Method Article

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlara maruz kalarak farklı hücresel tepkilere neden oluyor. Biyokimyasal ve genetik yaklaşımların uygulanması, DNA hasarı yerinde DNA onarım komplekslerinin işe alınması ve montajı ile ilişkili hücresel olayların ortaya alınmasında esastır. Son birkaç yılda, bölgeye özgü DNA hasarına neden olacak birkaç güçlü araç geliştirilmiştir. Ayrıca, yeni ufuk açıcı teknikler, bu süreçleri hem sabit hem de canlı hücreleri kullanarak tek hücre çözünürlük düzeyinde incelememizi sağlar. Bu teknikler çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kullanılmış olsa da, burada DNA onarımı, Floresan İmmünostaining (IF) ve Chromatin İmmün Önseçim (ChIP) alanında en yaygın kullanılan protokolleri sunuyoruz, bu da endononikleaz bazlı sahaya özgü DNA hasarı ile birlikte DNA onarım faktörlerinin genomik doluluğunun yönlendirilmiş ve düzenlenmiş bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini mümkün kılmaktadır, sırasıyla. Bu teknikler, araştırmacıların hasarlı genomik lokusa bağlı yeni proteinleri ve DNA onarımı sırasında ince ayar düzenlemeleri için gerekli çeviri sonrası modifikasyonlarını tanımlamaları için güçlü araçlar sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomumuz sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlar tarafından zorlanıyor. Bu saldırılar, UV ışığı veya ışınlama gibi çevresel kaynaklardan ve oksidatif stres veya replikasyon hatalarından kaynaklanan metabolik yan ürünler gibi endojen kaynaklardan türetilebilir1,2. Bu lezyonlar bir veya her iki DNA teli bütünlüğünü etkileyebilir ve oluşturulan hatalar kalıcı hale gelirse, sıklıkla translokasyonlara ve genom kararsızlığına yol açar ve bu da tümöregenez3,4ile sonuçlanabilir. Genom bütünlüğünü korumak için evrim sırasında birden fazla onarım sistem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Spesifik proteinlerin immünodeteksiyon

  1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deneysel kurulum
    1. %10 fetal baldır serumu, 2 mM glutamin ve %1 antibiyotik-antimycotic çözelti ile desteklenmiş DMEM kültür ortamında monolayerlerde U2OS hücrelerini koruyun.
      NOT: Endonükleaz bazlı DNA hasarı indüksiyonu için, sistem sızıntısını önlemek için kömürle işlenmiş veya steroid içermeyen ortam kullanın.
    2. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 ortamında% 80 izdiah edene kadar büyütün ve her 2-3 günde bir ortamı yenileyin.
    3. Ortamı emiş edin ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri Tripsin-EDTA çözeltisi ile ayır. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerde bölgeye yönelik DSB kaynaklı onarım süreçlerinin incelenmesi, stabil veya geçici transeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bununla birlikte, kararlı transfeksiyonunun homojen bir hücre popülasyonu sağladığı ve bunun da birleşik ve dolayısıyla daha güvenilir bir hücresel yanıt verdiği belirtilmelidir. Geçici transfeksiyon durumunda, hücre popülasyonunun sadece küçük bir kısmı plazmid alır ve korur, bu da deneye çeşitlilik sağlar. ER-I-PpoI veya ER-AsiSI endonucleaz tabanlı hücre sistemlerinin kurulması, endononikle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA onarımı nispeten yeni bir araştırma alanı olmasına rağmen, çeşitli biyokimyasal ve mikroskobik yöntemlerin yardımıyla bilgimiz hızla genişlemektedir. Onarım süreçlerinde yer alan genlerde meydana gelen mutasyonlar tümöregenezin önde gelen nedenleri arasında yer aldığından ve bu nedenle DNA onarım yollarının temel adımlarını aydınlatmak gerekli olduğundan, genetik bilgilerin korunması hücreler için çok önemlidir.

Biyokimyasal teknikler (örneğin, batı lekesi, immüno-prekipitasyon, kütle spek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi hibe GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, Macar Bilimler Akademisi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO kısa süreli bursu 8513 ve Tempus Vakfı'nın János Bolyai Araştırma Bursu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgarozLonza50004
Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (100 kez;), StabilizeSigma AldrichA5955
Anti-gama H2A. X (fosfo S139) antikoruAbcamab26350
Sığır Serumu Fraksiyonu V albüminBioseraPM-T1725
TrackIt & trade; Camgöbeği / Sarı Yükleme TamponuThermo Fisher Scientific10482035
DMEM, 1.0 g / L Glikozlu, L-GlutaminLonza12-707F
DoksisiklinSigma AldrichD9891
Dynabeads ve ticaret; M-280 Koyun Anti-Fare IgGInvitrogen11202D
Dynabeads & Trade; M-280 Koyun Anti-Tavşan IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
Etanol Molar Kimyasalları02910-101-340
Fetal Sığır Serumu (Güney Amerika Menşeli), AB onaylıGibcoECS0180L
Formaldehit %37 asitiçermeyen çözeltiSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX ve ticaret; Ek ThermoFisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kiti v2DiagenodeC03010015
İzoamil alkolSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Streptomyces carzinostaticus'tan neokarzinostatinSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
Ca2 +, Mg2 +Sigma AldrichL182-50-BC
FenolSigma AldrichP4557
BORULARSigma AldrichP1851
Polisorbat 20 (Tween 20)Molar Kimyasallar09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong ve ticaret; DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti IRoche11873580001
Proteinaz KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antikoruAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Asetat-EDTA tamponuSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Kimyasallar09370-006-340
Domuz pankreasından tripsinSigma AldrichT4799
Tripsin-EDTA (% 0.5), fenol kırmızısıGibco15400054
içermeyen PBS Tozu içermez

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles