirir, aksi takdirde beyin yanlış beslenmesine ve nöronal ölüme neden olabilir.
- Yeni hazırlanan ACSF'i en fazla 4 hafta boyunca 4 °C'de saklayın. Çalışma koşulları için, 25-28 ° C'de gün / deney ve ön ısıtma için gerekli ACSF hacmini aliquot (ve isteğe bağlı olarak oksijenlendir, adım 2.5)
NOT: Yeni hazırlanmış ASCF 1 gün boyunca iyidir. Birkaç gün boyunca kullanmayı planlıyorsanız, ACSF'nin steril filtrelenmesi gerekir. - Larvaların daha sonra anestezisi için, damıtılmış suda 50 mM'lik bir d-Tubocurarine stok çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi -20 °C'de 100 μL aliquots olarak dondurucuda ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
- Balıkları gömmek için, 50 mL ACSF'de 1,25 g LM-agarose(Malzeme Masası)eriterek% 2,5 düşük erime (LM) agarose hazırlayın ve agarose tamamen çözünene kadar kaynatın.
NOT: Alternatif olarak, deneysel kuruluma bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük LM-agarose konsantrasyonları kullanılabilir. Bununla birlikte, agarose çok yumuşaksa, kafatasını açarken balığı yerinde tutamaz. - Katılaşmayı önlemek için agarose'u 37 ° C su banyosunda saklayın ve bu sıcaklık gömme sırasında larvalara da zarar vermez. Haşlanmış agarose su banyosunda 37 ° C'ye kadar soğutulduktan sonra, günün 10 μM çalışma konsantrasyonuna ulaşması için gereken aliquoted agarose'a gerekli miktarda d-Tubocurarine ekleyin. İleride kullanmak için, kirlenmeyi önlemek için sol agazozları 4 °C'de saklayın.
- Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikropipette çekme kullanarak cam kılcal damarlardan keskin ve ince cam iğneler hazırlayın(Ek Şekil 1).
- Puller I, Kılcal Tip 1: Isı 1: 65.8; Isı 2: 55.1; 2 adımlı çekme
Puller II, Kılcal tip 2: Isı = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; 1 adımlı çekme.
NOT: Üniteler burada kullanılan her çektirici ve cam kılcal damar için sırasıyla özeldir (bkz. Malzeme Tablosu). Cam iğneleri hazırlamak için diğer kılcal damarlar ve çektiriciler de kullanılabilir. Ancak cam iğneler kafatası ile temas ederken kırılabilecekleri kadar ince olmamalıdır. Kılcal damar: uzunluk: 100 mm (4 inç); OD: 1,5 mm; Kimlik: 0.84 mm; filament: Evet
- Puller I, Kılcal Tip 1: Isı 1: 65.8; Isı 2: 55.1; 2 adımlı çekme
2. Larvaların anestezisi ve gömme hazırlıkları
- Deneye başlarken, plastik bir Pasteur pipet ile ihtiyaç duyulan hayvanları, Danieau (hala Danieau ile bir Petri kabında tutulan larvalar için) veya balık tesisinden su (7 dpf'den eski olan ve balık tesisinde tutulan larvalar için) ile dolu 90 mm çapında bir Petri kabına aktarın.
- 2 haftadan eski balıkları pipetlerken, pipet açıklığının balıkları aktarırken yaralanmayı önleyebilecek kadar büyük olduğundan emin olun. Bir ağ kullanmayın, çünkü özellikle genç larvalara fiziksel olarak zarar verir.
- Gıdaya ücretsiz erişim ve larvaların maksimum sağlık durumunu sağlamak ve stresi azaltmak için Petri kabında tutulan larvaların büyüklüğüne uygun rotifera veya artemia nauplii ekleyin.
- Gömme için, seçilen larvaları ACSF ile dolu 35 mm çapında bir Petri kabına aktarın. 10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna / etkili doza ulaşmak için gerekli d-Tubocurarine hacmini ekleyin ve larvalar tamamen hareketsiz hale gelene kadar birkaç dakika bekleyin11.
