Method Article

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlara maruz kalarak farklı hücresel tepkilere neden oluyor. Biyokimyasal ve genetik yaklaşımların uygulanması, DNA hasarı yerinde DNA onarım komplekslerinin işe alınması ve montajı ile ilişkili hücresel olayların ortaya alınmasında esastır. Son birkaç yılda, bölgeye özgü DNA hasarına neden olacak birkaç güçlü araç geliştirilmiştir. Ayrıca, yeni ufuk açıcı teknikler, bu süreçleri hem sabit hem de canlı hücreleri kullanarak tek hücre çözünürlük düzeyinde incelememizi sağlar. Bu teknikler çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kullanılmış olsa da, burada DNA onarımı, Floresan İmmünostaining (IF) ve Chromatin İmmün Önseçim (ChIP) alanında en yaygın kullanılan protokolleri sunuyoruz, bu da endononikleaz bazlı sahaya özgü DNA hasarı ile birlikte DNA onarım faktörlerinin genomik doluluğunun yönlendirilmiş ve düzenlenmiş bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini mümkün kılmaktadır, sırasıyla. Bu teknikler, araştırmacıların hasarlı genomik lokusa bağlı yeni proteinleri ve DNA onarımı sırasında ince ayar düzenlemeleri için gerekli çeviri sonrası modifikasyonlarını tanımlamaları için güçlü araçlar sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomumuz sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlar tarafından zorlanıyor. Bu saldırılar, UV ışığı veya ışınlama gibi çevresel kaynaklardan ve oksidatif stres veya replikasyon hatalarından kaynaklanan metabolik yan ürünler gibi endojen kaynaklardan türetilebilir1,2. Bu lezyonlar bir veya her iki DNA teli bütünlüğünü etkileyebilir ve oluşturulan hatalar kalıcı hale gelirse, sıklıkla translokasyonlara ve genom kararsızlığına yol açar ve bu da tümöregenez3,4ile sonuçlanabilir. Genom bütünlüğünü korumak için evrim sırasında birden fazla onarım sistemi geliştirilmiştir. Belirli DNA hasarı türlerinin kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre, birden fazla onarım mekanizması etkinleştirilebilir. Uyuşmazlıklar, abasik siteler, tek iplik kopmalar ve 8 oxoguanine (8-oxoG) uyumsuz onarım veya baz eksizyon onarım yolu5,6ile çıkarılabilir. UV kaynaklı fotoprodüktürlerin ve hacimli adductların neden olduğu lezyonlar nükleotid eksizyon onarımı (NER) veya DNA çift iplikçik kırma onarımı (DSBR) işlemi ile onarılabilir7,8. NER iki ana alt yoldan oluşur: transkripsiyon bağlantılı NER (TC-NER) ve küresel genomik NER (GG-NER). Hücre döngüsü fazı ile ilgili olarak, DNA çift iplikçik kırılması indüksiyonunu takiben, iki alt yol etkinleştirilebilir: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR)1,9. Dinlenme hücrelerinde baskın yol olan NHEJ, tüm hücre döngüsü aşamalarında aktive edilebilir, daha hızlı ama hataya eğilimli bir yolu temsil eder10. Öte yandan, İk, DSB'lerin kardeş kromatların sıra-homoloji aramasına göre onarıldığı hatasız bir yoldur, bu nedenle esas olarak S ve G2 hücre döngüsü aşamalarında bulunur11. Ayrıca, mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ), kırık DNA uçlarını kuşatan daha önce resepsiyon edilmiş mikrohomolog dizilerin KU70/80 ve RAD51'den bağımsız yeniden ligasyon yoluna dayanan, yukarıda belirtilenlerden farklı başka bir DSB onarım mekanizmasıdır. Bu nedenle, MMEJ hataya eğilimli ve son derece mutajenik olarak kabul edilir12. DNA onarımı sırasında, DSB'ler DNA hasar yanıtını (DDR) indükleyebilir, bu da onarım sırasında hücre döngüsünü durduran kontrol noktası kinazlarının aktivasyonu ile sonuçlanır13,14,15. DDR, onarım sürecinin başlatıcı kilit oyuncularının lezyonlar etrafında işe alınmasına ve kapsamlı bir şekilde yayılmasına yanıt olarak etkinleştirilir ve bir onarım odağının oluşumuna katkıda girer. Bu erken sinyal çağlayanında, ATM (Ataxia Telangiectasia Mutasyona Uğramış) kinaz, Ser139'daki histone varyantı H2AX'ın fosforilasyonunu katalize ederek (φH2AX olarak adlandırılır) lezyon16etrafında önemli bir rol oynar. Bu erken olay, ek onarım faktörlerinin işe alınmasından ve aşağı akış onarım süreçlerinin başlatılmasından sorumludur. İşe alınan proteinlerin onarım odağındaki tam işlevi henüz tam olarak karakterize edilemese de, onarım odaklarının oluşumu ve dinamikleri birkaç laboratuvar tarafından araştırılmıştır. Bu belirteçler onarım kinetiğini takip etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak onarım işlemi sırasındaki kesin rolleri zor olmaya devam etmektedir. DNA onarımı ile ilgili hücresel süreçlerin büyük öneme sahip olmasına rağmen zayıf anlaşılması nedeniyle, DDR'yi teşvik etmek ve görselleştirmek için şimdiye kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.

