Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları

2.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62173

⸱

12 Nisan 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir.  Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.

Özet

Kromatinle ilişkili kondensatlar birçok nükleer proseste dahil edilir, ancak alttaki mekanizmalar zor bulunur. Bu protokol, telomerler üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenen bir protein dimerizasyon sistemini açıklar. Kimyasal dimerizer, her biri bir proteine bağlanabilen iki bağlı liganddan oluşur: Halo ligand Halo enzimine ve trimethoprim 'e (TMP) sırasıyla E. coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR). Halo enziminin bir telomer proteinine füzyonu, dimerizatörleri katvalent Halo ligand enzim bağlama yoluyla telomerlere tuttur. TMP'nin eDHFR'ye bağlanması, proteinleri telomerlere ayıran eDHFR ile kaynaşmış fazı işe toplar ve yoğuşma oluşumunu teşvik eder. TMP-eDHFR etkileşimi kurvalent olmadığından, yoğunlaşma, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla boş TMP kullanılarak tersine çevrilebilir. Telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunun teşvik edilmesi ve yoğuşma büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşiminin belirlenmesine örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, Halo'yu doğrudan lokal kromatin veya bir kılavuz RNA ile genomik lokusa hedeflenen dCas9'a bağlayan bir proteine kaynaştırarak diğer genomik konumlardaki yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir. Biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını korurken tek hücreli canlı görüntüleme için gereken zamansal çözünürlüğü sunarak, bu yöntem kromatin ilişkili kondensatların hem oluşumunu hem de işlevini yok etmek için uygundur.

Giriş

Birçok protein ve nükleik asit sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) tabir edilir ve hücrelerde biyokimyayı düzenlemek için biyomoleküler kondensatlara kendiliğinden monte edilir1,2. Kromatin bağlayıcı proteinlerin LLPS'si, spesifik genomik loci ile ilişkili ve çeşitli lokal kromatin fonksiyonlarına karışan kondensatların oluşumuna yol açar3. Örneğin, HP1 proteininin LLPS'si, transkripsiyon4,5,TRANSKRipsiyon faktörlerinin LLPS'si transkripsiyon 6'yı düzenlemek için transkripsiyon merkezlerinin form transkripsiyon merkezlerini düzenlemek için heterokromatin etki alanlarının oluşumunun temelini oluşturur, nascent mRNA'ların LLPS'si ve çok cinsiyetli taraklar proteini, histone mRNA'larının transkripsiyonunu ve işlenmesini düzenlemek için histone lokus cisimleri üretir7.  Bununla birlikte, kromatin ilişkili kondensatların keşfedildiği birçok örneğe rağmen, kondensat oluşumu, regülasyonu ve işlevinin altında bulunan mekanizmalar yeşaya iyi anlaşılmamaktadır. Özellikle, tüm kromatin ilişkili kondensatlar LLPS yoluyla oluşmaz ve canlı hücrelerde yoğuşma oluşumunun dikkatli değerlendirmelerine hala ihtiyaç vardır8,9. Örneğin, faredeki HP1 proteini canlı hücrelerde sıvı damlacıkları oluşturmak için sadece zayıf bir kapasiteye sahip olduğu ve heterokromatin odaklarının çökmüş polimer globülleri10gibi davrandığı gösterilmiştir. Bu nedenle, canlı hücrelerde kromatin üzerinde de novo kondensatları indükleyen araçlar, özellikle yoğuşma oluşumunun kinetiğini, ortaya çıkan kondensatların fiziksel ve kimyasal özelliklerini ve yoğuşma oluşumunun hücresel sonuçlarını izlemek için canlı görüntüleme ve biyokimyasal tahlillerin kullanılmasına izin veren araçlar arzu edilir.

Bu protokol, kromatin11'de protein kondensatlarını indük etmek için kimyasal bir karartma sistemi bildirir (Şekil 1A). Dimerizer iki bağlı protein etkileşimli liganddan oluşur: trimethoprim (TMP) ve Halo ligand ve konyak reseptörlerine kaynaşmış proteinleri küçültebilir: Escherichia coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR) ve bakteriyel alkildehalogenaz enzimi (Halo enzimi), sırasıyla12. Halo ligand ve Halo enzimi arasındaki etkileşim, Halo enziminin kromatin bağlayıcı bir proteine kaynaştırılarak bir çapa olarak kullanılmasına izin vererek eDHFR ile kaynaşmış faz ayırıcı bir proteini kromatin ile bir hale getirmek için kullanılır. İlk işe alımdan sonra, faz ayırma proteininin artan lokal konsantrasyonu faz ayırma için gereken kritik konsantrasyonu geçirir ve böylece çapadaki bir yoğuşma çekirdeklerini atar (Şekil 1B). Floresan proteinlerin (örneğin mCherry ve eGFP) eDHFR ve Halo'ya kaynaştırılmasıyla, floresan mikroskopi ile çekirdeklenme ve yoğuşmaların büyümesi gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. eDHFR ve TMP arasındaki etkileşim kurda olmayan olduğundan, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla ücretsiz TMP eklenebilir. Bu daha sonra faz ayırma proteinini çapadan serbest bırakacak ve kromatinle ilişkili yoğuşma çözünecektir.

Bu aracı telomer bakımı için alternatif bir telomer (ALT) yolu uzatma kullanan telomer negatif kanser hücrelerindeki telomerler üzerinde de novo promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunu teşvik etmek için kullandık13,14.  PML nükleer gövdeler, birçok nükleer proses15,16'da yer alan membransız bölmelerdir ve ALT telomer ilişkili PML gövdeleri 17,18için APB'ler oluşturmak için ALT telomerlere benzersiz bir şekilde lokalize edilir. Telomerler API'ler içinde kümelenir, muhtemelen ALT19'dahomolojiye yönelik telomer DNA sentezi için onarım şablonları sağlamak için. Gerçekten de, TELOMER DNA sentezi API'lerde tespit edilmiştir ve API'ler telomerlerde DNA onarım faktörlerini zenginleştirmede temel roller oynamaktadır20,21. Bununla birlikte, APB'ler içinde APB montajı ve telomer kümelemenin altında kalan mekanizmalar bilinmiyordu. ALT hücrelerindeki telomer proteinleri küçük ubiquitin benzeri değiştirici (SUMO' lar)22tarafından benzersiz bir şekilde değiştirildiğinden, birçok APB bileşeni sumoylation siteleri 22 , 23,24,25 ve/veya SU içerirMO ile etkileşime giren motifler (SIM'ler)26,27 ve SUMO-SIM etkileşimleri fazayrımını 28'egötürür, telomerler üzerindeki sumoilasyonun protein içeren SUMO/ SIM'in zenginleşmesine yol açtığını ve Bu proteinler arasındaki SUMO-SIM etkileşimleri faz ayrımına yol açar.  Üç sumoylation bölgesi ve bir SIM sitesi olan PML proteini, API'ler oluşturmak için sumoylated telomerlere işe alınabilir ve sıvı USB'lerin birleşmesi telomer kümelenmesine yol açar. Bu hipotezi test etmek için, telomerlere SIM alarak sumoilasyon kaynaklı APB oluşumunu taklit etmek için kimyasal dimerizasyon sistemini kullandık (Şekil 2A)11. GFP, görselleştirme için Haloenzim'e ve dimerizörü telomerlere tutturmak için telomer bağlayıcı protein TRF1'e kaynaştırılır. SIM, eDHFR ve mCherry ile kaynaşmıştır. Canlı hücre görüntüleme ile kondensat oluşumu ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi kinetiği takip edilir.  Faz ayrımı, eDHFR bağlama ile rekabet etmek için fazla boş TMP eklenerek tersine çevrilir. Kondens bileşimini ve telomerik ilişkiyi belirlemek için immünoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanılır. SIM alımı telomerlerde SUMO'yu zenginleştirir ve indüklenen kondensatlar PML içerir ve bu nedenle API'lerdir. SUMO ile etkileşime giremeyen bir SIM mutantını işe almak, TELOMERLER üzerinde SUMO'yu zenginleştirmez veya faz ayrımına neden olmaz, bu da APB yoğuşması için temel itici gücün SUMO-SIM etkileşimi olduğunu gösterir. Bu gözleme katılarak, TRF2 bağlayıcı faktör RAP1 ile kaynaşmış poliSUMO-polySIM polimerleri de APB oluşumunu teşvik edebilir29. Yeterli protein üretildiği sürece faz ayrımının gerçekleştiği poliSUMO-polisSIM füzyon sistemi ile karşılaştırıldığında, burada sunulan kimyasal dimerizasyon yaklaşımı talep üzerine faz ayrımına neden olur ve böylece faz ayırma ve telomer kümeleme işleminin kinetiğini izlemek için daha iyi zamansal çözünürlük sunar. Ek olarak, bu kimyasal dimerizasyon sistemi, faz ayırma ve telomer kümelemedeki yeteneklerini değerlendirmek için diğer proteinlerin işe alınmasına izin veriyor. Örneğin, telomerlere katılan düzensiz bir protein, APB oluşumunu teşvik etmeden damlacıklar ve küme telomerleri de oluşturabilir, bu da telomer kümelemenin APB kimyası bağımsız olduğunu ve sadece APB sıvı özelliğine dayandığını öne sürmez11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Geçici hücre hatlarının üretimi

  1. 6-6-D-lizin ile kaplanmış 22 x 22 mm cam kapaklar (canlı görüntüleme için) veya 12 mm çapında dairesel kapaklar (IF veya FISH için) üzerindeki Kültür U2OS kabul hücreleri büyüme ortamına sahip kuyu plakası (DMEM'de%10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin çözeltisi) %60-70 izdiah edene kadar.
  2. Transeksiyondan önce büyüme ortamını 1 mL transfeksiyon ortamı (Penisilin-Streptomisicin çözeltisi olmayan büyüme ortamı) ile değiştirin.
  3. Her transfeksiyon kuyusu için, 150 μL azaltılmış serum ortamına 4 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin, 10 saniye boyunca girdap ve ardından 5 dakika kuluçkaya yaslayın.
  4. Her kuyu için Halo yapı plazmid (Halo-GFP-TRF1 veya Halo-TRF1) ve eDHFR yapı plazmid (mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDHFR-) ekleyin SIM mutant) 1:1 kütle oranında (0,5 μg Halo yapı plazmid ile 0,5 μg eDHFR yapı plazmidi) ila 150 μL azaltılmış serum ortamı, damla yönünde, pipetleme ile karıştırın.
    NOT: Etiketler nispeten küçüktür (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) ve faz ayrımı üzerinde hiçbir etkisi gözlenmedi. Bununla birlikte, faz davranışının etiketlere değil mutasyonlara duyarlı olduğundan emin olmak için burada kullanılan SIM mutant gibi mutantların kullanılması tavsiye edilir. SIM PIASx28,30'dan. SIM dizisi AAAGTCGATGTATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT'dir. SIM mutant mutasyona uğrayan SIM amino asitler VIDL VADA28için, ve dizi AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGAAGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Plazmidlerimizi addgene için biriktirdik: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutant.
  5. 150 μL transfeksiyon reaktifi -azaltılmış serum ortam karışımını DNA ile 150 μL azaltılmış serum ortamına ekleyin, damla yönünde, pipetleme ile karıştırın, 5 dakika kuluçkaya bırakın.
  6. 300 μL transfeksiyon reaktif-DNA karışımını hücrelere damla yönünde ekleyin ve ardından hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.
  7. Canlı görüntüleme, immünofluoresans (IF) veya floresan in situ hibridizasyondan (FISH) önce 24-48 saat bekleyin.

2. Telomerlerde dimerizasyon

  1. Dimerizatörleri 10 mM'de dimetil sülfooksit içinde çözün ve uzun süreli depolama için plastik mikrosantrifüj tüplerinde −80 °C'de saklayın.
    NOT: TMP ile doğrudan Halo (TMP-Halo, TH) bağlantılı dimerizer kullanmak yerine, ışığa duyarlı bir bağlayıcıya sahip olan TMP-NVOC-Halo (TNH), TMP ve Haloligand arasında 6-nitroveratryl oksikarbonil (NVOC)kullanılır 31. Bunun nedeni, TNH'nin (~5 dakika) hücreye yayılması TH'den (~20 dakika) daha az zaman almasıdır. Burada gösterilen sonuçlar TH kullanılarak da elde edilebilir. TNH kullanırken, NOVC bölünmesini önlemek için karartıcıyı ışığa maruz bırakmamaya dikkat edin. TNH'yi loş kırmızı ışık lambalı karanlık bir odada ele alın, dimerizörü kehribar plastik tüplerde saklayın ve TNH içeren kabı veya işlenmiş hücreleri alüminyum folyo ile sarın. TNH'yi DIC ile görüntüleme güvenlidir.
  2. −80 °C'den 10 mM dimerizatörden oluşan bir aliquot alın ve görüntüleme ortamında seyrelterek 10 μM stok konsantrasyonuna ısıtın ve −20 °C'de saklayın.
  3. Kullanıma hazır olduğunuzda, dimerizatörleri 10 μM stok çözeltisinden büyüme ortamında (sabit görüntüleme için) veya görüntüleme ortamında 100 nM'lik son çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Canlı görüntüleme için sahnede 100 nM dimerizatör (son konsantrasyon) ile hücreleri tedavi edin veya immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) için 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kullanılan dimerizerlerin konsantrasyonu, küçültme verimliliğini ve dolayısıyla faz ayrımını etkiler. Maksimum dimerizasyon verimliliği sağlayan dimerizer konsantrasyonu hücre tipine ve çapa protein konsantrasyonuna bağlıdır, bu nedenle farklı deneyler için belirlenmesi gerekecektir. Basit bir yol, çapa proteinini ve mCherry-eDHFR'yi ifade eden hücreleri kuluçkaya yatırmak (proteini ayıran faza kaynaşmadan veya faz dışı bir ayırma mutantla kaynaştırmadan) ve çapadaki en yüksek mCherry yoğunluğunun elde edildiği dimerizer konsantrasyonunu tanımlamaktır. Daha sistematik bir yaklaşım, çapayı ifade eden hücreleri sadece farklı dimerizatör konsantrasyonlarıyla ve daha sonra Halo bağlama boya yoğunluğunun platolaşmaya başladığı dimerizer konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olmak için bir Halo bağlama boyası ile kuluçkaya yatırmaktır (yani, tüm Halo kaynaşmış ankrajlar karartıcı tarafından işgal edilir ve Halo bağlama boyası için daha fazla kalmaz)32.
  4. Küçültmeyi tersine çevirmek için, hücreleri 2-5 saat boyunca (canlı görüntülemeli veya canlı görüntülemesiz) veya istenen damlacık boyutu elde edilene kadar dimerizatörlerle kuluçkaya yatırın ve hücrelere görüntüleme ortamında seyreltilmiş 100 μM serbest TMP (son konsantrasyon) ekleyin.

3. İmmünoresans (IF)

  1. Tohum 105 hücre üzerinde 12 mm çapında dairesel kapak camları 6-kuyu plakasında poli-D-lizin ile kaplanmıştır. Daha sonra iki plazmidi (mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDHFR-SIM mutantlı Halo-GFP-TRF1) transfect ve immünofluoresansa geçmeden önce 24-48 saat bekleyin.
    NOT: Transfection daha yüksek ifade elde ettikten sonra birden fazla gün bekleyin.
  2. 100 nM'lik son konsantrasyona ulaşmak için dimerizatörleri büyüme ortamı ile seyreltin, hücrelere seyreltilmiş dimerizerler ekleyin ve 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Faz ayrımı, kısıcılar (< 30 dakika) ekledikten sonra hızla indüklendi. Daha uzun inkübasyon, damlacıkların daha büyük boyutlarda kabalaşmasına yardımcı olur. Canlı görüntüleme ile damlacık büyümesini takip etmek, damlacıkların istenen duruma ulaşma süresini belirlemek için kullanılabilir.
  3. Pbs çözeltisinde % 4 formaldehit ve% 0.1 Triton X-100 içeren hücreleri, hücrelerin dengesini sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sabitlayın. PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
    NOT: Bu adımdan sonra duraklatılabilir ve hücreler bir haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir.
    Dikkat: Formaldehit solunması ile zararlıdır ve yutulduğunda gözleri, solunum sistemini ve cildi de tahriş eder ve olası bir kanser tehlikesidir. Kişisel koruyucu ekipman giymeniz gerekir, sadece kimyasal bir duman kaputunda kullanın. Ayrıca kullanımdan sonra bir atık kabına koyun, lavaboya atmayın.
  4. Kapakları 50 μL TBS-Tx ile iki kez ve 50 μL Antikor Seyreltme Tamponu (AbDil) ile bir kez yıkayın. TBS-Tx, TBS, %0.1 Triton X-100 ve %0.05 Na-azide tarafından yapıldı. AbDil TBS-Tx, %2 BSA ve %0.05 Na-azide tarafından yapılmıştır.
  5. Her kapak kapağını 50 μL primer anti-PML (AbDil'de 1:50 seyreltme) / anti-SUMO1 (AbDil'de 1:200 seyreltme) / anti-SUMO2/3 antikoru (AbDil'de 1:200 seyreltme) ile bir gecede nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de kuluçkaya yatırın. mCherry antikor, FISH için mCherry sinyalini tespit etmeye yardımcı olmak için de kullanılabilir (AbDil'de 1:200 seyreltme).
    NOT: FISH, mCherry floresan sinyalini sorgular, bu da mCherry plazmidleri ile enfekte olmuş hücreleri FISH deneylerinde bulaşmamış olanlardan ayırt etmeyi zorlaştırır. mCherry antikor kullanılması tavsiye edilir. Alternatif olarak, protein içeren eDHFR'yi ifade eden kararlı bir hücre hattı yapılabilir.
  6. İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için kapakları AbDil ile 3 kez yıkayın.
  7. PML ve SUMO için Alexa Fluor 647 ile eşlenen ikincil antikor [anti-fare IgG (H +L) ikincil antikoru, mCherry için Alexa Fluor 555 ile konjuge edilen anti-tavşan IgG (H +L) ikincil antikoru ile hücreleri kuluçkaya bırakın, her ikisi de AbDil'de 1:1000 seyreltmede] oda sıcaklığında 1 saat boyunca.
  8. Kapak örtülerini TBS-Tx ile 3 kez yıkayın.
  9. Etiket slaytları, DAPI'yı montaj ortamlarında seyrelterek 1 μg/mL'lik DAPI son konsantrasyonuna ulaşın. Ardından kaydırağa 2 μL seyreltilmiş DAPI koyun. Kapakları ters çevirin ve DAPI damlasına yerleştirin, kapak kapağının kenarından ekstra sıvı ispi.
  10. Oje ile kapatın, kurumaya bırakın ve kapak kapağının üstünden suyla durulayın. Görüntüleme için dondurucuya sakla.

4. Floresan yerinde hibridizasyon (FISH)

  1. Tohum 105 hücre üzerinde 12 mm çapında dairesel kapak camları 6-kuyu plakasında poli-D-lizin ile kaplanmıştır. Halo-TRF1 ve mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDHFR-SIM mutant plazmidleri ile hücreleri transfect edin ve FISH'e geçmeden önce 24-48 saat bekleyin. Küçültme adımı 3.2'de açıklananla aynıdır.
    NOT: Burada TRF1 GFP ile kaynaşmamıştır, bu nedenle yeşil kanal telomer DNA probu için serbest bırakılır.
  2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca % 4 formaldehit içeren hücreleri sabitlayın ve PBS ile 4 kez yıkayın. IF-FISH için, if protokolüne buradan devam edin ve IF 'de (3.8) ikincil antikorları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit içeren hücreleri refix ve PBS ile üç kez yıkayın.
  3. Bir etanol serisinde dehidrat kapaklar (%70, %80, %90, her biri 2 dakika).
  4. 5 dakika boyunca 75 °C'de 5 μL hibridizasyon çözeltisinde 488 telC PNA probu (1:2000 oranı) ile kapakları inkübasyon. Hibridizasyon çözeltisi% 70 deiyonize formamid, 10 mM Tris (pH 7.4), % 0.5 blok reaktif içerir. Daha sonra oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  5. Kapak kapaklarını yıkama tamponu (%70 formamid, 10 mM Tris) ile oda sıcaklığında 3 kez 2 dakika yıkayın ve görüntüleme için montaj ortamlarında 1 μg/mL DAPI ile monte edin.
    NOT: FISH protokolü yayınlanan bir protokoldür33'34.

5. Canlı görüntüleme

  1. Hücreler görüntülemeye hazır olduğunda, çevre odasında ısıtılmış bir aşamada fenol kırmızısı olmadan 1 mL görüntüleme ortamında tutulan hücrelerle manyetik odalara kapakları monte edin.
  2. Mikroskop ve çevre kontrol aparatı kurun. Görüntüler, 100x 1.4 NA hedefine sahip dönen disk konfokal mikroskop, Piezo Z-Drive, elektron çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilen 455, 488, 561, 594 ve 647 nm lazerlerle donatılmış bir lazer birleştirme modülü ile elde edildi. Tüm lazerler için çıkış güçleri fiber uçta 20 mW ölçülür.
  3. Telomerlerde parlak GFP sinyali ve nükleoplazmda difüzif olarak lokalize mCherry sinyali olan hücreleri bulun. Yaklaşık 20 hücre bulun, her pozisyonu x, y, z bilgileriyle ezberleyin ve hem GFP hem de mCherry kanalları için 2-4 saat boyunca Z'de toplam 8 μm ve 5 dakikalık zaman aralığı için 0,5 μm aralıkla zaman atlamalı görüntüleme için parametreler ayarlayın. 594 nm'nin %30'unu ve 488 nm güç yoğunluğunun %50'sini kullanın, pozlama süreleri 200 ms ve kamera kazancı 300'dür.
    NOT: Lazer ünitelerinin çıkış gücü 20 mW'tır. Parlak GFP odakları, kondensatları daha kolay çekebilen daha büyük çapa boyutunu gösterir. Faz ayrımı hücredeki SIM konsantrasyonuna bağlı olduğundan, çok çeşitli mCherry sinyaline sahip hücreleri bulun. Çok loş veya çok parlak mCherry sinyaline sahip hücreler fazı ayıramayabilir. Fotobleaching önlemek için, çok fazla lazer gücü veya çok uzun pozlama süresi kullanmayın.
  4. Görüntülemeye başlayın ve bir kerelik döngüyü ön dimerizasyon olarak alın. Görüntülemeyi duraklatın, sahnedeki görüntüleme odasına 15 μL 10 μM dimerizer içeren 0,5 mL görüntüleme ortamı ekleyin, böylece son dimerizer konsantrasyonu 100 nM olacaktır. Görüntülemeye devam edin.
  5. Dimerizasyonu tersine çevirmeye hazır olduğunuzda, görüntülemeyi duraklatın, 100 μM TMP son konsantrasyonu elde etmek için sahnedeki görüntüleme odasına 2 μL 100 mM stok TMP içeren 0,5 mL görüntüleme ortamı ekleyin. Görüntüleme hücrelerine 1-2 saat devam edin.

6. Sabit görüntüleme

  1. Canlı görüntüleme ile aynı mikroskop, sahne ısıtması gerekli değildir. Telomer FISH'i görüntülemek için 488 nm, mCherry IF için 561 nm ve PML veya SUMO IF için 647 nm kullanın.
    NOT: Bir mCherry antikoru kullanmıyorsanız, sadece doğrudan mCherry proteinini görüntüleyin, ancak FISH'te söndürme nedeniyle sinyal belki sönük olabilir.  Cy5'ten mCherry'ye sinyal kanamasını önlemek için mCherry'yi görüntülemek için 594 nm lazer yerine 561 nm kullanın.
  2. Transfected hücreler için seçmek üzere kırmızı sinyalli (mCherry veya mCherry IF) yaklaşık 30-50 hücre bulun.
  3. Görüntüler, daha fazla sinyal toplamak için Z'de toplam 8 μm boyunca 0,3 μm aralıkla çekildi. 647 nm'nin %80'ini, 561 nm'nin %80'ini ve 488 nm güç yoğunluğunun %70'ini kullanın, pozlama süreleri 600 ms ve kamera kazancı 300'dür.

7. Zaman atlamalı görüntüleri işleyin

  1. Telomerler için ikili tanımla
    Tüm zamanların ve z-yığını bilgilerinin olduğu bir hücre seçin, yalnızca GFP kanalını seçin ve eşiği tanımlayarak ikili bir katman oluşturun. Eşiğin alt ve üst değerlerini ayarlayın ve eşiğin istenen nesneleri tüm zaman noktalarından ne kadar iyi toplar görmek için "Düzgün", "Temiz" ve "Delikleri doldur" gibi işlevleri kullanın.
  2. Arka planı çıkarma
    Tüm kanalları seçin, arka plana dikdörtgen İlgi Alanı (ROI) çizin (hücrenin yanı sıra). Bu yatırım getirisini arka plan olarak tanımlayın ve arka plan yoğunluğunu çıkarın.
  3. Telomer ikilisini telomer yoğunluğuna bağlayin
    Telomer ikilisini seçin ve ikili nesnelerdeki GFP yoğunluğunu telomer yoğunluğu olarak hesaplamak için GFP kanalına bağlayın.
  4. Zaman içinde telomer sayısını ve yoğunluğunu hesaplama
    Zaman, nesne kimliği, ortalama yoğunluk, toplam yoğunluğu ve verme verileri gibi hangi bilgilerin verileceğini belirtin. Dışa aktarılan tabloyu okumak ve zaman içinde telomer sayısı ve telomer yoğunluğu rakamları oluşturmak için şekil çizim yazılımını kullanın (her telomerdeki hacim üzerindeki yoğunluğu özetleyin ve sonra bir hücredeki tüm telomerlerin ortalamasını elde edin).

8. Sabit hücreli görüntüleri işleyin

  1. API'ler için ikili tanımlama
    561nm kanalında sinyal arayarak analiz için transfected hücreleri seçin. 7.1'deki prosedürü takiben, sırasıyla telomerler ve PML gövdeleri veya SUMO için ikili oluşturmak için hem GFP (telomer DNA FISH) hem de Cy5 (PML veya SUMO IF) kanalında eşik tanımlayın. GFP ve Cy5 ikili katmanlarını birleştirin ve telomerler ve dolayısıyla API'ler üzerinde PML gövdesinin birlikte yerelleştirilmesini temsil etmek için her ikisi de GFP ve Cy5 sinyaline sahip parçacıklar içeren yeni bir katman oluşturun.
  2. APB/SUMO sayısını ve yoğunluğunu hesaplama
    7.2'den sonra görüntü arka planını çıkarın. APB/SUMO ikili katmanini 7.3'ü izleyen Cy5 kanalına bağlayin. APB/SUMO sayısını ve yoğunluğunu hesaplayın. 7.4'ün ardından verileri dışa ve çizim yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Telomer DNA FISH ve SUMO protein IF ile tanımlanan SUMO'nun telomer lokalizasyonunun temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. SIM işe alımı olan hücreler, SIM mutant işe alımı olan hücrelere kıyasla telomerler üzerinde SUMO1 ve SUMO 2/3'ü zenginleştirdi. Bu, telomerlerde SIM dimerizasyon kaynaklı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.

Küçültme sonrası TRF1 ve SIM'in temsili bir zaman atlamalı filmi Video 1'de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, telomerler üzerindeki kondensatların kimyasal bir dimerizasyon sistemi ile oluşumunu ve çözünmesini göstermiştir. Faz ayırma kinetiği ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi canlı görüntüleme ile izlenir. Yoğuşma lokalizasyonu ve bileşimi DNA FISH ve protein IF ile belirlenir.

Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi protein ve dimerizer konsantrasyonunu belirlemektir. Genomik bir lokusta lokal faz ayrımını teşvik etmedeki başarı, faz ayırma için kritik konsantrasyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (1K22CA23763201'den H.Z.'ye, GM118510'dan D.M.C.'ye) ve Charles E. Kaufman vakfı tarafından H.Z. Yazarlar, makaleyi düzelttikten sonra Jason Tones'a teşekkür etmek istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat içermeyen HBSS'de %0,25 Tripsin, %0,1 EDTACorningMT25053CI
%16 Formaldehit (a/h), Metanol içermezThermo Scientific289061x PBS'de %1
hazırlayın 6 Kuyulu Kültür PlakasıVWR10861-554
Alüminyum FolyoFisher Scientific01-213-101
Anti-mCherry antikoruAbcamAb183628
Anti-PML antikoruSanta Cruzsc966
Anti-SUMO1 antikoruAbcamAb32058
Anti-SUMO2/3 antikoruHücre iskeletiAsm23
Bloke Edici ReaktifRoche11096176001
Sığır Serumu Albümini (BSA)Fisher ScientificBP9706100
BTX Tüp mikro 1.5ML VWR89511-258
Daire Kapak SlipleriThermo Scientific3350
Konfokal mikroskop NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
Dimetil Sülfoksit Sigma-Aldrich
DMEMCorning
EMCCD KameraiXon Life 897
EtanolFisher Scientific4355221
Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, USDA onaylı BölgelerGibcoA4766801
Formamid, DeiyonizeMilliporeSigma46-101-00ML
Keçi Anti-Fare IgG (H + L), Rekombinant İkincil Antikor, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), Rekombinant İkincil Antikor, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
Yüksek Hassasiyetli Düz Konik Ultra İnce Nokta Cımbız / ForsepsFisher Scientific12-000-122
Lazer birleştirme modülü NikonNIIMHF47180
Leibovitz'in L-15 OrtaGibco21083027
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiInvitrogen11668027
Şekil çizim yazılımı, MATLABMathWorks
Mikroskop Slayt KutusuFisher Scientific34487
OjeFisher Scientific50-949-071
Görüntüleme yazılımı, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10X, pH 7.4Fisher Scientific70-011-044
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
Pipet UçlarıVWR10017
Düz ve Buzlu Kırpılmış Köşe Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific22-037-246
Poli-D-Lizin çözeltisiSigma-AldrichA-003-E
Sodyum AzidFisher ScientificBP922I-500
Eğirme diskiYokogawaCSU-X1
Kare Kapak SlipleriThermo Scientific3305
TBS 10x çözeltiFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPChenoweth labİstek üzerine temin edilebilir
Chenoweth labTNHİstek
Tris ÇözümüFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 %10 ÇözeltiMilliporeSigma64-846-350ML1x PBS U2Os hücre hattında% 0.5 hazırlayın
HTB-96
VECTASHIELD Antifade Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıNC9524612
L-Glutamin, 4.5g/L Glikoz ve Sodyum Piruvat ile 472301 MT10017CV tarafından sentezlenmiştir tarafından sentezlenenüzerine temin edilebilir EV Makayev laboratuvarından (Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur)

Kaynaklar

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Telomer K melenmesiFaz Ayr masKromatin KondensatlarCanl H cre G r nt lememm nofloresan FISHSUMO SIM Etkile imiYak nl k EtiketlemePML Nukleer Cisimleri
Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.