NOT: Balık büyüdüğünde veya daha hızlı bir tam anestezi gerektiğinde (5 dk'nın altında), d-Tubocurarine konsantrasyonunu artırmak mümkündür (fareler için LD50 intravenöz olarak 0,13 mg /kg'dır). Curare ile aynı etkiye sahip olan ve beyni tamamen aktif tutan α-bungarotoxin (çalışma konsantrasyonu: 1 mg / mL) gibi farklı bir anestezik kullanmak damümkündür 13. İlgi konusu için tamamen aktif bir beyin gerekli değilse, ölümcül olmayan bir dozda (%0.02) Tricaine de larvaları tamamen uyuşturmak için bir seçenektir. Bununla birlikte, Tricaine sodyum kanallarını bloke eder, böylece beyin aktivitesini bozar14. - 35 mm çapındaki Petri kabının kapağını alarak montaj odasını hazırlayın, kapağı ters çevirin ve kapağın altına kare cam bir kapak kapağı (24 x 24 mm) yerleştirin. Bu adımların şematik açıklaması için Şekil 1'e (üst bölüm) bakın. Camın daha pürüzsüz yüzeyi, kafatası açma prosedürü sırasında larvaları içeren agarose bloğunun kaymasını önler.
- Uygun bir şişede (örneğin, 50 mL tüp, beher, Schott şişesi vb.) gün için gereken ACSF miktarını aliquot ve karbojen (%5 CO
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 3A,C transgenik çizginin 14 dpf larvasını göster Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] Kafatası hala sağlamken. Kaplama derisindeki pigment hücreleri başın her yerine dağılmıştır ve ilgi çekici bölgedeki floresan sinyaline müdahale etmektedir (burada, beyincik). Bu durumdaki larva ile beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek mümkün değildir. Şekil 3B açık kafatası ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sunulan yöntem, beyin izolasyonuna veya zebra balığı larvalarının in vivo ortamlarında yüksek çözünürlüklü nöron görüntülerini kaydetmek için pigmentasyonu engelleyen farmasötiklerle tedavisine alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu yöntemle kaydedilen görüntülerin kalitesi, ekilmiş beyinlerden gelen görüntülerle karşılaştırılabilir, ancak doğal koşullar altında.
Ayrıca, floresan yoğunluğunda bir kayıp önlenir, çünkü fiksatiflerle tedaviye gerek yoktur18. Ayrıca, b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Özellikle timo Fritsch'e mükemmel hayvan bakımı için ve Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti ve Barbara Winter'a yardımsever destekleri için teşekkür ederiz. Köster laboratuvarının diğer tüm üyelerine de geri bildirimleri için minnettarız. Proje kısmen Alman Araştırma Vakfı (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (RWK'ya) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projesi 01EW1520 to JCM) kabul edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalsiyum klorür | Roth | A119.1 | |
| Konfokal Lazer tarama mikroskobu | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glikoz | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Cam Kılcal tip 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Cam Kılcal tip 2 | Harvard Aparatı | GC100F-10 | |
| Cam Lamel | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Görüntüleme odası | Ibidi | 81156 | |
| Potasyum klorür | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnezyum klorür (Hekzahidrat) | Roth | A537.4 | |
| Mikroskop Kamerası | Leica | DFC9000 GTC | |
| İğne Çektirme tip 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| İğne-Çektirme tip 2 | Sutter Aletleri | Model P-2000 | |
| Pastör-Pipetler 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodyum klorür | Roth | P029.2 | |
| Sodyum hidroksit | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Su banyosu | Phoenix Enstrümanı | WB-12 | |
| 35 mm petri kabı | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri kabı | Sarstedt | 821473001 |
Kaynaklar
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991(2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490(2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751(2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138(2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537(2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823(2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