İstenilen DNA hasarı türünü indük etmek için çeşitli yöntem ve sistemler kurulmuştur. Örneğin, bazı ajanlar [neokarzinostatin (NCS), fenomisin, bleomisin, γ ışınlama, UV] tahmin edilemeyen genomik pozisyonlarda çok sayıda rastgele DNA kırılmasına neden olabilirken, diğerleri (AsiSI, I-PpoI veya I-SceI gibi endonikülalar ve lazer şeritleme) bilinen genomik loci17 , 18,19,20,21'de DNA kırılmalarına neden olabilir. Burada, memeli ve maya hücrelerinde DDR'yi incelemek için şu anda kullanılan endonücleaz bazlı tekniklere odaklanıyoruz. Bu tekniklerin ilkelerini vurgulamanın yanı sıra, hem avantajlarını hem de dezavantajlarını vurguluyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Spesifik proteinlerin immünodeteksiyon

  1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deneysel kurulum
    1. %10 fetal baldır serumu, 2 mM glutamin ve %1 antibiyotik-antimycotic çözelti ile desteklenmiş DMEM kültür ortamında monolayerlerde U2OS hücrelerini koruyun.
      NOT: Endonükleaz bazlı DNA hasarı indüksiyonu için, sistem sızıntısını önlemek için kömürle işlenmiş veya steroid içermeyen ortam kullanın.
    2. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 ortamında% 80 izdiah edene kadar büyütün ve her 2-3 günde bir ortamı yenileyin.
    3. Ortamı emiş edin ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri Tripsin-EDTA çözeltisi ile ayır. Hücreler ayırdığında, hücrelere kültür ortamı ekleyerek trypsin etkinliğini durdurun ve bir hücre süspansiyonu elde edin.
    4. Hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Plaka 2 x 104 hücre /mL/kuyu üzerinde 24 kuyulu bir plaka, her kuyuda steril 12 mm yuvarlak kapaklar.
    5. Kapak altlarına bağlanmaya izin vermek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de24 saat boyunca kuluçkaya bırakın.
    6. Zarar verici ajanı doğrudan kültürlü ortama pipetleterek hücreleri 10 ng/mL neokarzinostatin (NCS) ile tedavi edin. Hücreleri NCS içeren ortamla 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 1x PBS ile yıkayın ve hücrelere taze, takviyeli kültür ortamı ekleyin. Aksi takdirde, ortamı yenilemeden endonükleaz tabanlı sistemler aracılığıyla DSB'leri teşvik etmek için uygun aracıyı (yani 4-OHT) kullanın22.
      NOT: Alternatif olarak, 2-20Gy23 arasında nötron akısı kullanarak 30 dakika ila 8 saat iyileşme süresi arasında değişen DNA hasarına neden olmak için ışınlama kullanın.
    7. DNA onarımının kinetiğini takip etmek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de1-8 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Hücrelerin sabitlenmesi
    NOT: Tüm hücreleri yeterince kapsayacak şekilde aşağıdaki adımlarda (adım 1.2-1.5) 300-500 μL çözelti/kuyu kullanılmalıdır. Her inkübasyon ve yıkama adımı (antikor inkübasyonu hariç) hafif ajitasyonlu bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde yapılmalıdır.
    1. DSB indüksiyonu ve hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortamı bağlı hücrelerden çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın.
    2. Hücreleri 25 °C'de 20 dakika boyunca %4 formaldehit-PBS çözeltisi ile sabitleyin.
  3. Hücrelerin permeabilizasyonu
    1. Sabitleme solüsyonını çıkarın ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    2. PBS'yi çıkarın ve PBS'de çözünmüş %0,2 Triton X-100 ekleyin. Örnekleri 20 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Belirli olmayan bağlama sitelerinin engellenmesi
    1. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    2. PBST ile seyreltilmiş %5 BSA (Sığır Serum Fraksiyonu V albümin) ile spesifik olmayan bağlama bölgelerini engelleyin (%0,1 Ara-20 ile desteklenmiş 1x PBS) ve permeabilize numuneleri en az 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. İmmünofluoresans boyama
    1. %1 BSA-PBST çözeltisinde seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikoru (yani anti-φH2AX, anti-DNA-PKcs) ekleyin. Her kapak kapağını, seyreltilmiş anti-φH2AX antikorunun 10 μL'lik bir damlacık üzerine bir parafin filminin üzerine baş aşağı yerleştirin.
      NOT: Birlikte immünostaining durumunda her iki antikor da aynı % 1 BSA-PBST çözeltisinde uygun şekilde seyreltilir.
    2. Numuneleri 4 °C'de 1,5 saat boyunca bir nem odasında kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka geceleme 4 °C'de de yapılabilir.
    3. Kapakları 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    4. %1 BSA-PBST'de seyreltilmiş uygun miktarda ikincil antikor ekleyin. Her kapak kapağını seyreltilmiş antikorun 10 μL damlacık üzerine bir parafin filmine baş aşağı yerleştirin.
    5. Numuneleri 4 °C'de bir nem haznesinde 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Kapakları 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    7. Son PBS yıkama solüsyonunun çıkarılmasından önce, kapakları bir cımbız ve iğne kullanarak hafifçe çıkarın ve ardından montaj ortamının damlacıkları ile cam slaytlara baş aşağı yerleştirin (DAPI ile birlikte).
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçının. Montaj ortamı kuruduğunda, numunelerin buruşmasını önlemek için kapakların kenarlarının oje ile kapatılması önerilir.

2. Kromatin immün önksepitasyonu

  1. Hücre toplama, çapraz bağlama, hücre ve nükleer liziz ve DNA parçalanması
    1. Her örnek için 150 mm'lik bir tabakta yaklaşık 5 x 106 hücre/mL kültür.
    2. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri buz gibi 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    3. Hücreleri% 1 formaldehit-PBS çözeltisi ile sabitlayın, plakaları bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin ve 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
      NOT: Formaldehit uçucudur; her zaman yeni bir çalışma çözümü hazırlayın. Bazı durumlarda, formaldehit çözeltisi stabilize etmek için metanol içerir, ancak aşağı akış reaksiyonlarına müdahaleyi önlemek için metanol içermeyen bir çözelti kullanmak daha iyidir.
    4. 125 mM glisinin sabitlemeyi durdurun ve 25 °C'de 5 dakika boyunca hafif ajitasyon ile yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
    5. Tabakları buza yerleştirin ve buz gibi 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    6. Hücreleri buz gibi 1x PBS'de kazıyın ve 15 mL konik tüplere aktarın.
    7. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve peletin 2 mL hücre liziz tamponunda [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, % 0.5 NP-40, 1x PIC (proteaz inhibitörü kokteyli)] ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    9. Hücre süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüj edin.
    10. Süpernatantı dikkatlice atın ve peletin 500-1.500 μL nükleer lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, % 0.8 SDS, 1x PIC) yeniden biriktirin ve buz üzerinde 30-60 dakika kuluçkaya yatırın. Lisat sonikasyon için uygun bir polistiren konik tüp içine aktarın.
      NOT: Nükleer lizis tamponu SDS içerdiğinden, buzun üzerine çöker ve çözelti beyaza döner. Çözüm sonication sonra şeffaf açılmalıdır.
    11. DNA'yı yammak için lisat'ı ortalama 300-1.000 bp'lik bir parça boyutuna sonicate edin.
      NOT: Uygun sonikasyon döngüleri ve koşulları hücre tipine ve sonication ekipmanına göre ayarlanmalıdır. 200 bp'den küçük parçalar ChIP için uygun değildir, çünkü nükleozom-DNA etkileşimleri bozulabilir.
  2. Çapraz bağlamanın tersine çevrilmesi, sonik parça boyutlarının belirlenmesi
    1. Sonicated kromatin parça boyutunu doğrulamak için sonicated örnek 100 μL dışarı alın. Kalan kromatin −80 °C'de saklanmalıdır.
    2. Numunenin her 100 μL'sine 0,5 mg/mL RNase A ekleyin ve RNaz'ı etkinleştirmek için 20 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Numuneleri gece boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. Ertesi gün, 500 μg / mL Proteinaz K ve% 0.5 SDS ekleyin ve numuneleri 50 ° C'de 3 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    5. Her numuneye 0,5 hacim fenol ve 0,5 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    6. 1 dakika boyunca girdap.
    7. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    8. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    9. Her numuneye 1 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    10. 1 dakika boyunca girdap.
    11. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    12. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    13. 2,5 cilt %96 etanol ve 0,1 hacim 3 M Na-Asetat pH 5,2 ekleyin.
    14. −80 °C'de en az 20 dakika kuluçkaya yatır.
    15. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    16. Etanol çıkarın ve peletin% 70 etanol 400 μL ile yıkayın.
    17. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    18. Etanol çıkarın ve peletin havasını kurutun.
    19. Peletin 10 μL TE'de yeniden süzülür.
    20. Örnekleri% 0.8 agarose jel üzerinde çalıştırın. Soniklenmiş kromatin boyutu yaklaşık 500 bp olmalıdır.
      NOT: Bromophenol mavi içermeyen yükleme tamponu kullanın, çünkü bu boyanın boyutu yaklaşık 500 bp'dir, bu da kromatin parçalarının doğru algılanmasını bozabilir. Bunun yerine, yaklaşık 3.000 bp olan ksilen-siyanole ile tamamlanan yükleme tamponu kullanılması önerilir.
    21. Kromatin boyutu kabul edilebilirse, donmuş kromatin örneklerini adım 2.1'den seyreltin. 3 hacimli seyreltme tamponunda (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, %1 Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) ve numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca dönme yoluyla karıştırın.
      NOT: Bu adım, kromatin konsantrasyonunun ölçümü de dahil olmak üzere aşağı akış reaksiyonlarına müdahaleyi önlemek için nükleer lizis tamponunda bulunan SDS'yi seyreltmek için gereklidir.
    22. Bir spektrofotometre kullanarak kromatin örneklerinin DNA konsantrasyonunu 260/280 nm olarak ölçün.
  3. Boncukların hazırlanması, ön temizleme ve immün önkupitasyon
    1. Ön temizleme ve immün önkupitasyon adımları için boncuklar (koyun anti-tavşan veya fare IgG) hazırlayın. Boncukları RIPA tamponu ile 4 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 Na-DOC, %0.1 SDS, 150 mM NaCl ve 1X PIC).
    2. Boncukları, 2.3.1 adımındakiyle aynı RIPA arabelleği hacminde yeniden diriltme.
    3. Her numunenin 25-30 μg kromatinini 4 °C'de 1-2 saat boyunca dönme yoluyla boncukların 4 μL'si ile önceden temizleyin.
      NOT: Numunelerin dönme sırasında düzgün bir şekilde karışmasını sağlamak için her kromatin örneğine 500 μL'ye kadar son hacme ripa tamponu ekleyin. Her örnek setinde NAC (Antikor Kontrolü Yok) ve TIC (Toplam Giriş Kontrolü) için kromatin almayı unutmayın. TİC'ler yalnızca 200 μL'ye kadar son bir hacim gerektirir.
    4. Boncukları bir mıknatısla çökeltin ve süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. Her kromatin örneğine (NAC ve TIC hariç) uygun miktarda antikor ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de döndürün.
    6. Ertesi gün, her numuneye (TIC hariç) 40 μL yıkanmış boncuk ekleyin ve 4 °C'de dönerek gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Yıkama
    1. 4 °C'de dönme yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL Düşük Tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 SDS, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    2. 4 °C'de dönüş yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL Yüksek Tuz tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, %1 Triton X-100, %0.1 SDS, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    3. 4 °C'de dönme yoluyla 10 dakika boyunca 300 μL LiCl tamponu (250 mM LiCl, %1 NP-40, %1 Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) ile bir kez yıkayın.
    4. 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) ile iki kez, 4 °C'de ilk yıkama için 10 dakika, ikinci yıkama için 25 °C'de yıkayın.
  5. İfade
    1. Boncuklara 200 μL elution tamponu (%1 SDS ve 100 mM NaHCO3)ekleyin ve 65 °C'de bir termo-çalkalayıcıda 15 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın (yaklaşık 400 RPM). Süpernatant yeni bir tüpe aktarın ve 200 μL Elution tamponunda tekrar elute boncukları. Eluatları birleştirin (400 μL son hacim).
    2. Her numunede 200 mM'lik son konsantrasyona NaCl ekleyin. TIC örneklerini 200 μL Elution tamponu ile tamamlar ve NaCl'i de ekleyin.
      NOT: Bu adımdan itibaren, TIC diğer örneklerle aynı koşullar altında ele alınmalıdır.
    3. Numuneleri 65 °C'de (titremeden) en az 6 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Her numuneye 1 mL soğuk %100 etanol ekleyin, karıştırmak için tüpleri iki kez döndürün ve DNA'yı bir gecede −80 °C'de çökelti edin.
    5. Ertesi gün, 4 °C'de 13.000 x g'da 30 dakika santrifüj.
    6. Süpernatant atın ve peletin% 70 EtOH ile yıkayın.
    7. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatant atın ve peletleri havayla kurutun.
    9. Peletleri 100 μL TE'de yeniden dirildirin ve her numuneye 0,5 mg/mL RNase A ekleyin. RNase'yi etkinleştirmek için 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Çapraz bağlamanın tersine çevrilmesi
    1. 500 μg/mL Proteinaz K ve %0,5 SDS ekleyin, ardından numuneleri 50 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: ChIP-seq'e devam ediyorsanız, aşağı akış NGS işlemini engellediği için fenol-kloroform ekstraksiyonunu önleyin. Bunun yerine, piyasada bulunan bir kit kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Her numuneye 0,5 hacim fenol ve 0,5 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    3. 1 dakika boyunca girdap.
    4. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    5. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Her numuneye 1 hacim kloroform-izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin.
    7. 1 dakika boyunca girdap.
    8. 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj.
    9. Üst sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. DNA ekstraksiyonu
    1. 2,5 cilt %96 etanol ve 0,1 hacim 3 M Na-Asetat pH 5,2 ekleyin.
    2. −80 °C'de en az 20 dakika kuluçkaya yatır.
    3. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    4. Etanol çıkarın ve peletin% 70 etanol 400 μL ile yıkayın.
    5. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
    6. Etanol çıkarın ve peletin havasını kurutun.
    7. Peletin 50 μL TE'de yeniden süzülür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerde bölgeye yönelik DSB kaynaklı onarım süreçlerinin incelenmesi, stabil veya geçici transeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bununla birlikte, kararlı transfeksiyonunun homojen bir hücre popülasyonu sağladığı ve bunun da birleşik ve dolayısıyla daha güvenilir bir hücresel yanıt verdiği belirtilmelidir. Geçici transfeksiyon durumunda, hücre popülasyonunun sadece küçük bir kısmı plazmid alır ve korur, bu da deneye çeşitlilik sağlar. ER-I-PpoI veya ER-AsiSI endonucleaz tabanlı hücre sistemlerinin kurulması, endononikle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA onarımı nispeten yeni bir araştırma alanı olmasına rağmen, çeşitli biyokimyasal ve mikroskobik yöntemlerin yardımıyla bilgimiz hızla genişlemektedir. Onarım süreçlerinde yer alan genlerde meydana gelen mutasyonlar tümöregenezin önde gelen nedenleri arasında yer aldığından ve bu nedenle DNA onarım yollarının temel adımlarını aydınlatmak gerekli olduğundan, genetik bilgilerin korunması hücreler için çok önemlidir.

Biyokimyasal teknikler (örneğin, batı lekesi, immüno-prekipitasyon, kütle spek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi hibe GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, Macar Bilimler Akademisi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO kısa süreli bursu 8513 ve Tempus Vakfı'nın János Bolyai Araştırma Bursu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgarozLonza50004
Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (100 kez;), StabilizeSigma AldrichA5955
Anti-gama H2A. X (fosfo S139) antikoruAbcamab26350
Sığır Serumu Fraksiyonu V albüminBioseraPM-T1725
TrackIt & trade; Camgöbeği / Sarı Yükleme TamponuThermo Fisher Scientific10482035
DMEM, 1.0 g / L Glikozlu, L-GlutaminLonza12-707F
DoksisiklinSigma AldrichD9891
Dynabeads ve ticaret; M-280 Koyun Anti-Fare IgGInvitrogen11202D
Dynabeads & Trade; M-280 Koyun Anti-Tavşan IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
Etanol Molar Kimyasalları02910-101-340
Fetal Sığır Serumu (Güney Amerika Menşeli), AB onaylıGibcoECS0180L
Formaldehit %37 asitiçermeyen çözeltiSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX ve ticaret; Ek ThermoFisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kiti v2DiagenodeC03010015
İzoamil alkolSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Streptomyces carzinostaticus'tan neokarzinostatinSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
Ca2 +, Mg2 +Sigma AldrichL182-50-BC
FenolSigma AldrichP4557
BORULARSigma AldrichP1851
Polisorbat 20 (Tween 20)Molar Kimyasallar09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong ve ticaret; DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti IRoche11873580001
Proteinaz KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antikoruAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Asetat-EDTA tamponuSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Kimyasallar09370-006-340
Domuz pankreasından tripsinSigma AldrichT4799
Tripsin-EDTA (% 0.5), fenol kırmızısıGibco15400054
içermeyen PBS Tozu içermez

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460(2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles