Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir. Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları
Bu makalede
Özet
Özet
Kromatinle ilişkili kondensatlar birçok nükleer proseste dahil edilir, ancak alttaki mekanizmalar zor bulunur. Bu protokol, telomerler üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenen bir protein dimerizasyon sistemini açıklar. Kimyasal dimerizer, her biri bir proteine bağlanabilen iki bağlı liganddan oluşur: Halo ligand Halo enzimine ve trimethoprim 'e (TMP) sırasıyla E. coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR). Halo enziminin bir telomer proteinine füzyonu, dimerizatörleri katvalent Halo ligand enzim bağlama yoluyla telomerlere tuttur. TMP'nin eDHFR'ye bağlanması, proteinleri telomerlere ayıran eDHFR ile kaynaşmış fazı işe toplar ve yoğuşma oluşumunu teşvik eder. TMP-eDHFR etkileşimi kurvalent olmadığından, yoğunlaşma, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla boş TMP kullanılarak tersine çevrilebilir. Telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunun teşvik edilmesi ve yoğuşma büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşiminin belirlenmesine örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, Halo'yu doğrudan lokal kromatin veya bir kılavuz RNA ile genomik lokusa hedeflenen dCas9'a bağlayan bir proteine kaynaştırarak diğer genomik konumlardaki yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir. Biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını korurken tek hücreli canlı görüntüleme için gereken zamansal çözünürlüğü sunarak, bu yöntem kromatin ilişkili kondensatların hem oluşumunu hem de işlevini yok etmek için uygundur.
Giriş
Birçok protein ve nükleik asit sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) tabir edilir ve hücrelerde biyokimyayı düzenlemek için biyomoleküler kondensatlara kendiliğinden monte edilir1,2. Kromatin bağlayıcı proteinlerin LLPS'si, spesifik genomik loci ile ilişkili ve çeşitli lokal kromatin fonksiyonlarına karışan kondensatların oluşumuna yol açar3. Örneğin, HP1 proteininin LLPS'si, transkripsiyon4,5,TRANSKRipsiyon faktörlerinin LLPS'si transkripsiyon 6'yı düzenlemek için transkripsiyon merkezlerinin form transkripsiyon merkezlerini düzenlemek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Geçici hücre hatlarının üretimi
- 6-6-D-lizin ile kaplanmış 22 x 22 mm cam kapaklar (canlı görüntüleme için) veya 12 mm çapında dairesel kapaklar (IF veya FISH için) üzerindeki Kültür U2OS kabul hücreleri büyüme ortamına sahip kuyu plakası (DMEM'de%10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin çözeltisi) %60-70 izdiah edene kadar.
- Transeksiyondan önce büyüme ortamını 1 mL transfeksiyon ortamı (Penisilin-Streptomisicin çözeltisi olmayan büyüme ortamı) ile değiştirin.
- Her transfeksiyon kuyusu için, 150 μL azaltılmış serum ortamına 4 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin, 10 saniye boyunca girdap ve ardından 5 dakika kuluç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Telomer DNA FISH ve SUMO protein IF ile tanımlanan SUMO'nun telomer lokalizasyonunun temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. SIM işe alımı olan hücreler, SIM mutant işe alımı olan hücrelere kıyasla telomerler üzerinde SUMO1 ve SUMO 2/3'ü zenginleştirdi. Bu, telomerlerde SIM dimerizasyon kaynaklı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.
Küçültme sonrası TRF1 ve SIM'in temsili bir zaman atlamalı filmi Video 1'de.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, telomerler üzerindeki kondensatların kimyasal bir dimerizasyon sistemi ile oluşumunu ve çözünmesini göstermiştir. Faz ayırma kinetiği ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi canlı görüntüleme ile izlenir. Yoğuşma lokalizasyonu ve bileşimi DNA FISH ve protein IF ile belirlenir.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi protein ve dimerizer konsantrasyonunu belirlemektir. Genomik bir lokusta lokal faz ayrımını teşvik etmedeki başarı, faz ayırma için kritik konsantrasyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (1K22CA23763201'den H.Z.'ye, GM118510'dan D.M.C.'ye) ve Charles E. Kaufman vakfı tarafından H.Z. Yazarlar, makaleyi düzelttikten sonra Jason Tones'a teşekkür etmek istiyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat içermeyen HBSS'de %0,25 Tripsin, %0,1 EDTA | Corning | MT25053CI | |
| %16 Formaldehit (a/h), Metanol içermez | Thermo Scientific | 28906 | 1x PBS'de %1 |
| hazırlayın 6 Kuyulu Kültür Plakası | VWR | 10861-554 | |
| Alüminyum Folyo | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antikoru | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antikoru | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antikoru | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antikoru | Hücre iskeleti | Asm23 | |
| Bloke Edici Reaktif | Roche | 11096176001 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tüp mikro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Daire Kapak Slipleri | Thermo Scientific | 3350 | |
| Konfokal mikroskop | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimetil Sülfoksit | Sigma-Aldrich | ||
| DMEM | Corning | ||
| EMCCD Kamera | iXon Life | 897 | |
| Etanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, USDA onaylı Bölgeler | Gibco | A4766801 | |
| Formamid, Deiyonize | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Keçi Anti-Fare IgG (H + L), Rekombinant İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), Rekombinant İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Yüksek Hassasiyetli Düz Konik Ultra İnce Nokta Cımbız / Forseps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Lazer birleştirme modülü | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz'in L-15 Orta | Gibco | 21083027 | |
| Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi | Invitrogen | 11668027 | |
| Şekil çizim yazılımı, MATLAB | MathWorks | ||
| Mikroskop Slayt Kutusu | Fisher Scientific | 34487 | |
| Oje | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Görüntüleme yazılımı, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10X, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Uçları | VWR | 10017 | |
| Düz ve Buzlu Kırpılmış Köşe Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poli-D-Lizin çözeltisi | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodyum Azid | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Eğirme diski | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Kare Kapak Slipleri | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x çözelti | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Chenoweth lab | İstek üzerine temin edilebilir | |
| Chenoweth lab | TNH | İstek | |
| Tris Çözümü | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 %10 Çözelti | MilliporeSigma | 64-846-350ML | 1x PBS U2Os hücre hattında% 0.5 hazırlayın |
| HTB-96 | |||
| VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı | Vektör Laboratuvarları | NC9524612 |
Kaynaklar
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
